专利名称：一种表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法及其专用基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法及其专用基因。
背景技术：
尿酸氧化酶(EC1.7.3.3，Uricase，Urate Oxidase，Uox)是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶，催化尿酸氧化生成尿囊素，尿囊素为一种比较容易排泄的代谢物，其溶解度为尿酸的5～10倍。大多数哺乳动物体内均有内源性Uox，但在高等哺乳动物体内(猿和人类)缺乏这种酶而以尿酸作为终产物随尿排出体外。
在正常人体血循环中99％以上的尿酸以尿酸钠盐(简称尿酸盐)形式存在，血清尿酸盐波动于较窄的范围，据国内资料，男性平均为5.7mg/dl，女性4.3mg/dl。如果血清中尿酸的浓度高于正常值，就导致高尿酸血症。恶性肿瘤的增殖导致核酸分解代谢加强，嘌呤代谢产生大量尿酸，患者出现高尿酸血症。肿瘤化疗过程中细胞大量裂解伴随血清尿酸的急剧升高，病人出现一系列生理生化改变，包括电解质紊乱，肾衰，痉挛，心律不齐，肾结石，临床上称为肿瘤溶解综合征(tumor lysissyndrome，TLS)。
高尿酸血症会引起的痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成。本病可分原发性和继发性两大类，原发性者病因除少数由于酶缺陷引起外，大多未阐明，常伴高脂血症、肥胖、糖尿病、高血压病、动脉硬化和冠心病等，属遗传性疾病。继发性者可由肾脏病、血液病及药物等多种原因引起。有资料显示我国20岁以上的人群，高尿酸血症的发病率为2.4-5.7％，如果不注意饮食控制和治疗，约有10％的会发展成为痛风，推测我国的痛风的发病率为0.5％。
抑制尿酸合成药物至目前为止只有别嘌呤醇(allopurinol)，此药能抑制黄嘌呤氧化酶，使次黄嘌呤及黄嘌呤不能转化为尿酸，阻滞尿酸形成，但会增加肾脏排泄尿酸前体(次黄嘌呤和黄嘌呤)的负荷。与次黄嘌呤不同，黄嘌呤在尿中比尿酸难溶。有时别嘌醇治疗的病人也可出现黄嘌呤肾病和结石。此外，对于病人体内存留的尿酸的排泄，使用别嘌呤醇治疗无效。排尿酸药目前常用的有以下三种丙磺舒、苯磺唑酮和苯溴马龙，副作用包括肠胃道反应、肾绞痛及激发急性关节炎发作等，由于尿酸生成和排出较多易加重肾脏负担而不取。
以上的资料可以看出，如果血清中尿酸的浓度高于正常值，不可避免的会导致关节和肾功能的损伤。伴有肾功能的损伤的高尿酸血症患者，不管是使用抑制尿酸合成的药物别嘌呤醇还是使用排尿酸药丙磺舒、苯磺唑酮和苯溴马龙，它们产生的副作用应该予以考虑。重组黄曲霉Uox为治疗伴有肾功能损伤的高尿酸血症提供了良好选择。
法国Sanofi-Synthelabo公司生产的非重组Uox，由黄曲霉培养液纯化而得，治疗高尿酸血症疗效较别嘌呤醇显著。然而，从黄曲霉中提取的非重组产品发生急性过敏反应(如支气管痉挛，低氧血症)者约为5％，包括以往无过敏史的病人或罹患高铁血红蛋白血症和6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏的溶血性贫血病人。法国Sanofi-Synthelabo公司开发，2001年6月在德国和英国首次上市的拉布立酶(rasburicase)是酿酒酿母表达的重组黄曲霉Uox，可用于治疗和预防具有高危肿瘤溶解综合征的血液恶性肿瘤病人的急性高尿酸血症，尤其适用于化疗引起的高尿酸血症病人。急性发作痛风发作病人给予Uox治疗后，可阻断急性发作并减小痛风石的体积。而以前的化疗药物，不管是抑制尿酸合成还是促进尿酸排泄的降尿酸药物有引起急性痛风性关节炎的嫌疑，一般不用于痛风急性发作的治疗。
国外用酿酒酿母表达的黄曲霉Uox周期长，价格较昂贵。国内有的研究者用原核表达系统表达融合了His标签的重组黄曲霉Uox，尽管可通过蛋白酶去除His标签但其N端为非天然的，残余4个氨基酸残基，同时增加了纯化的成本和工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法及其专用基因。
本发明所提供的黄曲霉尿酸氧化酶基因，名称为rUox，是优化的黄曲霉尿酸氧化酶基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有上述基因的表达载体、工程菌和细胞系也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法，是将上述rUox插入原核细胞表达载体，转化宿主菌，筛选得到表达黄曲霉尿酸氧化酶的工程菌，培养工程菌，表达得到黄曲霉尿酸氧化酶。
所述原核细胞表达载体可为pET-系列载体。
所述rUox插入到pET-系列载体的Nde I和Sac I的酶切位点间，或Nde I和HindIII的酶切位点间。
所述工程菌可为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。
上述方法中，所述表达为诱导表达，所用的诱导剂为IPTG，诱导浓度0.4-1.5mmol/L，优选为1.0mmol/L。
所述工程菌的培养温度为37℃，诱导表达的培养温度为28-37℃，优选为37℃。
上述方法中还包括纯化表达得到的黄曲霉尿酸氧化酶的步骤；所述纯化包括离子交换、疏水层析和凝胶过滤层析。
本发明人工合成优化的全基因序列，采用大肠杆菌表达体系，表达水平高，黄曲霉尿酸氧化酶的含量达到可溶性全菌蛋白的40％，周期短，成本低。本发明表达重组尿酸氧化酶的方法采用非融合表达策略，使表达得到的尿酸氧化酶具有天然的N端序列，不含有GST、6×His和硫氧还蛋白(Trx)等用于增加溶解度、提高表达量或方便纯化的序列，避免N端非天然氨基酸残基可能对活性和免疫原性产生影响，并且简化了纯化工艺。本发明方法表达的重组尿酸氧化酶在常规的缓冲体系中为完全可溶形式，有利于纯化，经过离子交换层系、疏水层析和凝胶过滤层析纯化，可达到99％的纯度，活性测定表明本发明表达的重组黄曲霉rUox的比活性达34IU/mg酶蛋白。
图1为表达质粒pET-rUox的PCR和酶切鉴定图谱图2为表达蛋白-尿酸氧化酶的SDS-PAGE分析图3为Phenyl-Sepharose FF层析纯化后的尿酸氧化酶的SDS-PAGE分析图4为Phenyl-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF和Phenyl-Sepharose FF层析纯化后的尿酸氧化酶的SDS-PAGE分析图5为Phenyl-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose FF和HiloadTM 26/60 Superdex 75层析纯化后的尿酸氧化酶的SDS-PAGE分析图6为尿酸氧化酶活性测定标准曲线图具体实施方式
实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、优化的黄曲霉UOX基因的合成及尿酸氧化酶的表达DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Pyrobest DNA聚合酶和pMD-T载体购自TaKaRa公司。
E.coli质粒的提取，采用Omega试剂盒；质粒构建的操作方法参考分子克隆一书。
一、rUox基因的合成和表达载体的构建参考GenBank发表的黄曲霉UOX基因序列(序列号X61766)和文献，分析存在的可能影响蛋白质在大肠杆菌中翻译的复杂二级结构，对该基因进行优化，在保证氨基酸序列不变的前提下进行定点突变，去除复杂二级结构，突变后的基因序列由博亚生物公司合成，并克隆到pMD-T载体进行序列测定，DNA序列测定确证合成的基因正确，得到优化的黄曲霉Uox基因-rUox，该rUox基因具有序序列表中序列1的核苷酸序列，自5′端第7位-915位核苷酸序列为编码序列(序列表中序列3)。
将DNA序列测定正确的rUox基因用Nde I和Sac I从pMD-T载体上双酶切下，并凝胶回收纯化，将纯化的rUox基因与经过Nde I和Sac I酶切pET-32a(+)(Novagen)得到的5400bp的片段连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上培养，挑选阳性克隆用特异引物(上游引物5-acccatatgtccgcagtaaaagcagcc-3和下游引物5-ggggagctcttacaatttagacttcag3，划线部分别是Nde I和Sac I的酶切位点)进行PCR鉴定，筛选得到阳性克隆(图1中泳道1，1条约900bp的条带)。对PCR阳性克隆提取质粒进一步用Nde I/Sac I进行双酶切和鉴定，得到5400和900bp的条带(图1中泳道2)，说明构建的质粒结构正确，将该结构正确的质粒命名为pET-rUox；pET-rUox的PCR和酶切鉴定结果如图1所示，图1中泳道M为DNA分子量标准(DL-15 000)；泳道1为pET-rUox的PCR电泳结果；泳道2为用Nde I和Sac I酶切pET-rUox质粒得到的产物的电泳结果。
二、重组黄曲霉Uox的诱导表达将pET-rUox转化大肠杆菌BL21(DE3)，在LB培养基(羧苄青霉素100μg/ml)平板上培养，挑取单个菌落接种于含有抗生素的LB培养基中(羧苄青霉素100μg/ml)，37℃培养10小时；按1∶100的体积比扩大培养，37℃培养至菌密度为A600＝0.8时，分成两份，一份加入IPTG至终浓度为1mmol/L，另一份不加IPTG，两份都在37℃继续培养5h，14000g离心收集菌体，按照每克菌体用10ml超声缓冲液重悬菌体，在冰上超声(功率200w，超声时间5s，间歇5s，超声总的时间为8min)，超声后的悬液在14000rpm离心20min，沉淀用与离心后上清同样体积的超声缓冲液重悬，将超声后的离心上清和重悬沉淀分别与等体积的2×SDS加样缓冲液混合均匀，煮沸5min，10000rpm离心5min后，分别取20μl然后进行SDS-PAGE分析，SDS-PAGE分析结果如图2所示，结果表明，在分子质量大约34kD(箭头示)的位置上有明显的表达条带，与理论预期相符；经TotalLab软件分析目的蛋白的表达量占可溶性全菌蛋白的40％，尿酸氧化酶的表达量为1090IU/g菌体(酶活性的测定方法同步骤三)。其中图2中，M为蛋白低分子量标准，泳道1为BL21(DE3)/pET-rUox(转pET-rUox的大肠杆菌BL21(DE3))，未诱导全菌；泳道2为BL21(DE3)/pET-uox，IPTG诱导全菌，超声上清；泳道3为BL21(DE3)/pET-uox，IPTG诱导，超声沉淀。
三、重组黄曲霉Uox的大量诱导表达及纯化接种单菌落于10ml LB培养基(含羧苄青霉素100μg/ml)，37℃培养10h。按1∶100的体积比接种新鲜的LB培养基(含羧苄青霉素100μg/ml)，37℃、250rpm培养8h，按1∶50的体积比接种至30L的发酵罐中培养至菌液A600＝1.4-1.6，加入IPTG至终浓度1mmol/L，在37℃继续培养5h，离心收集菌体，-20℃冻存。将冻存的细菌室温融化，进行如下步骤处理1)高压匀浆破碎菌体用20mM，pH 8.0的PB缓冲液重悬菌体(20ml/g湿菌体)，用高压均质机在900bar压力下破碎1次，然后在4℃，12000rpm(22000g)离心20min，取澄清的上清液备用。
2)澄清上清液的疏水层析用1M，pH8.0的(NH4)2SO4平衡层析柱；将澄清的上清液与3M，pH8.0的(NH4)2SO4，按照2∶1的体积比混合，上样；1M，pH8.0的(NH4)2SO4洗涤非特异结合蛋白，最后20mM，pH 8.0的PB缓冲液梯度洗脱样品。将该洗脱后的样品进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示，图3中箭头所指为各泳道在34kD的位置上的明显的表达条带。
3)脱盐处理步骤2)得到的样品进行SDS-PAGE后，选取纯度好的样品液体，用截留分子量10kD，超滤体积15ml的超滤管进行脱盐，然后在2000g离心10-15min(浓缩1倍)；添加20mM，pH 8.0的PB缓冲液到初始体积再超滤2次。
4)离子交换层析将步骤3)超滤脱盐后得到的样品溶液用去离子水按照1∶3的体积比稀释，使电导小于2.5mS/cm、pH 8.0-8.4，上DEAE-Sepharose FF层析柱，流穿液备用，其中平衡缓冲液为10mM，pH 8.0-8.4的PB缓冲液。
5)流穿液的疏水层析将步骤4)得到的流穿液与3mol/L，pH8.0的(NH1)2SO4按照2∶1的体积比混合，过Phenyl-Sepharose FF层析柱；用1M，pH8.0的(NH4)2SO4，洗涤非特异结合物质；然后用20mM，pH 8.0的PB缓冲液梯度洗脱样品得到纯化后的样品，将样品过滤除菌。将该纯化后的样品进行SDS-PAGE分析，结果如图4所示，图4中箭头所指为各泳道在34kD的位置上的明显的表达条带。
6)凝胶过滤层析所用层析柱为HiloadTM26/60 Superdex 75(Phamacia)，20mM，pH 7.2的PB缓冲液(含有0.15M的NaCl)平衡层析柱，0.5M的NaOH洗洗涤柱子，20mM，pH 7.2的PB缓冲液(含有0.15M的NaCl)平衡层析柱，上样(每次上样12ml)，收集目的蛋白峰，得到纯度大于99％的尿酸氧化酶。纯化后的样品进行过滤除菌后保存。将该得到纯化的尿酸氧化酶进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，图5中箭头所指为各泳道在34kD的位置上的明显的表达条带。
三、尿酸氧化酶(rUox)的体外活性分析酶活性分析采用Legoux等报道的方法(J Biol Chem，1992，267(12)8565-8570)。每分钟将1μmol尿酸氧化为尿囊素所需的酶量为酶活性的1个国际单位(IU)。酶的比活性(IU/mg)为每毫克蛋白所含的酶活性单位数。首先测定不同尿酸浓度在292nm下的吸光度值(A292)，制作标准曲线，具体方法如下按照表1中0-6的体积数值将0.2μmol/ml尿酸贮存液和三乙醇胺缓冲液(TEA buffer，7.5g/L三乙醇胺，0.38/LEDTA，pH 8.9)混合，30℃保温5min，加入终止液，检测波长为292nm，测定每个尿酸的光吸收值，每个浓度重复3次，取平均值。利用0-6的数值计算斜率k，公式y＝kx，标准曲线如图6所示，结果表明K＝5.568/2.1＝2.651。
步骤三表达并提纯的尿酸氧化酶进行活性的测定在5ml的反应体系里，分别加入3ml三乙醇胺缓冲液(TEA buffer，7.5g/L三乙醇胺，0.38g/L EDTA，pH8.9)，1.5ml 0.2μmol/ml尿酸贮存液，1μg(10μl)纯化的尿酸氧化酶，30℃保温5min，然后加入0.5ml 20％的KOH终止液反应结束，测定尿酸浓度，检测波长为292nm，结果如表1(样品)所示，根据表中的数值和上述计算得到的K值进行酶活性计算，酶的活性＝[(0.3-OD292/k)/5]×1000；结果表明，酶的比活性＝[(0.3-0.339/2.651)/5]×1000＝34IU/mg酶蛋白。
表1.尿酸氧化酶酶活性测定结果
四、rUox的N端氨基酸序列测定取10μg样品进行还原SDS-PAGE电泳，将电泳条带用CAPS缓冲液转移到PVDF膜上，送协和医科大学基础研究所进行N端氨基酸序列测定，序列测定结果为SAVKAARYG KDNVR，与天然的氨基酸序列(序列表中序列2)一致。
序列表<160>3<210>1<211>924<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1acccatatgt ccgcagtaaa agcagcccgc tacggcaagg acaatgtccg cgtctacaag 60gttcacaagg acgagaagac cggtgtccag acggtgtacg agatgaccgt ctgtgtgctt120ctggagggtg agattgagac ctcttacacc aaggccgaca acagcgtcat tgtcgcaacc180gactccatta agaacaccat ttacatcacc gccaagcaga accccgttac tcctcccgag240ctgttcggct ccatcctggg cacacacttc attgagaagt acaaccacat ccatgccgct300cacgtcaaca ttgtctgcca ccgctggacc cggatggaca ttgacggcaa gccacaccct360cactccttca tccgcgacag cgaggagaag cggaatgtgc aggtggacgt ggtcgagggc420aagggcatcg atatcaagtc gtctctgtcc ggcctgaccg tgctgaagag caccaactcg480cagttctggg gcttcctgcg tgacgagtac accacactta aggagacctg ggaccgtatc540ctgagcaccg acgtcgatgc cacttggcag tggaagaatt tcagtggact ccaggaggtc600cgctcgcacg tgcctaagtt cgatgctacc tgggccactg ctcgcgaggt cactctgaag660acttttgctg aagataacag tgccagcgtg caggccacta tgtacaagat ggcagagcaa720atcctagcgc gccagcagct gatcgagact gtcgagtact cgttgcctaa caagcactat780ttcgaaatcg acctgagctg gcacaagggc ctccaaaaca ccggcaagaa cgccgaggtc840ttcgctcctc agtcggaccc caacggtctg atcaagtgta ccgtcggccg gtcctctctg900aagtctaaat tgtaagagct cccc 924
<210>2<211>301<212>PRT<213>黄曲霉(Aspergillus flavus)<400>2Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr1 5 10 15Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met20 25 30Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys35 40 45Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile50 55 60Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly65 70 75 80Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala85 90 95Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp100 105 110Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg115 120 125Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser130 135 140Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp145 150 155 160Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg165 170 175Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Ash Phe Ser180 185 190Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp
195 200 205Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser210 215 220Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala225 230 235 240Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His245 250 255Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly260 265 270Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile275 280 285Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu290 295 300<210>3<211>909<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3atgtccgcag taaaagcagc ccgctacggc aaggacaatg tccgcgtcta caaggttcac 60aaggacgaga agaccggtgt ccagacggtg tacgagatga ccgtctgtgt gcttctggag120ggtgagattg agacctctta caccaaggcc gacaacagcg tcattgtcgc aaccgactcc180attaagaaca ccatttacat caccgccaag cagaaccccg ttactcctcc cgagctgttc240ggctccatcc tgggcacaca cttcattgag aagtacaacc acatccatgc cgctcacgtc300aacattgtct gccaccgctg gacccggatg gacattgacg gcaagccaca ccctcactcc360ttcatccgcg acagcgagga gaagcggaat gtgcaggtgg acgtggtcga gggcaagggc420atcgatatca agtcgtctct gtccggcctg accgtgctga agagcaccaa ctcgcagttc480
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权利要求
1.一种黄曲霉尿酸氧化酶基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述基因的表达载体、工程菌和细胞系。
3.一种表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法，是将权利要求1所述的黄曲霉尿酸氧化酶基因插入原核细胞表达载体，转化宿主菌，筛选得到表达黄曲霉尿酸氧化酶的工程菌，培养工程菌，表达得到黄曲霉尿酸氧化酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述原核细胞表达载体为pET系列的表达载体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述黄曲霉尿酸氧化酶基因插入到pET系列的表达载体的Nde I和Sac I的酶切位点间，或Nde I和HindIII的酶切位点间；所述pET系列的表达载体优选为pET-32a(+)。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述工程菌为大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中，所述表达为诱导表达，所用的诱导剂为IPTG，诱导浓度0.4-1.5mmol/L，优选为1.0m mol/L。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述工程菌的培养温度为37℃，诱导表达的培养温度为28-37℃，优选为37℃。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中还包括纯化表达得到的黄曲霉尿酸氧化酶的步骤；所述纯化包括离子交换、疏水层析和凝胶过滤层析。
全文摘要
本发明公开了一种表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法及其专用表达基因。该表达基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明人工合成优化的全基因序列，采用大肠杆菌表达体系，表达水平高，达到可溶性全菌蛋白的40％，周期短，成本低。
文档编号C12N15/70GK1831132SQ20061005983
公开日2006年9月13日 申请日期2006年3月15日 优先权日2006年3月15日
发明者陈薇, 李建民, 侯利华, 付玲, 于长明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所