一种天然哺乳动物尿酸酶制备方法
【专利摘要】一种天然哺乳动物尿酸酶制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)预处理：将新鲜哺乳动物肝脏均质破碎后，用pH值介于7.2-8.8之间的缓冲液洗涤，洗涤沉淀用pH值介于9.7-10.5之间的缓冲液溶解，得尿酸酶初提液；(2)粗纯化：将上述初提液进行硫酸铵分级沉淀及溶解，复溶液进行阴离子交换层析纯化，得尿酸酶粗纯品溶液；(3)精纯化：将上述尿酸酶粗纯品溶液进行亲和层析纯化，得纯度高于97.0％的尿酸酶纯品溶液。该制备方法未包含尿酸酶失活变性步骤、制备周期短、收率高，所得产品酶比活性高、纯度高，可用于天然或重组哺乳动物尿酸酶结构功能、理化性质及免疫原性研究。
【专利说明】一种天然晡乳动物尿酸酶制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种天然哺乳动物尿酸酶制备方法，属生物工程和酶制剂【技术领域】。
【背景技术】
[0002]尿酸酶(EC1.7.3.3.，Uricase)是嘌呤代谢过程中存在的一种氧化酶，在氧气存在的情况下它能催化尿酸生成过氧化氢和5-羟基异尿酸，后者在水中会自发转化为尿囊素并放出二氧化碳。尿酸酶蛋白广泛存在于微生物(芽孢杆菌、曲霉菌)(Bayol A，Capdevielle J, Malazzi P,et al.Biotechnol Appl Biochem.2002.36(Ptl):21_31.)、植物(豆类植物)(Lucas K, Boland MJ, Schubert KR.Arch Biochem Biophys.1983.226 (I):190-197.)及动物(哺乳动物、两栖动物)(Varela-Echavarria A,Montes de Oca-Luna R,Barrera-Saldana HA.FASEB J.1988.2(15):3092-3096.)中。晶体衍射结果表明活性尿酸酶是由四个结构相同的尿酸酶单体非共价缔合而成的同源四聚体:首先两个单体蛋白彼此头尾相连形成环状二聚体；之后两个环状二聚体上下重叠形成四聚体(Gabison L，ChiadmiM,El Hajji M,et al.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2010.66(Pt6):714-724.)。在多种哺乳动物(小鼠、大鼠、猪、犬、羊或兔)肝脏中发现了活性尿酸酶蛋白。尿酸酶以天然结晶的形式存在于哺乳动物肝脏过氧化物酶体中，是过氧化物酶体拟核的主要组成部分；尿酸酶蛋白在核糖体内翻译后，需经复杂的定向转运过程进入过氧化物酶体(GoldmanBM, Blobel G.Proc Natl Acad Sci USA.1978.75(10):5066-5070.)，并在此过程中逐渐聚集结晶，起到降解尿酸和支撑拟核骨架的双重作用(Antonenkov VD,Grunau S,OhlmeierS, et al.Antioxid Redox Signal.2010.13 (4):525-537.),但该形式尿酸酶翻译后转运和聚集机制及其他生物学功能至今未知。
[0003]高尿酸血症是人体内嘌呤代谢紊乱导致的代谢类疾病，而痛风则是由慢性高尿酸血症进一步发展而形成的因`尿酸结晶沉积到肾脏、关节和软组织导致的慢性疾病(ChoiHK, Mount DB, Reginato AM.Ann Intern Med.2005.143 (7):499-516.)。本质上，高尿酸血症是人在进化过程中由于尿酸酶基因突变失活而引起的，突变在人尿酸酶基因编码序列中引入提前终止密码子，人类因此而不能自身合成活性尿酸酶，从而导致嘌呤分解代谢终止于尿酸(Christen P, Peacock WC, Christen AE, et al.EurJ Biochem.1970.12(1):3-5.)。其他哺乳动物体内均存在活性尿酸酶，它可将溶解性低的尿酸盐转变为易溶的尿囊素(Shnitka TK.J Ultrastruct Res.1966.16(5):598-625.)，由肾脏更有效的排泄。目前国内无任何尿酸酶类药物上市，国际上已上市的尿酸酶类药物有1975年法国批准上市的天然提取 Aspergillus fIavus 来源尿酸酶(Uricozyme) (Patte C, SakirogluC，Ansoborlo S，et al.Ann Oncol.2002.13 (5):789-795.) ,2002 年 FDA 批准上市的重组 Aspergillus fIavus 来源尿酸酶(Rasburicase) (Cammalleri L, MalaguameraM.1nt J Med Sc1.2007.4(2):83-93.)和 2010 年 FDA 批准上市的 PEG 修饰重组猪源尿酸酶(Pegloticase)(Schlesinger N, Yasothan U, Kirkpatrick P.Nat Rev DrugDiscov.2011.10(1):17-18.)。Uricozyme 和 Rasburicase 仅可用于肿瘤化疗引起的急性高尿酸血症的短期治疗，其疗效较别嘌呤醇显著(Goldman SC, Holcenberg JS, FinklesteinJZ, et al.Blood.2001.97(10):2998-3003.)，然而，由于微生物来源尿酸酶与推测出的人尿酸酶的同源性低于40%，多次给药后病人体内极易产生抗体(Pui CH, Mahmoud HH,Wiley JM, et al.J Clin Oncol.2001.19(3):697-704.)，无法用于慢性痛风的长期治疗。Pegloticase未修饰蛋白基因来源于猪，因其与人尿酸酶的同源性高于90%,免疫原性低，经PEG长效化修饰后，可用于慢性高尿酸血症和痛风的长期治疗，具有快速消融痛风石的独特功效。
[0004]提取制备高纯度哺乳动物尿酸酶蛋白，对其进行结构确认、酶比活性及免疫原性分析，不仅可用于哺乳动物尿酸酶翻译后转运和聚集机制及其他生物学功能研究，还可作为参考品进行哺乳动物尿酸酶类药物临床前药学性质研究。然而，目前尚无商业化高纯度活性哺乳动物尿酸酶蛋白出售，且未见文献公开天然哺乳动物尿酸酶蛋白提取及纯化方法。目前可获及的哺乳动物尿酸酶相关文献主要侧重于基因工程重组尿酸酶研究，均未涉及天然哺乳动物尿酸酶提取及制备方法。另一方面，Liu等人(Liu J, Li G, Liu H, ZhouX.Appl Biochem Biotechnol.1994.47 (I):57-63.)和 Rainbird等人(Rainbird RM, AtkinsCA.Biochim Biophys Acta.1981.659 (I):132-140.)分别公开了假丝酵母和βΧ?根瘤尿酸酶提取纯化方法，但鉴于哺乳动物肝脏组织与微生物和植物根瘤构造的差异性，上述研究资料均无法直接用于高纯度哺乳动物尿酸酶制备。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种高纯度天然哺乳动物尿酸酶制备方法。该方法未包含尿酸酶失活变性步骤、制备周期短、收率高，所得产品酶比活性高、纯度高，可作为生化标准品，用于天然或重组哺乳动物尿酸酶结构功能、理化性质及免疫原性研究。
[0006]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种天然哺乳动物尿酸酶制备方法，所述方法包括如下步骤:
[0007]I)预处理:将新鲜哺乳动物`肝脏均质破碎后，用pH值介于7.2-8.8之间的缓冲液洗涤，洗涤沉淀用pH值介于9.7-10.5之间的缓冲液溶解，得尿酸酶初提液；
[0008]2)粗纯化:将上述初提液进行硫酸铵分级沉淀，复溶缓冲液溶解，复溶液进行阴离子交换层析纯化，得尿酸酶粗纯品溶液；
[0009]3)精纯化:将上述尿酸酶粗纯品溶液进行亲和层析纯化，得纯度高于97.0%的尿酸酶纯品溶液。
[0010]作为优选，上述步骤I)预处理所述的哺乳动物为小鼠、大鼠、猪、犬、羊或兔。上述动物均为实验研究常用的哺乳动物，本发明人经过逐个试验，发现上述方法均可用于高纯度小鼠、大鼠、猪、犬、羊或兔等哺乳动物尿酸酶制备。
[0011]作为优选，上述步骤I)预处理所述洗涤缓冲液包括磷酸盐缓冲液和三羟甲基氨酸甲烷-盐酸缓冲液；洗涤缓冲液浓度介于IOmM-0.2M之间；洗涤缓冲液与动物肝脏的混合比例介于5: 1-20: I之间(体积质量比，mL: g)。经研究，硼酸盐缓冲液在pH8.0以下时，缓冲能力较弱，而磷酸盐缓冲液和三羟甲基氨酸甲烷-盐酸缓冲液在浓度介于IOmM-0.2M之间时，在pH7.2-8.8范围内均可保持良好的缓冲能力。
[0012]优选的，洗涤缓冲液与动物肝脏的混合比例介于5: 1-20: I之间(体积质量比，mL: g)。
[0013]作为优选，上述步骤I)预处理所述溶解缓冲液为碳酸盐缓冲液；溶解缓冲液浓度介于50mM-0.2M之间；溶解缓冲液与动物肝脏洗涤后沉淀的混合比例介于50: 1-200: I之间(体积质量比，mL: g)。本发明人经溶解pH筛选发现，当pH值低于9.6时，因靠近其等电点，无法充分溶解混于肝脏碎片中的尿酸酶蛋白；pH值高于10.8时，虽可使尿酸酶蛋白充分溶解，但酶活测定结果显示，此时尿酸酶蛋白已变性失活。活性尿酸酶蛋白为非共价作用缔合而成的同源四聚体蛋白，该结构对PH和变性剂均高度敏感；pH高于10.8时，活性四聚体尿酸酶蛋白将被不可逆的解聚为单体蛋白，导致其变性失活。为保持尿酸酶活性并进一步提高其溶解度，本发明确定的较优的尿酸酶蛋白溶解PH值介于9.7-10.5之间。在此pH范围内具有良好缓冲能力的缓冲液包括碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和硼砂-氢氧化钠缓冲液等。经研究，单位体积下，PH值介于9.7-10.5之间的碳酸盐缓冲液可溶解的活性尿酸酶蛋白量远高于其他类型缓冲液；更进一步的研究表明，50mM以下时碳酸盐缓冲能力较弱，且因离子强度低，活性尿酸酶溶解度较低；0.2M以上时因离子强度过高，存在部分盐析特性，导致活性尿酸酶溶解度降低；50mM-0.2M的碳酸盐溶解哺乳动物尿酸酶能力最强。鉴于哺乳动物尿酸酶溶解度较低，溶解缓冲液所需体积远大于洗涤缓冲液体积，更具体的，溶解缓冲液与动物肝脏洗涤后沉淀的混合比例介于50: 1-200: I之间(体积质量比，mL: g)。
[0014]作为优选，上述步骤2)粗纯化所述沉淀尿酸酶蛋白的硫酸铵饱和度介于
5.0% -15.0%之间；尿酸酶蛋白复溶缓冲液与预处理所述溶解缓冲液相同；复溶缓冲液体积为尿酸酶初提液体积的20% -50%。硫酸铵分级沉淀是常用的浓缩、纯化粗提蛋白的方法。哺乳动物尿酸酶蛋白35%以上的氨基酸为疏水性氨基酸(Colloc’h N, Poupon A,MomonJP.Proteins.2000.39(2):142-54.)，利用该特性并结合硫酸铵分级沉淀，可去除大部分疏水性低的蛋白杂质，并进一步浓缩尿酸酶蛋白。鉴于哺乳动物尿酸酶蛋白较强的疏水性，硫酸铵饱和度介于5.0% -15.0%之间时，可使97.0%以上的活性尿酸酶蛋白沉淀。利用与尿酸酶初溶一致的缓冲液即可充分溶解被硫酸铵沉淀的活性尿酸酶蛋白；同时，因此时杂质蛋白含量降低，仅需尿酸酶初提液体积的20% -50%即可使90.0%以上的活性尿酸酶蛋白重新溶解(与尿酸酶初提液相比)。
[0015]作为优选，上述步骤2)粗纯化所述阴离子交换层析纯化介质为偶联二乙基(2-羟丙基)氨基乙基(QAE)或二乙氨基乙基(DEAE)基团的琼脂糖系列离子交换介质。偶联二乙基(2-羟丙基)氨基乙基，即QAE。二乙氨基乙基，即DEAE。具体的，DEAE Sepharose FastFlow和QAE Sepharose Fast Flow填料,可较好的用于哺乳动物尿酸酶蛋白离子交换层析纯化。
[0016]作为优选，上述步骤2)粗纯化所述阴离子交换层析纯化包含下述步骤:待阴离子交换层析柱用复溶缓冲液平衡后，将硫酸铵沉淀复溶样品进行上样，复溶缓冲液复平衡后，用含0.1M-0.3M氯化钠的复溶缓冲液洗脱，收集洗脱样品。
[0017]作为优选，上述步骤3)精纯化所述亲和层析纯化包含下述步骤:待黄嘌呤亲和层析柱用复溶缓冲液平衡后，将尿酸酶粗纯品样品进行上样，复溶缓冲液复平衡后，用含0.05mM-0.2mM黄嘌呤的复溶缓冲液洗脱，收集洗脱样品。
[0018]作为优选，上述步骤3)精纯化所述尿酸酶精纯品，其纯度测定方法为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和反相-高效液相色谱(RP-HPLC)测定。更具体的，常规15.0 %等梯度还原SDS-PAGE即可准确测定尿酸酶蛋白电泳纯度，电泳所需分离胶、浓缩胶、电泳缓冲液、样品缓冲液、染色液和脱色液等均与《中华人民共和国药典》2010年版三部附录IV C “SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法” 一致，电泳所用Marker即为常规中分子量Marker。常规全梯度RP-HPLC即可准确测定尿酸酶蛋白液相纯度，更具体的，RP-HPLC所用分析柱为C4、CS或C18反相分析型色谱柱；分析所用A、B液分别为添加了 0.1%三氟乙酸的DDW和乙腈；洗脱梯度为0-30min，B从5-95% ;检测波长为214nm。
[0019]本发明创造性的开发了从哺乳动物肝脏提取高纯度尿酸酶方法，操作步骤简单、未包含尿酸酶失活变性步骤、制备周期短、收率高，所得产品酶比活性保留率高、SDS-PAGE纯度和RP-HPLC纯度均高于97.0 %，不仅可用于哺乳动物尿酸酶翻译后转运和聚集机制及其他生物学功能研究，还可作为参考品进行哺乳动物尿酸酶类药物临床前药学性质研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]附图1:精纯 化后哺乳动物尿酸酶蛋白SDS-PAGE电泳图谱(从左起，条带1:小鼠尿酸酶蛋白；条带2:大鼠尿酸酶蛋白；M:中分子量蛋白marker ;条带3:猪尿酸酶蛋白；条带4:犬尿酸酶蛋白；条带5:羊尿酸酶蛋白；条带6:兔尿酸酶蛋白。)
[0021]附图2:精纯化后犬尿酸酶蛋白RP-HPLC图谱
【具体实施方式】
[0022]以下对本发明的特点进行描述，所举实施例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。
[0023]实施例1.高纯度天然小鼠尿酸酶蛋白制备
[0024](I)称取新鲜小鼠肝脏10g，用均质机均质后，将其与150mL洗涤缓冲液(25mM三羟甲基氨酸甲烷-盐酸缓冲液，PH7.8)混合，室温搅拌1.5-3h后离心，离心沉淀用上述洗涤缓冲液反复洗涤2-4次；
[0025](2)将肝脏洗涤后沉淀与750mL溶解缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗΙΟ.2)混合，室温搅拌过夜后离心，离心后上清即为尿酸酶初提液；
[0026](3)在750mL尿酸酶初提液中补入75mL饱和硫酸铵溶液，静止过夜后离心，沉淀用250mL复溶缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗΙΟ.2)复溶过夜，离心后上清进行阴离子层析纯化；
[0027](4)取QAE Sepharose Fast Flow填料,装入层析柱,用再生液(2M NaCl)冲洗5个柱体积后，用复溶缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗΙΟ.2)平衡，将硫酸铵沉淀复溶样品上样，用复溶缓冲液复平衡，检测A28tol,穿透峰弃去，待A28tlnm下至基线后，用含0.2M NaCl的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得尿酸酶粗纯品溶液；
[0028](5)取黄嘌呤亲和填料，装入层析柱，用含0.15mM黄嘌呤的复溶缓冲液冲洗5个柱体积后，用平衡液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗΙΟ.2)平衡，将尿酸酶粗纯品溶液上样，检测A28tol,穿透峰弃去，待A28tlnm下至基线后，用含0.15mM黄嘌呤的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得小鼠尿酸酶纯品溶液。
[0029]实施例2.高纯度天然大鼠尿酸酶蛋白制备[0030](I)称取新鲜大鼠肝脏20g，用均质机均质后，将其与300mL洗涤缓冲液(25mM三羟甲基氨酸甲烷-盐酸缓冲液，PH7.8)混合，室温搅拌1.5-3h后离心，离心沉淀用上述洗涤缓冲液反复洗涤2-4次；
[0031](2)将肝脏洗涤后沉淀与1.5L溶解缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗ10.2)混合，室温搅拌过夜后离心，离心后上清即为尿酸酶初提液；
[0032](3)在1.5L尿酸酶初提液中补入150mL饱和硫酸铵溶液，静止过夜后离心，沉淀用500mL复溶缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗ10.2)复溶过夜，离心后上清进行阴离子层析纯化；
[0033](4)取QAE Sepharose Fast Flow填料,装入层析柱,用再生液(2M NaCl)冲洗5个柱体积后，用复溶缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗ10.2)平衡，将硫酸铵沉淀复溶样品上样，用复溶缓冲液复平衡，检测A28tol,穿透峰弃去，待A28tlnm下至基线后，用含0.2M NaCl的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得尿酸酶粗纯品溶液；
[0034](5)取黄嘌呤亲和填料，装入层析柱，用含0.15mM黄嘌呤的复溶缓冲液冲洗5个柱体积后，用平衡液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗ10.2)平衡，将尿酸酶粗纯品溶液上样，检测A28tlnm,穿透峰弃去，待A28tlnm下至基线后，用含0.15mM黄嘌呤的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得大鼠尿酸酶纯品溶液。
[0035]实施例3.高纯度天然猪尿酸酶蛋白制备
[0036](I)称取新鲜猪肝脏100g，用均质机均质后，将其与1.5L洗涤缓冲液(20mM磷酸盐缓冲，PH8.2)混合，室温搅拌1.5-3h后离心，离心沉淀用上述洗涤缓冲液反复洗涤2-4次；
[0037](2)将肝脏洗涤后沉淀与7.5L溶解缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗ10.2)混合，室温搅拌过夜后离心，离心后上清即为尿酸酶初提液；
[0038](3)在7.5L尿酸酶初提液中补入750mL饱和硫酸铵溶液，静止过夜后离心，沉淀用2.5L复溶缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗ10.2)复溶过夜，离心后上清进行阴离子层析纯化；
[0039](4)取QAE Sepharose Fast Flow填料,装入层析柱,用再生液(2M NaCl)冲洗5个柱体积后，用复溶缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗ10.2)平衡，将硫酸铵沉淀复溶样品上样，用复溶缓冲液复平衡，检测A28tol,穿透峰弃去，待A28tlnm下至基线后，用含0.2M NaCl的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得尿酸酶粗纯品溶液；
[0040](5)取黄嘌呤亲和填料，装入层析柱，用含60 μ M黄嘌呤的复溶缓冲液冲洗5个柱体积后，用平衡液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗ10.2)平衡，将尿酸酶粗纯品溶液上样，检测A28tol,穿透峰弃去，待A28tol下至基线后，用含90 μ M黄嘌呤的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得猪尿酸酶纯品溶液。
[0041]实施例4.高纯度天然犬尿酸酶蛋白制备
[0042](I)称取新鲜犬肝脏100g，用均质机均质后，将其与1.5L洗涤缓冲液(20mM磷酸盐缓冲，PH8.0)混合，室温搅拌1.5-3h后离心，离心沉淀用上述洗涤缓冲液反复洗涤2-4次；
[0043](2)将肝脏洗涤后沉淀与7.5L溶解缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗ10.2)混合，室温搅拌过夜后离心，离心后上清即为尿酸酶初提液；
[0044](3)在7.5L尿酸酶初提液中补入750mL饱和硫酸铵溶液，静止过夜后离心，沉淀用2.5L复溶缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗΙΟ.2)复溶过夜，离心后上清进行阴离子层析纯化；
[0045](4)取DEAE Sepharose Fast Flow填料,装入层析柱,用再生液(2M NaCl)冲洗5个柱体积后，用复溶缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗΙΟ.2)平衡，将硫酸铵沉淀复溶样品上样，用复溶缓冲液复平衡，检测A28tlnm，穿透峰弃去，待A28tol下至基线后，用含0.15M NaCl的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得尿酸酶粗纯品溶液；
[0046](5)取黄嘌呤亲和填料，装入层析柱，用含60 μ M黄嘌呤的复溶缓冲液冲洗5个柱体积后，用平衡液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗΙΟ.2)平衡，将尿酸酶粗纯品溶液上样，检测A28tol,穿透峰弃去，待A28tol下至基线后，用含90 μ M黄嘌呤的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得犬尿酸酶纯品溶液。
[0047]实施例5.高纯度天然羊尿酸酶蛋白制备
[0048](I)称取新鲜羊肝脏100g，用均质机均质后，将其与0.5L洗涤缓冲液(IOmM磷酸盐缓冲，PH7.2)混合，室温搅拌1.5-3h后离心，离心沉淀用上述洗涤缓冲液反复洗涤2-4次；
[0049](2)将肝脏洗涤后沉淀与5.0L溶解缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗΙΟ.5)混合，室温搅拌过夜后离心，离心后上清即为尿酸酶初提液；
[0050](3)在5.0L尿酸酶初提液中补入250mL饱和硫酸铵溶液，静止过夜后离心，沉淀用2.5L复溶缓冲液(50m M碳酸盐缓冲，ρΗΙΟ.5)复溶过夜，离心后上清进行阴离子层析纯化；
[0051](4)取DEAE Sepharose Fast Flow填料,装入层析柱,用再生液(2M NaCl)冲洗5个柱体积后，用复溶缓冲液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗ10.5)平衡，将硫酸铵沉淀复溶样品上样，用复溶缓冲液复平衡，检测A28tol,穿透峰弃去，待A28tlnm下至基线后，用含0.3M NaCl的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得尿酸酶粗纯品溶液；
[0052](5)取黄嘌呤亲和填料，装入层析柱，用含60 μ M黄嘌呤的复溶缓冲液冲洗5个柱体积后，用平衡液(50mM碳酸盐缓冲，ρΗ10.5)平衡，将尿酸酶粗纯品溶液上样，检测A28tol,穿透峰弃去，待A28tol下至基线后，用含50 μ M黄嘌呤的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得羊尿酸酶纯品溶液。
[0053]实施例6.高纯度天然兔尿酸酶蛋白制备
[0054](I)称取新鲜犬肝脏50g，用均质机均质后，将其与1.0L洗涤缓冲液(0.2M磷酸盐缓冲，PH8.8)混合，室温搅拌1.5-3h后离心，离心沉淀用上述洗涤缓冲液反复洗涤2-4次；
[0055](2)将肝脏洗涤后沉淀与10.0L溶解缓冲液(0.2M碳酸盐缓冲，pH9.7)混合，室温搅拌过夜后离心，离心后上清即为尿酸酶初提液；
[0056](3)在10.0L尿酸酶初提液中补入1.5L饱和硫酸铵溶液，静止过夜后离心，沉淀用
2.0L复溶缓冲液(0.2M碳酸盐缓冲，pH9.7)复溶过夜，离心后上清进行阴离子层析纯化；
[0057](4)取DEAE Sepharose Fast Flow填料,装入层析柱,用再生液(2M NaCl)冲洗5个柱体积后，用复溶缓冲液(0.2M碳酸盐缓冲，pH9.7)平衡，将硫酸铵沉淀复溶样品上样，用复溶缓冲液复平衡，检测A28tol,穿透峰弃去，待A28tlnm下至基线后，用含0.1M NaCl的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得尿酸酶粗纯品溶液；
[0058](5)取黄嘌呤亲和填料，装入层析柱，用含60 μ M黄嘌呤的复溶缓冲液冲洗5个柱体积后，用平衡液(0.2Μ碳酸盐缓冲，ρΗ9.7)平衡，将尿酸酶粗纯品溶液上样，检测A28tol，穿透峰弃去，待A28tol下至基线后，用含200 μ M黄嘌呤的复溶缓冲液洗脱，收集含有尿酸酶蛋白的洗脱峰，即得兔尿酸酶纯品溶液。
[0059]实施例7.尿酸酶蛋白SDS-PAGE纯度测定
[0060](1)15%的分离胶配置
[0061]双蒸水:3.3mL ；1.5M Tris-HCl (ρΗ8.8):2.5mL ；10% SDS:100 μ L ;30%丙烯酰胺单体贮液:4.0mL ；TEMED:4μ L ；10%过硫酸铵:100 μ L ;总体积:IOmL0混匀后加入电泳槽的玻璃板夹缝中，并在胶面上加入约Icm双蒸水，待胶自然凝聚后，除净双蒸水，并在夹缝中放入梳子。
[0062](2) 5 %的浓缩胶配置
[0063]双蒸水:3.4mL ；1M Tris-HCl (ρΗ6.8):0.63mL ；10% SDS:50 μ L ;30%丙烯酰胺单体贮液:0.83mL ；TEMED.5 μ L ;10%过硫酸铵:150 μ L ;总体积:5mL。混匀后，加入夹缝中并没过梳孔，待凝聚后小心拔出梳子，用电泳缓冲液冲洗加样孔，清除未凝聚的丙稀酰胺。
[0064](3)溶液配置
[0065]①电泳缓冲液(IOX):称取Tris3.0g，甘氨酸14.4g，SDSl.0g，加适量的超纯水溶解，用HCl调pH至8.3，加超纯 水定容至1000mL。
[0066]②供试品缓冲液(4X):称取Tris0.303g、溴酚蓝2mg、SDS0.8g，量取盐酸
0.189mL、甘油4mL，加水溶解并稀释至10mL，使用前按体积比加入终浓度5%的β -巯基乙
醇，即得。
[0067]③考马斯亮蓝染色液称取考马斯亮蓝R2501g，加入甲醇200mL、冰醋酸50mL、水250mL混匀，即得。
[0068]④考马斯亮蓝脱色液取甲醇400mL、冰醋酸IOOmL与水500mL混匀，即得。
[0069](4)样品制备
[0070]将小鼠、大鼠、猪、犬、羊和兔尿酸酶纯品样品分别与4X凝胶样品缓冲液3: I混匀，在100°C沸水中保温4-5min，取出待用。
[0071](5)样品测定
[0072]将样品及标准蛋白加入点样孔后，接通电源，恒压电泳至溴酚蓝到离底部约0.5cm时，停止电泳。将分离胶从玻璃板上取下，在染色液中染色l_2h，脱色8h，换保存液保存。
[0073]如附图1所示，小鼠、大鼠、猪、犬、羊和兔尿酸酶纯品电泳条带均位于33.0kDa标准条带附近，未见明显杂质条带，SDS-PAGE纯度均高于97.0%。
[0074]实施例8.尿酸酶蛋白RP-HPLC纯度测定
[0075]仪器:AglientllOOHPLC;色谱柱:Waters symmetry300TM(C4 5 μ m
4.6 X 250mm);流动相:A液为0.1 %三氟乙酸+水溶液；B液为0.1 %三氟乙酸+乙腈溶液；流速:1.0mL/min ;洗脱方式:0_30min，B从5-95%;检测波长:214nn。取10 μ L犬尿酸酶纯品样品，按上述条件进行全梯度RP-HPLC纯度测定。
[0076]如附图2所示，犬尿酸酶纯品RP-HPLC图谱未见明显杂质条带，主峰RP-HPLC纯度高于97.0%。
[0077]实施例9.尿酸酶蛋白酶比活性测定
[0078](I)单位体积酶活测定
[0079]尿酸标准曲线:称取0.0840g尿酸于500ml容量瓶中，用0.1M四硼酸纳(pH8.6)溶解至刻度，即为500 μ M尿酸，并依次稀释至120、100、60、40、20、10 μ Μ，在波长293nm处测
定吸光度，确定尿酸浓度线性范围，绘制尿酸溶液浓度与吸光值标准曲线。
[0080]酶活检测方法:由于尿酸在293nm处有特征吸收峰，产物在此波长范围内无吸收峰，而不同的尿酸浓度对应不同的吸光值，并且呈线性变化。随着尿酸被尿酸酶降解，定时检测293nm处吸光度的减少量以进行酶活换算。在比色杯中加入3mL37°C预热的IOOyM尿酸溶液，再加入10 μ I适度稀释的犬尿酸酶纯品溶液并混匀，定时测定293nm处吸光度变化；测定时间3min(30S监控一次)；根据标准曲线计算尿酸降解量，计算单位体积酶比活性。
[0081]I单位⑶酶活定义为，在37°C、pH8.6缓冲液条件下，每分钟转化I μ mo I尿酸所
需酶的量。
[0082](2)浓度测定(Lowry 法)
[0083]按Lowry法测定犬尿酸酶纯品蛋白浓度。
[0084]①溶液配制
[0085]4%碳酸钠溶液:称取4.0g碳酸钠，用蒸馏水溶解至100mL。
[0086]0.2M氢氧化钠溶液:称取0.8g氢氧化钠，用蒸馏水溶解至100mL。
[0087]0.04M硫酸铜溶液:称取1.0g硫酸铜,用蒸懼水溶解至100mL。
[0088]0.1M酒石酸钾溶液:称取2.0g酒石酸钾，用蒸馏水溶解至100mL。
`[0089]碱性铜溶液:临用前取试剂A和B各35mL，试剂C和D各0.7mL混匀配制而成。
[0090]酚试剂:购自上海生工生物工程有限公司。
[0091]标准蛋白质溶液:取蛋白含量测定国家标准品(批号:200919，含量:13.7mg/支)，用超纯水准确稀释至1.0mg/mL,为标准蛋白质备液。精确量取标准蛋白质备液
0.35mL，用超纯水精确稀释至3.5mL，作为标准蛋白质溶液(100 μ g/mL)。
[0092]②实验方法
[0093]标准曲线:精确量取标准蛋白质溶液(100 μ g/mL) OmL,0.2mL、0.4mL、0.6mL、
0.8mL、l.0mL,分别置于试管中,用蒸懼水补至1.0mL,并加入5.0mL碱性铜溶液,混匀,室温放置10分钟，迅速加入0.5mL酚试剂，混匀，室温放置30分钟后检测650nm波长吸光值，并根据蛋白浓度和吸光值绘制标准曲线；
[0094]将犬尿酸酶纯品用DDW适当稀释，操作同上，检测样品650nm波长吸光值，带入标准曲线，计算相应蛋白浓度。
[0095]按上述方法测定，犬尿酸酶纯品溶液酶比活性为18.5U/mg，表明本方法制备哺乳动物尿酸酶具有较好的酶比活性。
【权利要求】
1.一种天然哺乳动物尿酸酶制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 1)预处理:将新鲜哺乳动物肝脏均质破碎后，用PH值介于7.2-8.8之间的缓冲液洗涤，洗涤沉淀用pH值介于9.7-10.5之间的缓冲液溶解，得尿酸酶初提液； 2)粗纯化:将上述初提液进行硫酸铵分级沉淀，复溶缓冲液溶解，复溶液进行阴离子交换层析纯化，得尿酸酶粗纯品溶液； 3)精纯化:将上述尿酸酶粗纯品溶液进行亲和层析纯化，得尿酸酶纯品溶液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述的哺乳动物为小鼠、大鼠、猪、犬、羊或兔。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤I)预处理所述洗涤缓冲液包括磷酸盐缓冲液和三羟甲基氨酸甲烷-盐酸缓冲液；洗涤缓冲液浓度介于IOmM-0.2M之间；以体积质量比mL.g计，洗涤缓冲液与动物肝脏的混合比例介于5: 1-20: I之间。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤I)预处理所述溶解缓冲液为碳酸盐缓冲液；溶解缓冲液浓度介于50mM-0.2M之间；以体积质量比mL:g计，溶解缓冲液与动物肝脏洗涤后沉淀的混合比例介于50: 1-200: I之间。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤2)粗纯化所述沉淀尿酸酶蛋白的硫酸铵饱和度介于5.0% -15.0%之间。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤2)粗纯化所述尿酸酶蛋白复溶缓冲液与预处理所述溶解缓 冲液相同；复溶缓冲液体积为尿酸酶初提液体积的20% -50%。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤2)粗纯化所述阴离子交换层析纯化介质为偶联二乙基(2-羟丙基)氨基乙基或二乙氨基乙基基团的琼脂糖系列离子交换介质。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤2)粗纯化所述阴离子交换层析纯化包含下述步骤:待阴离子交换层析柱用复溶缓冲液平衡后，将硫酸铵沉淀复溶样品进行上样，复溶缓冲液复平衡后，用含0.1M-0.3M氯化钠的复溶缓冲液洗脱，收集洗脱样品。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤3)精纯化所述亲和层析纯化包含下述步骤:待黄嘌呤亲和层析柱用复溶缓冲液平衡后，将尿酸酶粗纯品样品进行上样，复溶缓冲液复平衡后，用含0.05mM-0.2mM黄嘌呤的复溶缓冲液洗脱，收集洗脱样品。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤3)精纯化所述尿酸酶精纯品，其纯度测定方法为常规还原型十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳或全梯度反相-高效液相色谱测定。
【文档编号】C12N9/06GK103756983SQ201410015218
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】张淳, 范开, 冯尚彩, 刘兆明 申请人:临沂大学