分离四聚体尿酸氧化酶的方法

专利名称：分离四聚体尿酸氧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种从尿酸氧化酶溶液中分离四聚体尿酸氧化酶的方法，以及由该方法获得的分离四聚体尿酸氧化酶。
本发明涉及用化学方法修饰蛋白，以延长蛋白的循环生命期并降低其免疫原性。更具体而言，本发明涉及将聚乙二醇或聚环氧乙烷缀合到尿酸氧化酶上，这样的缀合基本上消除了尿酸氧化酶的免疫原性，而尿酸氧化酶分解尿酸的活性并不受影响。
背景技术：
背景部分的陈述并不是对现有技术的全盘接受，相反，它反映了发明人员对进行此项发明时的技术情况的主观评价和解释。这些解释可能包括发明人员自己的、迄今为止尚未透露的对现有技术的洞悉。而这些洞悉本身并不是现有技术的一部分。
尿酸氧化酶(尿酸酶；E.C.1.7.3.3)是一类酶，这类酶催化尿酸氧化，氧化产物是更易于溶解的尿囊素。尿囊素属嘌呤类代谢物，更易于排泄。因为在高等灵长类动物进化过程中，使尿酸氧化酶具有活性的基因已发生数次突变，所以人类自身并不产生具有酶活性的尿酸酶。Wu，X等(1992)J Mol Evol 3478-84。其结果是，在那些易受影响的人的体内，血液(血尿酸过多症)及尿液(hyperuricosuria)中过高的尿酸浓度可能会导致关节疼痛(痛风)、损伤性尿酸沉淀(结节瘤)和肾衰的发生。对于有些易受影响个人，现可买到的药物，如别嘌呤醇(尿酸合成抑制剂)，会产生治疗允许范围内的副作用或不能充分缓解病情。Hande，KR等(1984)Am J Med 7647-56；Fam，AG(1990)Bailliere’s Clin Rheumatol4177-192。注射尿酸氧化酶可以降低血液及尿液中的尿酸浓度，至少是暂时性降低。但是，由于对于人体来说尿酸氧化酶属外源蛋白，因此，即使是第一次注射来源于黄曲霉(Aspergillus flavus)的未经修饰的尿酸氧化酶，也有百分之几接受治疗的病人发生过敏反应(Pui，C-H等(1997)Leukemia 111813-1816)，免疫反应制约了尿酸氧化酶在长期治疗和间断性治疗方面的应用。Donadio，D等(1981)Nouv Presse Med 10711-712；Leaustic，M等(1983)Rev Rhum Mal Osteoartic 50553-554。
现在可行的、治疗高尿酸血的亚优选方法已被接受好几十年了。Kissel，P等(1968)Nature 21772-74。类似地，一些患有严重痛风病的病人可以获得安全有效的注射尿酸氧化酶的可能性早已既成事实数年了。Davis，FF等(1978)in GB Broun等，(Eds.)EnzymeEngineering，Vol 4(pp.169-173)New York，Plenum Press；Nishimura，H等(1979)Enzyme 24261-264；Nishimura，H等(1981)Enzyme 2649-53；Davis，S等(1981)Lancet 2(8241)281-283；Abuchowski，A等(1981)J Pharmacol Exp Ther 219352-354；Chen，RH-L等(1981)Biochim Biophys Acta 660293-298；Chua，CC等(1988)Ann Int Med 109114-117；Greenberg，ML等(1989)AnalBiochem 176290-293。来源于动物器官的尿酸氧化酶在安全注射量的溶剂中几乎是不可溶的。美国专利3,616,231。特定的来源于植物或微生物的尿酸氧化酶在医学上可接受的溶剂中易溶些。但是，注射来源于微生物的尿酸氧化酶会很快引发免疫反应，从而可能导致威胁生命的过敏反应的发生，或者导致循环中的尿酸氧化酶失活和/或尿酸氧化酶从体内清除的速度加快。Donadio，D等(1981)；Leaustic，M等(1983)。根据源于哺乳动物，包括猪和狒狒，或源于昆虫，如黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)或假暗腹果蝇(Drosophilapseudoobscura)(Wallrath，LL等，(1990)Mol Cell Biol 105114-5127)的尿酸氧化酶的氨基酸序列而制备的酶，由于免疫原性和在生理pH条件下的不可溶等问题，至今还不能用于临床。
用聚乙二醇或聚环氧乙烷(都以PEG来表示)对蛋白进行共价修饰，这种方法已被用来延长蛋白的半寿期和降低蛋白的免疫原性。美国专利4,179,337、4,766,106和4,847,325；Saifer，MGP等(1994)Adv Exp Med Biol 366377-387。高分子量的PEG与蛋白缀合后生成的缀合物，循环生命期延长和/或免疫原性下降，并且仍保持着蛋白的功能。这一结论已在另一种酶，超氧化物歧化酶(Somack，R等(1991)Free Rad Res Commun 12-13553-562；美国专利5,283,317和5,468,478)以及其他类型的蛋白，如细胞因子(Saifer，MGP等(1997)Polym Preprints 38576-577；Sherman，MR等(1997)in JMHarris等(Eds.)Poly(ethylene glycol)Chemistry and BiologicalApplications.ACS Symposium Series 680(pp.155-169)Washington，DCAmerican Chemical Society)中得到证实。除PEG以外的多聚体与尿酸氧化酶的缀合物在美国专利4,460,683也有陈述。
在几乎所有报导过的将尿酸氧化酶PEG化(如将PEG共价偶联到尿酸氧化酶上)的尝试中，PEG总是最先与氨基缀合，包括氨基末端残基和可用的赖氨酸残基。常用的尿酸氧化酶，四个单独的亚基中每个亚基的赖氨酸的总数为25-29(黄曲霉(美国专利5,382,518))(猪，Wu，X等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869412-9416))。在天然尿酸氧化酶的结构中，有些赖氨酸残基不参与PEG化。降低尿酸氧化酶免疫原性的最常用的方法是大量缀合由低分子量PEG组成的PEG链。但是，由这种方法得到的缀合物，其酶活性也总是大大下降。
先前的研究人员曾在离体条件下注射尿酸氧化酶以催化尿酸转化成尿囊素(见Pui等(1997))。这为法国和意大利应用来源于真菌黄曲霉的尿酸氧化酶(Uricozyme)防治或暂时缓解由细胞毒素治疗坏血病而引起的高尿酸血，以及暂时降低痛风病人血液中严重超量的尿酸提供了理论基础。Potaux，L等(1975)Nouv Presse Med 41109-1112；Legoux，R等(1992)J Biol Chem 2678565-8570；美国专利s 5,382,518和5,541,098。由于Uricozyme的循环生命期很短，所以需要每天注射。更进一步，由于Uricozyme具有免疫原性，所以它并不适用于长期治疗。
将来源于单假丝酵母(Candida utilis)的尿酸氧化酶与分子量为5KD的PEG缀合，制备物单次静脉注射到五名实验者身上，这五名实验者在注射前血清中尿酸的平均浓度为6.2mg/dL，属正常水平。注射后，实验者血清中的尿酸浓度降低到了检测不出的水平。Davis等(1981)。四星期后再次注射。文章中没有报导他们的反应。第二次(也是最后一次)注射后，用灵敏度相对不高的凝胶扩散分析方法没有检测到尿酸氧化酶的抗体。该文献没有报导接受长期治疗或次长期治疗的病人或实验动物的结果。
将来源于球节细菌(Arthrobacter protoformiae)的尿酸氧化酶与分子量为5KD的PEG缀合，制备物用来暂时性控制一名淋巴瘤患者血液中的尿酸高浓度，该患者在注射前血清中的尿酸浓度为15mg/mL。Chua等(1988)。由于病人病情的危急以及治疗期之短(14天注射四次)，不可能评估缀合物治疗的长期效果或安全性。
在本申请中，术语“免疫原性”指的是由注射经PEG修饰的或未经修饰的尿酸氧化酶(抗原)制备物而引起的免疫反应。“抗原性”指的是抗原与已存在抗体的反应。抗原性和免疫反应统称为“免疫反应性”。在先前有关PEG-尿酸氧化酶的研究中，评价免疫反应性的方法有很多种，包括1)离体条件下，PEG-尿酸氧化酶与预先存在的抗体的反应；2)检测经诱导而产生的抗体的合成；3)重复注射后加快了的清除速率。
通过用不同的连接物缀合不同数量的PEG链到尿酸氧化酶上，以消除不同来源尿酸氧化酶的免疫原性的尝试已取得了一定的成功。第一次将PEG-尿酸氧化酶公诸于众的是FF Davis和Y Inada以及他们的同事们。Davis等(1978)；美国专利4,179,337；Nishimura等(1979)；日本专利55-99189和62-55079。美国专利4,179,337中所述的缀合物是这样合成的将1mol非特异来源的尿酸氧化酶与2000倍过量摩尔量的分子量为750D的PEG反应，这意味着个尿酸氧化酶亚基都可能缀合大量的多聚分子。美国专利4,179,337揭示了各种多肽类激素和酶，包括氧化还原酶(其中尿酸氧化酶是三个例子中的一个)缀合分子量为500D-20,000D，优选分子量为500D-5,000D的PEG或聚丙二醇后，可以产生有活性的、水溶性的，没有免疫原性的缀合物。另外，美国专利4,179,337还强调每个酶分子缀合10-100个多聚链而使得至少40％的酶活性得以保留。专利文献中没有关于尿酸氧化酶中可用的氨基末端PEG缀合的程度、缀合产物水解尿酸的活性或缀合物免疫反应性的检测结果。
与PEG化尿酸氧化酶有关的十三个引证中的数据都列在表1中。这些结果中有一些也以图的形式出现在

图1A-2B中。这些引证中，有七篇文章都写明将不同数量的PEG链与来源于单假丝酵母(Candidautilis)的尿酸氧化酶偶联后，离体检测的缀合物水解尿酸的活性都有很大程度的降低。将大量的分子量为5KD的PEG与猪肝脏尿酸氧化酶偶联也得到了类似的结果，这在Chen发表的文章和他们的讨论报告上都有记载。参见Chen等(1981)；Davis等(1978)。
在表1总结的研究中，有七项研究报导PEG化的尿酸氧化酶的免疫反应性降低，五项报导免疫反应性消除。后五项研究中有三项，免疫反应性消除的同时也伴随着水解尿酸活性显著降低——至多达到最初活性的15％、28％或45％。参见Nishimura等(1979)(15％活性)；Chen等(1981)(28％活性)；Nishimura等(1981)(45％活性)。第四项研究报导PEG与61％的可用赖氨酸残基缀合，但没有关于剩余酶活性的陈述。参见Abuchowski等(1981)。然而，一支包括这同样两名科学家的研究小组，用同样的方法，在另一刊物上报导以这种程度缀合，剩余的活性只能达到23-28％。参见Chen等(1981)。从Abuchowski等和Chen等在1981年发表的文章可以看出，要基本上降低尿酸氧化酶的免疫原性，PEG必须与将近60％的可用赖氨酸残基缀合(表1)。在报导尿酸氧化酶的活性已被消除的第五项研究中，PEG缀合的程度、剩余的水解尿酸的活性或PEG-蛋白连接的本质都没有说明。参见Veronese，FM等(1997)in JM Harris等(Eds.)，Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications.ACS Symposium Series680(pp.182-192)Washington，DCAmerican Chemical Society。
研究表明，尿酸氧化酶中缀合PEG的赖氨酸残基低于60％时，在实验动物体内，缀合物的免疫反应性降低但并没有消除。参见Tsuji，J等(1985)Int J Immunopharmacol 7725-730(28-45％的氨基被缀合)；Yasuda，Y等(1990)Chem Pharm Bull 382053-2056(38％的氨基被缀合)。相应化合物的剩余水解尿酸的活性范围从小于33％(Tsuji，J等)到60％(Yasuda，Y等)不等，此值相对于它们的最初活性值而言。Tsuji，J等合成PEG-尿酸氧化酶用的PEG除5KD的外，还有7.5KD和10KD的PEG。所有的连接产物都有一定程度的免疫原性和抗原性，同时酶活大大降低(表1；图1A-1B)。
将来源于单假丝酵母的尿酸氧化酶PEG化后的制备物，给五人每人安全施药两次。这种制备物据报导只保留了其最初活性的11％。Davis等(1981)。几年后，经PEG修饰的来源于球节细菌的尿酸氧化酶被四次用于同一病人，该病人患有严重的淋巴瘤和高尿酸血。参见Chua等(1988)。Chua等没有检测酶制备物剩余的活性，但是他们用酶连免疫吸附测定法(ELISA)证实了在第一次注射PEG化尿酸酶后的26天，病人血清中的抗-尿酸氧化酶抗体不见了。
如在表1中所总结的，先前的关于PEG化尿酸酶的研究表明，要基本上降低尿酸氧化酶的免疫反应性，需要缀合足量的PEG链，但这又会大大降低其水解尿酸的活性。更进一步，最先合成PEG-尿酸氧化酶是用氰尿酰氯，一种三嗪衍生物(2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪)来活化PEG的。已证实在兔子体内，氰尿酰氯会引起新的抗原因子的产生，并会诱导新的抗体的形成。参见Tsuji，J等(1985)。
表1 先前研究中PEG-尿酸氧化酶的特征
A Sana等在日本专利3-148298中揭示了修饰蛋白，包括用分子量为1-12KD的PEG衍生的尿酸氧化酶，表现出降低了的抗原性和“改进的、延长的”作用，以及制备这样的衍生多肽的方法。然而，专利中并没有关于链数、酶分析、生物检测或“改进的、延长的”的含义的说明。Y Inada在日本的专利55-99189和62-55079中揭示了分别由PEG-三嗪或双-PEG-三嗪(表1中表示为PEG2)制备的尿酸氧化酶缀合物。见Nishimura等(1979和1981)。在第一种类型的连接物中，PEG的分子量为2KD和5KD，而在第二种类型的连接物中，只用了分子量为5KD的PEG。Nishimura等(1979)报导用线形、分子量为5KD的PEG修饰43％的赖氨酸后，还有15％的水解尿酸的活性。Nishimura等(1981)报导用PEG2分别修饰46％或36％的赖氨酸后，还有31％或45％的水解尿酸的活性。
发明概述先前的研究告诉我们，PEG化虽然可以大大降低尿酸氧化酶的免疫原性和/或抗原性，但总是伴随着尿酸裂解活性的显著降低。生物药物的安全、方便和划算总是受到效价降低的不利影响，而效价降低就需要增加用药剂量。因此，需要有一种安全有效的替代疗法来降低体液(包括血液和尿液)中尿酸的高浓度。
本发明的一个实施方案是一种尿酸氧化酶的缀合物，它保持了至少大约75％的未缀合尿酸氧化酶的尿酸裂解的活性，而且免疫原性基本上降低。本实施方案包括一种纯化了的尿酸氧化酶，该酶的每个亚基都与平均2-10个PEG链共价缀合，这些PEG链可以是线型链，也可以是分支链，链中每个PEG分子的分子量为5KD-100KD。在本实施方案中，本发明的尿酸氧化酶可以是重组尿酸氧化酶。不管是不是重组体，尿酸氧化酶都可以来源于哺乳动物。本实施方案的一个方面，尿酸氧化酶可以来源于猪肝、牛肝或绵羊肝脏。另一个方面，尿酸氧化酶也可以是嵌合的。嵌合尿酸氧化酶可以包括部分猪肝和/或狒狒肝尿酸氧化酶序列。例如，嵌合的尿酸氧化酶可以是猪-狒狒嵌合尿酸氧化酶(PBC uricase)或包含了R291K和T301S突变的猪尿酸氧化酶(PKS uricase)(序列见图6，生理和免疫方面的研究结果见图7-12)。另外，尿酸氧化酶也可以是狒狒肝脏尿酸氧化酶，其中97位酪氨酸被组氨酸代替，这样得到的尿酸氧化酶活性上升到至少约60％。本发明中的尿酸氧化酶，不管是什么来源的，都以平截形式存在，截去的可能是氨基端，也可能是羧基端，还可能是两端。同样，尿酸氧化酶也可以是真菌或微生物尿酸氧化酶。本实施方案的一个方面是真菌或微生物尿酸氧化酶可以是来源于黄曲霉，球节杆菌和单假丝酵母的，其形式可以是天然形式或重组形式。另外，尿酸氧化酶可以是无脊椎动物的尿酸氧化酶，例如，来源于大豆(Glycine max)根瘤的天然形式或重组形式的尿酸氧化酶。PEG的平均分子量介于5KD-100KD；PEG的优选平均分子量介于10KD-60KD；PEG的更优选平均分子量介于20KD-40KD，例如30KD。共价缀合的PEG链的平均数目为2-10个链/尿酸氧化酶亚基；共价缀合的PEG链的优选平均数目为3-8个链/尿酸氧化酶亚基；共价缀合的PEG链的更优选平均数目是4-6个链/尿酸氧化酶亚基。在本实施方案的一个方面中，尿酸氧化酶可以是四聚体。PEG链可以通过氨酯键(氨基甲酸酯)，仲胺键，和/或酰胺键共价偶联到尿酸氧化酶上。本文中所提到的任意一尿酸氧化酶，当它以重组形式存在时，重组形式与天然形式的尿酸氧化酶在序列上基本上是相同的。
本发明的另一实施方案是一种药物组合物，用该组合物降低体液中的尿酸水平，包括上述提到的任一PEG-尿酸氧化酶缀合物和药学上可接受的载体。冷冻干燥条件下该组合物可以稳定存在。而配制适用于肠胃外注射的溶剂时，该组合物又能迅速溶解。
本发明还提供了一种降低哺乳动物体液和组织中尿酸水平的方法。该方法包括给哺乳动物施用PEG-尿酸氧化酶，其量可有效降低尿酸水平。PEG-尿酸氧化酶可以是一种很纯的、有两个或更多亚基的尿酸氧化酶，其中每个亚基可以共价缀合到平均2-10个线形或分支PEG链上。PEG链上每个PEG分子的分子量介于5KD-100KD，在药学上可接受的载体中。哺乳动物可以是人。用药步骤可以是，例如，静脉注射、皮内注射、皮下注射、肌肉内注射或腹腔进入或吸入雾状制备物。尿酸水平升高可能是在血液中、尿中和/或其它体液和组织中，而且可能与痛风、结节瘤、肾功能不全、器官移植或恶性疾病有关。
本发明的其它实施方案是一种将四聚体形式的尿酸氧化酶从含有多种形式的尿酸氧化酶溶液中分离出来的方法以及该方法的产物。最初的溶液可能含有一定的四聚体尿酸氧化酶和其他尿酸氧化酶聚合物。该方法可包括如下步骤将溶液加到至少一个分离柱上，分离柱的pH介于9-10.5，例如10.2；收集洗脱级分，鉴别出那些可能含有分离出的四聚体尿酸氧化酶，且基本上不含其他尿酸氧化酶聚合物的级分；把含有分离出的四聚体尿酸氧化酶的级分合并。分离柱可以是离子交换、大小排除或其他有效的分离方法。本方法还包括为确定四聚体尿酸氧化酶的存在和/或不存在其他尿酸氧化酶聚合体而采用的级分分析。例如，这样的分析方法包括高效液体色谱法(HPLC)、其它层析法、光散射、离心和/或电泳。本实施方案的一个方面，经纯化的四聚体尿酸氧化酶可以含有少于约10％的尿酸氧化酶聚合物。
附图简述图1A表示来源于单假丝酵母的尿酸氧化酶经PEG化后仍保留的活性作为每个亚基缀合的PEG链数的函数。
图1B表示来源于单假丝酵母的尿酸氧化酶经PEG化后仍保留的活性作为每个亚基缀合的PEG总数的函数。
图2A表示来源于猪肝的尿酸氧化酶经PEG化后仍保留的活性作为每个亚基缀合的PEG链数的函数。
图2B表示来源于猪肝的尿酸氧化酶经PEG化后仍保留的活性作为每个亚基缀合的PEG总数的函数。
图3A表示猪-狒狒嵌合(PBC)尿酸氧化酶经PEG化后仍保留的活性作为每个亚基缀合的PEG链数的函数。
图3B表示PBC尿酸氧化酶经PEG化后仍保留的活性作为每个亚基缀合的PEG总数的函数。
图4A表示来源于黄曲霉的尿酸氧化酶经PEG化后仍保留的活性作为每个亚基缀合的PEG链数的函数。
图4B表示来源于黄曲霉的尿酸氧化酶经PEG化后仍保留的活性作为每个亚基缀合的PEG总数的函数。
图5A表示重组大豆根瘤尿酸氧化酶经PEG化后仍保留的活性作为每个亚基缀合的PEG链数的函数。
图5B表示重组大豆根瘤尿酸氧化酶经PEG化后仍保留的活性作为每个亚基缀合的PEG总数的函数。
图6表示推测出的猪-狒狒嵌合尿酸氧化酶(PBC uricase)的序列，PBC尿酸氧化酶在N-末端和C-末端都切去了顶端(PBC-NT-CT)，而且将猪和狒狒的序列作一比较，可看出猪尿酸氧化酶含有R291K和T301S突变(PKS uricase)。
图7表示四次或五次向小鼠腹腔注射经PEG修饰的PBC尿酸氧化酶，每次注射24小时后小鼠血清中尿酸氧化酶的活性，相对于第一次注射24小时后的值。
图8表示尿酸缺陷型小鼠血清中所注射的PEG修饰的PBC尿酸氧化酶的活性与血清及尿液中的尿酸浓度间的反相关。
图9表示用PEG修饰的PBC尿酸氧化酶处理后，尿酸氧化酶缺陷型小鼠(uox-/-)因尿浓缩造成的机体损伤程度的减轻。
图10表示用PEG修饰的PBC尿酸氧化酶处理后，尿酸氧化酶缺陷型小鼠(uox-/-)的肾性尿崩症的减轻。
图11表示磁共振显微术所显示的用PEG修饰的PBC尿酸氧化酶处理后，尿酸氧化酶缺陷型小鼠(uox-/-)的尿酸引发的肾病的减轻。
图12表示BALB/c小鼠体内所注射的八聚体PBC尿酸氧化酶相对四聚体而言在循环中的清除速率要快许多，虽然二者的每个亚基上都偶联了5-6条链10kDa的PEG。
优选实施方案详述本发明提供了水溶性高分子，尤其是聚乙二醇或聚环氧乙烷与尿酸氧化酶的改良偶联物。本发明也提供了该改良偶联物的药物组合物。这些偶联物基本上无免疫原性，而保留了未修饰酶的至少75％的尿酸裂解活性，优选的可保留85％的酶活性，更优选的保留的酶活性可达95％或更高。可与水溶性聚合物偶联的尿酸氧化酶包括从细菌、真菌、植物和脊椎与无脊椎动物中分离出的天然的尿酸氧化酶以及突变、杂交和/或截短的具有酶活性的尿酸氧化酶变体等重组尿酸氧化酶。适用于本发明的水溶性聚合物，包括线性和分支的聚乙二醇类或聚环氧乙烷类，通常都称为PEGs。有关分支的PEG的实施例参见美国第5,643,575号专利。线性PEG的一个优选实施例是单甲氧基PEG，其化学通式是CH3-(CH2CH20)nH，其中n的取值范围约为100～2300。
一种优选哺乳类尿酸氧化酶是重组的猪-狒狒嵌合尿酸氧化酶，该酶由猪肝和狒狒肝的尿酸氧化酶的部分序列嵌合而成，猪肝尿酸氧化酶及狒狒肝尿酸氧化酶首先由Wu，et al.，(1989)鉴定。该嵌合尿酸氧化酶的一个实施例是由猪尿酸氧化酶序列(SEQ ID NO1)的前225个氨基酸和狒狒尿酸氧化酶序列(SEQ ID NO2)的后79个氨基酸组成(猪-狒狒尿酸氧化酶或PBC尿酸氧化酶；图6)。该嵌合尿酸氧化酶的另一个实施例由猪序列(SEQ ID NO1)的7-225号残基和狒狒序列(SEQ ID NO2)的226-301号残基组成；这就等同于氨基和羧基端都被平截的PBC尿酸氧化酶(PBC-NT-CT；图6)。还有一个该嵌合尿酸氧化酶的实施例是由猪序列(SEQ ID NO1)的前288个氨基酸和狒狒序列(SEQ ID NO2)的后16个氨基酸所组成。由于后面序列与猪序列仅存在两个位点的差异，即猪序列291位精氨酸残基被赖氨酸残基(K)替代，301位苏氨酸被丝氨酸(S)所替代，该突变型被称为猪-K-S或PKS尿酸氧化酶。PKS、PBC和PBC-NT-CT尿酸氧化酶分别含有一个以上的赖氨酸残基；因而比猪或狒狒的序列多出了一个潜在的PEG化位点。
现已亚克隆出包括PBC、PKS尿酸氧化酶和一种类似狒狒尿酸氧化酶的重组酶在内的不同哺乳动物来源的尿酸氧化酶的cDNA，而且通过常规方法确定了它们在大肠杆菌中表达的最佳条件。参见Erlich，HA，(Ed.)(1989)PCR Amplification.New YorkStockton Press；Sambrook，J.Et al.，(1989)Molecular Cloning.A LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N YCold Spring HarborLaboratory Press。现已提纯出这些重组尿酸氧化酶，并用修饰标准试验评估了其稳定性及活性。参见Fridovich，I，(1965)J BiolChem2402491-2494；Nishimura，et al.，(1979)以及实施例1。
本发明的一项实施方案通过与无毒的、生物稳定的、分子链数相对比较少的PEG共价缀合的方法得到了偶联尿酸氧化酶。这种化学键包括氨基甲酸乙酯(氨基甲酸酯)键、仲胺键以及酰胺键。各种适用于这种偶联的活化的PEG都可以从Shearwater Polymers，Huntsville，AL购得。
例如，在琥珀酰亚氨基酸碳酸(SC)或4-硝苯基碳酸酯(NPC)这些PEG衍生物存在的条件下将尿酸氧化酶进行孵育，就可以形成与尿酸氧化酶相连的氨酯键。SC-PEG的合成程序见本文参考文献中的美国第5,612,460号专利。NPC-PEG可以依据Veronese，FM，et al.，(1985)Appl Biochem Biotechnol 11141-152所述方法将PEG与4-硝苯基氯甲酸酯反应制备，或按本文参考文献中美国第5,286,637号专利中的方法制备。只要调节反应物的浓度以维持相似的化学计量，‘637号专利所述方法可适用于更高分子量的PEG。合成NPC-PEG的另一种方法见Büttner，W，et al.，East German Patent Specification DD279，486AL。
可用一种PEG羧酸衍生物(Shearwater Polymers)的N-羟基琥珀酰亚胺基酯形成与尿酸氧化酶相连的酰胺键。可用2，2，2-三氟乙磺酰基PEG(tresyl PEG；Shearwater Polymers)或PEG醛(ShearwaterPolymers)与氰基氢硼化钠发生还原烷基化反应形成仲胺键。
由5kDa～30kDa的PEG组成的偶联物中，每个亚基所偶联的PEG的最大链数可从大豆尿酸氧化酶的平均2条到PBC尿酸氧化酶的平均10多条(见实施例1的试验条件及图1A-5B的结果)，而保留了未修饰的尿酸氧化酶至少75％的尿酸分解活性。后者PEG化的程度将近总氨基数的三分之一。本发明的一项实施方案中，每个尿酸氧化酶亚基偶联的PEG的平均链数为2-10。在一项优选的实施方案中，每个尿酸氧化酶亚基偶联的PEG平均链数为3-8。而一项更优选的实施方案中，每个尿酸氧化酶亚基共价偶联的PEG平均链数为4-6。在另一项实施方案中，用于偶联反应的PEG的分子量为5kDa-100kDa，优选分子量为10kDa-60kDa，更优选分子量为20kDa-40kDa，例如30kDa。
某一形式的尿酸氧化酶的偶联反应所用的PEG的链数及最适分子量的选择受几个因素的影响。一般而言，要降低或消除免疫原性而基本上不改变尿酸裂解活力，可能需要偶联上链数相对更多的小分子量的PEG，反之可用链数相对少些的大分子量的PEG。例如，每个亚基上偶联6条链的20kDa的PEG或每个亚基偶联4条链的30kDa的PEG效果最佳。同样，每一种不同形式的尿酸氧化酶就所偶联的PEG的分子量大小和链数而言，存在不同的最适点。参见图1A-5B。
将被检测的尿酸氧化酶溶解于一种生理酸碱度的缓冲液中，该缓冲液不含用于稳定法国、意大利的Sanofi Winthrop所售的真菌尿酸氧化酶(Uricozyme)所需要的8-杂氮磺嘌呤等外加类似底物或抑制因子，该尿酸氧化酶可稳定存在，并因与PEG的偶联而性质有所改变。两种不同的PBC尿酸氧化酶偶联物，其中一种的每个亚基偶联6条链10kDa PEG而另一种每个亚基大约偶联2分子的19kDa PEG，将它们在鼠血清中孵育1个多月后还保持了较显著的酶活。另外本发明的几种偶联物在鼠体内循环的半寿期超过2天，而过去报导的PEG修饰的哺乳类和微生物尿酸氧化酶的半寿期将近8或24小时。参见Chen，et.，(1981)；Fuertges，F，et al.，(1990)J Contr Release11139-148；Fujita，T，et al.，(1991)J Pharmacobiodyn14623-629。注射用的蛋白药物的半寿期的延长减少了药物成本，而且患者的顺应性更好。半寿期延长也是更易于机体耐受的药物的一个指征。
用纯化后的四聚体形式的酶(4个35kDa的亚基)制备PBC尿酸氧化酶的PEG偶联物，发现这些偶联物在鼠体内的免疫原性大大减弱(图7)，而更多亚基的尿酸氧化酶PEG偶联物具有中等程度的免疫原性(例如35kDa亚基八聚体；见图12)，未修饰的酶有着很高的免疫原性。给尿酸氧化酶缺陷性小鼠反复注射本发明的PEG-尿酸氧化酶，可以在2个多月内消除它们的高尿酸血症状，保护其肾脏结构功能免受尿酸造成的伤害(图8-11)。
注射全活性的PBC尿酸氧化酶与10kDa PEG的偶联物(图3A-3B)，大大减轻了尿酸氧化酶缺陷型纯合小鼠的高尿酸血症状(图8)。所有用PEG化的PBC尿酸氧化酶治疗的尿酸氧化酶缺陷型小鼠尿液中的尿酸水平显著下降。用相似的PEG尿酸氧化酶对尿酸氧化酶缺陷型小鼠进行一系列的注射试验所得数据参见图8。分别对正常生活条件、经过12小时断绝饮水(图9)、水分消耗和排尿后(图10)的接受注射治疗的病鼠进行尿液的重量摩尔渗透压浓度测定，所得结果与基本上相似的未经药物治疗的病鼠相应状况下的测量结果相比较，证实了注射PEG-尿酸氧化酶的确减轻了尿浓缩所引起的不良反应。而且用本发明的一种PEG-尿酸氧化酶对出生10日后的纯合尿酸氧化酶缺陷型(uox-/-)的基因“敲除”小鼠进行为期10周的注射治疗，并用磁共振显微术观察，结果也证实了尿酸引发的肾结构的破坏程度减轻了(图11)。至于显微技术方法参见Hedlund，LW，et al.，(1991)FundAppl Toxicol 16787-797；Johnson，GA，et al.，(1992)in JC Gore，(Ed.)，Reviews of Magnetic Resonance in Medicine，Vol.4(pp.187-219)New YorkPergmon Press。
天然及重组尿酸氧化酶提纯物中常常除了四聚体(140kDa)形式之外还混有其他形式的酶聚合物。纯化物中四聚体形式的酶所占的百分比一般为20％-90％。尽管有证据表明几种未PEG化的其他蛋白聚合物具有高免疫原性，(例如，见Moore，WV，et al.，(1980)J ClinEndocrinol Metab 51691-697)，以往的PEG-尿酸氧化酶的研究并未着力于其他聚合物含量的限制，这表明研究者并没有考虑到PEG修饰的聚合物还具有潜在的免疫原性。本发明研究人员观察到以前制备PEG尿酸氧化酶所用的尿酸氧化酶中存在这样的聚合物。这些聚合物的出现可能增加了制备非免疫原性偶联物的难度。而且在以往的尿酸氧化酶PEG化实验中出现的尿酸分解活力大幅下降现象似乎与这些酶偶联上的低分子量的PEG链数过多有关。另一方面，本文所述的尿酸氧化酶纯化及PEG化方法允许在每个亚基上共价缀合10条链的PEG而保持了75％以上的尿酸水解活力，至少对于猪-狒狒嵌合尿酸氧化酶以及源于黄曲霉的尿酸氧化酶这样的尿酸氧化酶可以这么做(见图3A、4A)。
在另一项优选的实施方案中，可以在将制备的基本为四聚体的尿酸氧化酶与PEG偶联之前，通过离子交换或体积排阻层析法把几乎所有的四聚体尿酸氧化酶洗脱下来，洗脱液pH9～10.5，优选pH为10.2。从制备柱洗脱下的每一种组分的尿酸氧化酶分子量可以用任何一种分子量大小依赖的分析方法检测到，包括高效液相层析法、常规大小分离层析法、离心、光散射、区带电泳或非变性凝胶电泳。将体积排阻层析法分离出的只含有四聚体尿酸氧化酶，即140kDa的酶级分收集，备偶联PEG之用。用离子交换层析法分离四聚体尿酸氧化酶的过程中，从离子交换柱洗脱下的级分可进行大小分析以确定哪个级分含有大量的四聚体尿酸氧化酶而不需要的其他聚合物只占10％、5％、2％或更少。
本文的试验结果表明，比四聚体更大的PBC尿酸氧化酶即便是已经充分PEG化了，仍能在小鼠体内保持高免疫原性(图12)。而且，向曾注射过PEG尿酸氧化酶聚合物的小鼠再注射PEG化的四聚体或PEG化的其他尿酸氧化酶聚合物，这些偶联聚合物在循环体系中很快就被清除。而非四聚体含量低于5％的尿酸氧化酶所制得的PEG偶联物可以多次注射而清除速率没有加快(图7)，而且高灵敏度酶联免疫分析检查不出抗体的产生。用高纯度四聚体尿酸氧化酶也使本发明的改良偶联物较以往所述PEG-尿酸氧化酶优点更显著。相反，以往的一些研究者由于使用了含有高比率(如＞10％)的非四聚体尿酸氧化酶的尿酸氧化酶制备物制取PEG-尿酸氧化酶，为了降低免疫原性而不得不增加偶联的PEG的链数。结果生成的偶联物的酶活力显著降低。在另一项实施方案中，在确保制得的尿酸氧化酶偶联物保留了至少75％的尿酸分解活性而基本上无免疫原性的前提下，本发明还特别考虑到了非四聚体形式的PEG化的尿酸氧化酶，例如二聚体尿酸氧化酶。
本发明的另一个实施方案提供了一种比突变的酶效价显著增高的突变型狒狒肝尿酸氧化酶。这种改良的灵长类尿酸氧化酶可通过DNA重组技术制取。尤其出乎意料的是在狒狒尿酸氧化酶中发生单个氨基酸残基突变(94位酪氨酸被组氨酸所代替)后，可引起特定酶活力的大幅度增强。在大肠杆菌中表达的这种突变蛋白的特定的酶活较突变前的狒狒尿酸氧化酶增加了至少60％。
在另一个实施方案中，表达了一种至少去除了氨基端前6个氨基酸和/或至少去除了羧基端后3个氨基酸的截短的猪或猪-狒狒嵌合尿酸氧化酶变体，发现这种未PEG化的特定的酶活性有所增加和/或可溶性有所提高(参见图6)。羧基端平截的重组尿酸氧化酶也许在PEG化之前就具有了更好的可溶性，因为去除了过氧化靶序列。见Miura，S，et al.，(1994)Eur J Biochem 223141-146。
本发明的PEG-尿酸氧化酶可有效降低哺乳动物，尤其是人类体液及组织中的尿酸水平，因此可用于治疗痛风、结节瘤、肾功能不全、器官移植和恶性疾病等病症中并发的高尿酸症。可以通过静脉内、皮下、皮内、肌肉及腹膜内等多种途径将PEG-尿酸氧化酶注射到尿酸水平过高的哺乳动物体内。另外，也可以将之烟雾化以后吸入体内。见Patton，JS，(1996)Adv Drug Delivery Rew 193-36和美国第5,458,135号专利。本发明的PEG-尿酸氧化酶的有效剂量取决于尿酸水平及个体大小。本发明此方面的一项实施方案中，PEG-尿酸氧化酶按照大约10μ-1g的用量与一种药学上可接受的的赋形剂或稀释剂共同服用。在一个优选的实施方案中，PEG-尿酸氧化酶的用量大约为100μ-500m。更优选的则为1mg-100mg，例如5mg，20mg或50mg。实施方案中的PEG-尿酸氧化酶的用量范围根据偶联物中酶蛋白的含量而定。
可通过常规方法配制含有PEG-尿酸氧化酶的药剂，例如Gennaro，AR(Ed.)(1990)Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th EditionEaston，PAMack Publishing Co所述方法。配制注射用药剂可使用的赋形剂包括磷酸缓冲盐溶液、乳酸化林格溶液、水、多元醇和甘油等。用于肠胃外注射药剂的成份包括药学上可接受的无菌水或非水剂、分散剂、悬浮液或乳剂以及现配现用的与无菌注射溶液或分散剂混合的无菌粉剂。这些制剂可添加别的一些成份，比如防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲液、抗氧化剂和稀释剂。
PEG-尿酸氧化酶也可作为控释成分植入个体，以便持续控制体液中的高尿酸水平。例如，聚乳酸、聚乙醇酸、再生胶原蛋白、多聚-L-赖氨酸、藻酸钠、吉兰糖胶、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、多层脂质体以及许多其他常规处方，包括可以与具有生物活性成份配合使用的，可以生物腐蚀或可生物降解的材料。这些材料在植入或注入体内后，会逐渐分解，并向其周围组织释放活性物质。例如，一种把PEG-尿酸氧化酶胶囊化的方法，该方法包括本文参考文献中收录的美国第5,653,974号专利所披露的方法。本发明特别重视可生物腐蚀、降解的处方。关于运载PEG-尿酸氧化酶的灌输泵和运载基质体系也在本发明的考虑范围之中。PEG-尿酸氧化酶也可很好的封入胶粒或脂质体中。脂质体包裹技术在制药业已为人们所熟知。例如参见Lasic，D，et al.，(Eds.)(1995)Stealth Liposomes.Boca Raton，FLCRCPress。
本发明的PEG-尿酸氧化酶药物成分可降低因尿酸引起肾功能不全的高危病人，如接受器官移植者(见Venkataseshan，VS，et al.，(1990)Nephron 56317-321)及恶性疾病患者对血液渗析的依赖性。对体内大量积累尿酸晶体的病人(如结节瘤患者)而言，这种药物组合物可以比目前可行的其他治疗方法更快的改善患者的新陈代谢状况。
以下的实施例不应被视为本发明的局限性，而是为了说明上述各方面而例举的。这些实施例叙述了几种大小和成分的活化的(亦即亲电子的)PEG衍生物和天然的猪、真菌或细菌尿酸氧化酶或重组的大豆、猪或猪-狒狒嵌合尿酸氧化酶发生偶联反应制备PEG-尿酸氧化酶的方法。在这些实施例中还包括有关活性、可溶性、稳定性、药物代谢动力学、药效动力学以及免疫原性的研究结果。图8-11的数据证实了本发明的PEG-PBC尿酸氧化酶治疗血内尿酸过多以及多尿酸尿，保护因血内尿酸过多和多尿酸尿造成的严重肾损伤的动物体系中肾脏的结构功能的作用。参见Wu，X，et al.，(1994)Proc Natl Acad SciUSA 91742-746。这些实施例可以指导本行业中的普通技术人员生产基本上无免疫原性，而保留了未修饰酶至少75％的尿酸分解活力的尿酸氧化酶偶联物。
实施例1
四聚体形式尿酸氧化酶的纯化四聚体尿酸氧化酶(分子量约为140kDa)是通过先制备大小分离或离子交换层析后分析大小分离层析两个步骤从猪肝尿酸氧化酶溶液中纯化的。猪肝尿酸氧化酶购自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，catalog No.U2350或Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN。
制备及分析大小分离层析的pH值范围为pH 10-pH 10.5，优选的为pH 10.2，层析缓冲液是含0.1M NaCl的10mM的碳酸钠缓冲液，使用已经用已知分子量的蛋白校准过的Superdex200层析柱。Superdex购自Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ。任何可以保持所需酸碱度，并与后续的PEG偶联化学反应相匹配的缓冲液都是适用的。这样的缓冲液在本领域已为人们所熟知。在280nm波长处检测洗脱液的紫外吸收值，收集洗脱液终于所需四聚体尿酸氧化酶分子量一致且无更高分子量的尿酸氧化酶的部分，用于合成实施例2所述的基本无免疫原性的PEG-尿酸氧化酶。另外，也可通过其他大小分离介质分离四聚体尿酸氧化酶，例如Superose12(Amersham Pharmacia)或其他任何可耐受弱碱性溶液且筛选范围合适的介质。这样的介质很容易购得，在本领域也广为人知。
离子交换层析的pH为10-10.5，优选的为10.2，适用经0.1M的碳酸钠缓冲液平衡过的MonaQ层析柱(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)。任何与PEG偶联反应相匹配且可以维持所需pH的缓冲液都是适用的。而为了使尿酸氧化酶吸附到柱子上，缓冲液的离子浓度应尽可能低。在本领域中这种缓冲液已为人们所熟知。逐渐增加缓冲液离子强度，如含0～0.5M线性梯度浓度的NaCl的碳酸钠缓冲液，使尿酸氧化酶从离子交换树脂上洗脱下来的同时，测定洗脱液在280nm波长处的紫外吸收值。然后通过大小分离高效液相层析确定洗脱液中含所需四聚体尿酸氧化酶而检测不出其他聚合物的部分，收集之以备合成无免疫原性的PEG-尿酸氧化酶之用。另外，也可用其他离子交换介质分离出四聚体尿酸氧化酶，如Q-Sepharose(AmershamPharrmacia)或其他任何可耐受弱碱性溶液的介质。这样的介质很容易购得，在本领域也广为人知。
尿酸氧化酶的活性可通过改进的方法测定。如Fridovich(1965)；Nishimura，et al.，(1979)所述方法。用pH9.2的50mM硼酸钠缓冲液配制尿酸溶液，尿酸终浓度为6-150μM，现配现用。将制得的尿酸氧化酶用含牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，catalogNo.A-7030)的50mM硼酸钠缓冲液稀释，白蛋白的终浓度为0.1mg/mL。25℃条件下将各种稀释度的酶与微量板读数器上的微量滴定板小孔中的底物混合，然后在292nm波长处每4秒钟测定一次尿酸消失的速率，连续测定3分钟。从3分钟内就有10％～40％的底物被降解的样品得到的数据中至少取20个数据点用来计算每分钟吸光值下降的最大速率。一个尿酸氧化酶活的国际单位(IU)指的是每分钟消耗1微摩尿酸所需酶量；比活度用IU/mg蛋白表示。图1A-5B中的一些尿酸氧化酶相对酶活数据是用100μM尿酸测定所得。其他的100μM尿酸速度(V100)的是通过米氏常数(κM)值和相应的酶制备物的最大反应速度(Vmax)计算得到的，所用公式如下V100＝100×Vmax/(κM+100)公式中的κM以微摩尔为单位表示。
实施例2四聚体猪尿酸氧化酶的PEG偶联以每摩尔尿酸氧化酶亚基(分子量35kDa)添加10-200摩尔活化的PEG的比例，将不同分子量的(5-30kDa)单甲氧基PEG衍生物，如4-硝苯基碳酸PEG(NPC-PEG)添加进溶有四聚体尿酸氧化酶的0.1M、pH 10.2的碳酸钠缓冲液中。这种及其它适用的活化PEG可从Shearwater Polymers购得。有关这些PEG与蛋白的偶联反应的说明书请见因特网www.swpolymers.com上的Shearwater Polymers目录以及JM Harris，et al.，(Eds.)(1997)Poly(ethylene glycol)Chemistryand Biological Applications.ACS Symposium Series 680，Washington，DCAmerican Chemical Society。偶联反应的温度为0-8℃，直到PEG偶联程度不再随时间而变化。然后通过色谱法和/或超滤法将未反应的PEG从反应产物中去除。
每个尿酸氧化酶亚基所偶联的PEG链数确定是通过Kunitani，M，et al.，(1991)J Chromatogr 588125-137；Saifer，et al.，(1997)和Sherman，et al.，(1997)所述方法改进后确定的。简而言之，PEG化反应混合物的各成分或制备离子交换或大小分离柱上洗脱下来的部分通过室温下进行的大小分离高压液相色谱法鉴定，适用的是TSK5,000PWXL层析柱。缓冲液为pH 10.2、含0.1M NaCl的碳酸钠溶液。该高效液相层析柱购自TosoHaas，Montgomeryville，PA。通过测定紫外吸收值和利用折射率检测器检测蛋白和PEG。偶联物中的蛋白含量通过紫外吸收值计算出，以合适的未修饰的尿酸氧化酶标准溶液作为参照。偶联物中PEG的量通过折射率峰的面积计算出，所得结果以适当的PEG标准溶液的折射率峰面积为参照，最后结果是考虑了蛋白质对折射率的影响后的修正值。
图2A反应的是尿酸氧化酶的每个亚基偶联的PEG链数对PEG化猪肝尿酸氧化酶活力的改变作用。本发明的数据(▲，□)与Chen，etal.，(1981)的进行了比较。大圆圈中的数据表示的是Chen，et al.，(1981)所报道的非免疫反应性偶联物。如图2所示，每个亚基偶联6条链30kDa的PEG或7条链的50kDa的PEG的四聚体猪尿酸氧化酶偶联物保留了至少75％的未修饰酶活。随着5kDa或30kDa PEG链数的增加(大约每个亚基4条链)，尿酸分解活力明显增强的现象可能反应了未修饰的酶的可溶性或稳定性比偶联物的要差。如图2B所示，平均每个亚基偶联了5个以上30kDa的PEG的猪尿酸氧化酶偶联物所含的PEG量比Chen，et al.，(1981)发现的消除免疫反应性所需的PEG量要多一些。
实施例3四聚体重组PBC尿酸氧化酶的PEG偶联物之特性将重组猪-狒狒嵌合(PBC)尿酸氧化酶cDNA克隆入pET3d表达载体(Novagen，Madison，WI)，重组质粒结构被转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)菌株中进行表达。这些步骤按分子生物学领域常用方法实施。见Erlich(1989)；Sambrook，et al.，(1989)；Ausubel，F，et al.，(Eds.)，(1997)Short Protocols in Molecular Biology.New YorkJohn Wiley & Sons。
图6展示了推导的PBC尿酸氧化酶氨基酸序列(SEQ ID NO1的1-225位氨基酸以及SEQ ID NO2的226-304位氨基酸)，以猪的(SEQ IDNO1)及狒狒的(SEQ ID NO2)序列为对照。用粗体字表示狒狒序列与猪序列相异的氨基酸残基。Wu，et al.，(1989)首次确认了猪与狒狒的尿酸氧化酶序列本发明的研究者进一步肯定了这两种酶的序列。除缺少基因库序列中的起始的甲硫氨酰残基之外，SEQ ID NO1与Gen Bank中收录的编号为p16164的序列几乎完全一致。SEQ ID NO2除了缺少起始的甲硫氨酰残基以及Gen Bank序列第153号组氨酸(图6种的第154个氨基酸残基)变成了苏氨酸之外，几乎与Gen Bank收录的编号为p25689的序列完全一样。
分离出四聚体PBC尿酸氧化酶，将之与实施例1及实施例2所述的不同分子量的PEG相偶联。偶联用的PEG分子量为5kDa、10kDa、19kDa或30kDa，每个亚基所连的PEG链数多达10条。那些用分子量大于或等于10kDa的PEG制得的偶联物保留了未修饰重组酶的95％以上的酶活(图3A-3B)。
每个亚基偶联有将近6条链的10kDaPEG的一种四聚体PBC尿酸氧化酶偶联物的特征如标注的图所示无免疫原性(图7)以及对尿酸氧化酶缺陷型小鼠的疗效1)治疗血内尿酸过多及高尿酸尿(图8)；2)减轻尿浓缩造成的损伤(图9)；及3)减轻肾性尿崩症(图10)。另外，磁共振显微证实该PEG-尿酸氧化酶减轻了尿酸相关的肾损伤(图11)。
图7反映了腹膜注射PEG-尿酸氧化酶4或5次，每次注射24小时后取样测得的鼠血清中的PEG-尿酸氧化酶的活性，以第一次注射24小时后鼠血清中的尿酸氧化酶活力为对照。用三种不同的PBC与两种方法活化的PEG制取偶联物。其中一种偶联物(●)是在尿酸缺陷型小鼠(uox-/-)体内进行检测的，另两种(△，■)则是在正常的BALB/c鼠体内检测的。免疫反应性最高的偶联物(△)是用纯化的含有未知数量的其他聚合物的PBC尿酸氧化酶与PEG的琥珀酰亚胺基碳酸衍生物(SC-PEG)偶联制得，平均每个亚基连有7条链的5kDa的PEG。见参考文献中的Zalipsky，美国专利5,612,460。免疫反应性居中的偶联物(■)是用含11％其他聚合物的尿酸氧化酶溶液与PEG的4-硝苯基碳酸衍生物(NPC-PEG)偶联所得，平均每个亚基连有2条链的19kDa的PEG。见Sherman et al.，(1997)。免疫反应性最低的偶联物(●)是用其他聚合物含量低于5％的PBC尿酸氧化酶溶液制备的，平均每个亚基连有6条链的10kDa的NPC-PEG。
图8反映了尿酸缺陷型(uox-1-)小鼠血清及尿液中尿酸的浓度与注射的PEG-尿酸氧化酶活性的反相关关系。在时间零点进行注射，72小时后检测发现血清中含有0.43个国际单位的PBC尿酸氧化酶偶联物，该偶联物平均每个亚基上连有6条链的10kDa的PEG。
图9反映了用PEG修饰过的PBC尿酸氧化酶可以减轻尿酸缺陷型小鼠因尿酸浓缩造成的损伤。测定两只含有一份正常鼠基因的小鼠(uox+/-)、六只未处理的纯合尿酸氧化酶缺陷型小鼠(uox-/-)、以及在出生后的第3天到第72天期间注射过10次95mIU或190mIU剂量PEG-尿酸氧化酶的六只纯合尿酸氧化酶缺陷型小鼠尿液的重量克分子渗透浓度，并求其平均差和标准差。每个遗传背景的小鼠要么可以随意饮水(实心柱)，要么在收集尿液前的12个小时内禁止饮水(阴影柱)。
图10反映了PEG修饰过的PBC尿酸氧化酶可以减轻尿酸缺陷型小鼠的肾性尿崩症状，肾性尿崩的特征是动物的饮水量和排尿量均高于正常水平。所用实验小鼠的遗传背景以及处理方案同图9。对每组6只的三组小鼠的日饮水量(实心柱)及日排尿量(阴影柱)求平均差和标准差。
图11表明PEG修饰过的PBC尿酸氧化酶可以减轻尿酸缺陷型小鼠因尿酸引起的肾病，如磁共振显微所示。三组小鼠的遗传背景及处理方案同图9及图10。磁共振显微是在卡洛林纳杜尔汉姆的公爵大学医学中心的在体显微中心进行的。
除了图8-11总结的结果之外，本发明也证实了用PEG修饰过的PBC尿酸氧化酶治疗过的所有尿酸氧化酶缺陷型小鼠的尿液中的尿酸水平都明显下降。最后，图12表明，与PEG修饰过的四聚体PBC尿酸氧化酶不同的是，八聚体(分子量＝280kDa)尿酸氧化酶即便是充分PEG化后，在小鼠体内还是具有免疫原性。腹膜内注射的PEG八聚体尿酸氧化酶在注射后五天内就被清除的现象映证了这一特性。将同一只小鼠在第8天和第15天注射同样剂量的同种PEG尿酸氧化酶。24小时后，第二次及第三次注射的PEG八聚体尿酸氧化酶在鼠血清中就检测不到尿酸分解活性了，而用四聚体注射的小鼠徐轻重很容易就检测出尿酸氧化酶活性。这些发现，缀合第一次折射观察到的PEG八聚体尿酸氧化酶快速清除现象(图12)，为在将尿酸氧化酶PEG化之前应该把所有分子量比四聚体尿酸氧化酶大的聚合物除去这一经验方法提供了依据。
实施例4
单假丝酵母尿酸氧化酶的PEG偶联单假丝酵母(Candida utilis)的尿酸氧化酶可以从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO；catalog No.U1878)或Worthington BiochemicalCorporation(Freehold，NJ；catalog No.URYW)购买。步骤如实施例1和实施例2所述，分离四聚体，然后用5kDa、10kDa或30kDa的PEG合成偶联物(图1A-1B)。图1A反映了单假丝酵母PEG尿酸氧化酶每个亚基所连的PEG链数对保持酶活性的作用。本发明的数据(▲，●，□)与Nishimura，et al.，(1979)、Nishimura，et al.，(1981)、Chen et al.，(1981)、Davis，et al.，(1981)；Tsuji，etal.，(1985)；Yasuda，et al.，(1990)以及Fujita，et al.，(1991)等所得结果进行了比较。大圆圈中的数据表示的是Nishimura，etal.，(1979或1981)所报道的非抗原性偶联物。
图1B反映了单假丝酵母PEG化尿酸氧化酶每个亚基所连的PEG的量对保持酶活性的影响。本发明的数据(▲，●，□)也与图1A上的那些报道进行了比较。大圆圈中的数据所表示的偶联物同图1A中的。
如图1A及图1B所示，每个亚基平均有6条链5kDa或30kDaPEG或者连有9条链的10kDa PEG的偶联物至少保留了未修饰酶的75％的活性。随着30kDaPEG链数的增加(达到每个亚基5或6链)，偶联物的酶活明显增强的现象可能反映了未修饰酶相对于修饰后的偶联物而言，可溶性及稳定性都较差。
实施例5黄曲霉尿酸氧化酶的PEG偶联黄曲霉(Aspergillus flavus)的尿酸氧化酶可以从Sanofi Withrop(Gentilly Cédex，France)购的。步骤如实施例2所述，合成了具有不同分子量的PEG的偶联物(图4A-4B)。偶联物通过将黄曲霉尿酸氧化酶每个亚基上平均连接12链5kDa PEG或7链30kDa PEG相偶联制备，至少保留了该真菌尿酸氧化酶的75％的酶活。
实施例6大豆尿酸氧化酶的PEG偶联大豆根瘤的重组尿酸氧化酶由Tipton博士(University ofMissouri，Columbia，MO)提供，按照Kahn和Tipton(Kahn，K，etal.，(1997)Biochemistry 364731-4738)的方法从大豆根瘤(也称作根瘤35)提取和纯化所得。步骤同实施例1和实施例2，先分离四聚体，再用不同分子量PEG进行偶联(图5A-5B)。与单假丝酵母尿酸氧化酶(图1A)、猪尿酸氧化酶(图2A)、猪-狒狒嵌合尿酸氧化酶(图3A)以及黄曲霉尿酸氧化酶(图4A)相比，只有每个亚基连接将近2条链5kDa或30kDa PEG的大豆尿酸氧化酶可以保持75％以上的酶活力。
实施例7球形节杆菌尿酸氧化酶的PEG偶联球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的尿酸氧化酶购自Sigma-Aldrich(catalog No.U7128)。见日本第9-154581号专利。步骤如实施例1及实施例2所述，先分离四聚体，然后用5kDa或30kDaPEG制备偶联物。每个亚基平均偶联至少3条链5kDa PEG的偶联物保留的酶活不到60％，而每个亚基平均连接有将近2条链的30kDa PEG的偶联物保留了85％以上的酶活。
实施例8氨基端平截的猪及PBC尿酸氧化酶的PEG偶联用实施例3所述的常规方法将猪及PBC尿酸氧化酶的氨基端前6的氨基酸残基去除，并让重组尿酸氧化酶在大肠杆菌中表达并纯化。步骤如实施例1和实施例2所述，结果合成了基本上无免疫原性而保留了至少75％的酶活的截去了部分氨基酸的尿酸氧化酶偶联物。
实施例9羧基端平截或氨基端和羧基端同时平截的猪及PBC尿酸氧化酶的PEG偶联用实施例3所述的常规方法将猪及PBC尿酸氧化酶的羧基端最后3个氨基酸去除，并让重组尿酸氧化酶在大肠杆菌中表达并纯化。这种羧基端的截短可能增加了酶的可溶性，因为去除了过氧化物酶体靶向信号。见Miura，et al.，(1994)。步骤如实施例1和2所述，合成了基本上无免疫原性而保留了75％以上酶活性的羧基端发生平截的尿酸氧化酶PEG偶联物。图6显示了氨基端截去6个残基，羧基端截去3个残基的重组PBC尿酸氧化酶(PBC-NT-CT)的氨基酸序列。该尿算酶按照实施例1、2及实施例3所述方法进行表达、纯化以及PEG化，结果制得了基本上无免疫原性而保留了75％以上的酶活的偶联物。
实施例10具有更多PEG缀合位点的猪尿酸氧化酶突变体的PEG偶联用实施例3所述方法制备重组猪尿酸氧化酶，通过将一个或一个以上的精氨酸残基用赖氨酸代替的方式增加了潜在的PEG缀合位点。见Hershfield，MS，et al.，(1991)Proc Natl Acad Sci USA 887185-7189。这种突变体的一个实施例(PKS尿酸氧化酶)的氨基酸序列中的291位精氨酸被赖氨酸所替代，301位苏氨酸被丝氨酸所代替，如图6所示。步骤同实施例1和实施例2，该偶联物基本无免疫原性而保留了75％以上的酶活。
实施例11重组狒狒尿酸氧化酶突变体的PEG偶联用实施例3的分子生物学常规方法构造出97位发生一个氨基酸的替代(苏氨酸被组氨酸代替)的重组狒狒尿酸氧化酶(见图6中的狒狒序列)。步骤同实施例1、2所述，结果合成了免疫原性显著下降而保留了75％以上的酶活的四聚体重组狒狒尿酸氧化酶PEG偶联物。
实施例12单假丝酵母、黄曲霉及球节细菌的PEG尿酸氧化酶偶联物的免疫原性按照实施例4、5及实施例7所述方法获得单假丝酵母、黄曲霉及球节细菌的尿酸氧化酶。步骤同实施例1、2所述，用5kDa、10kDa、20kDa或30kDa的PEG制备尿酸氧化酶偶联物。结果这些偶联物的免疫原性显著降低或基本上消除。
序列表<110>Williams，L.DavidHershfield，Michael S.
Kelly，Susan J.
Saifer，Mark G.P.
Sherman，Merry R.
<120>PEG尿酸氧化酶接合物及其应用<130>MVIEW.001VPC<140>
<141>
<150>09/130,392<151>1998 08-06<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>304<212>蛋白质<213>野猪<400>1Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe1 5 10 15Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln20 25 30Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln35 40 45Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp50 55 60Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys65 70 75 80Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu85 90 95His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val100 105 110Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val115 120 125His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu130 135 140Gln Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu145 150 155 160Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp165 170 175Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln180 185 190Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu195 200 205Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly210 215 220Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr225 230 235 240Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met245 250 255
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权利要求
1.一种从尿酸氧化酶溶液中分离四聚体尿酸氧化酶的方法，所述溶液包含四聚体尿酸氧化酶和尿酸氧化酶凝集物，包括步骤将所述溶液加到至少一个分离柱上，分离柱的pH介于约9-10.5；从所述柱子上收集一份或多份洗脱级分，级分含有分离的四聚体尿酸氧化酶，其中所述一份或多份的级分基本不含尿酸氧化酶凝集物。
2.权利要求1的方法，其中所述尿酸氧化酶的溶液被加到pH为10.2的所述柱子上。
3.权利要求1的方法，其中所述分离是以选自离子交换和体积排阻的特性为基础的。
4.权利要求1的方法，还包括分析所述级分的步骤以便确定选自所述四聚体尿酸氧化酶的存在和四聚体尿酸氧化酶凝集物的缺乏的至少一种特性。
5.权利要求4的方法，其中分析步骤包括选自层析、离心、光散射和电泳中的至少一种。
6.权利要求5的方法，其中所述层析法是高效液体色谱法。
7.权利要求1的方法，其中所述分离出的四聚体尿酸氧化酶含有少于约10％的尿酸氧化酶凝集物。
8.由权利要求1的方法得到的分离的四聚体尿酸氧化酶。
9.一种缀合物，包含与聚乙二醇缀合的尿酸氧化酶，其中聚乙二醇的平均分子量为10000-100000道尔顿，并且其中该缀合物相对于未缀合的尿酸氧化酶仍保留至少约75％的裂解尿酸的活性，而且该尿酸氧化酶的免疫原性显著降低。
10.权利要求9的缀合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量为约20000道尔顿。
11.权利要求9的缀合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量为约10000道尔顿。
12.权利要求9的缀合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量为约30000道尔顿。
13.权利要求9的缀合物，其中尿酸氧化酶是四聚体。
14.权利要求9的缀合物，其中所述尿酸氧化酶缀合物由含不超过约10％非四聚体凝聚的尿酸氧化酶的尿酸氧化酶制备。
15.权利要求9的缀合物，其中缀合物含有少于约10％的尿酸氧化酶凝聚物。
16.权利要求9的缀合物，其中聚乙二醇的分子量为约10KD-约100KD。
17.权利要求9的缀合物，其中每个尿酸氧化酶亚基上共价缀合的聚乙二醇链的数目为2-10个。
18.权利要求17的缀合物，其中聚乙二醇的分子量不超过约10KD且小于约100KD。
19.权利要求9的缀合物，其中尿酸氧化酶是哺乳动物尿酸氧化酶。
20.权利要求9的缀合物，其中尿酸氧化酶是猪肝、牛肝或绵羊肝的尿酸氧化酶。
21.权利要求9的缀合物，其中尿酸氧化酶是重组的。
22.权利要求9的缀合物，其中尿酸氧化酶基本上含有猪肝、牛肝、绵羊肝或狒狒肝的尿酸氧化酶序列。
23.权利要求9的缀合物，其中尿酸氧化酶是嵌合体。
24.权利要求23的缀合物，其中嵌合尿酸氧化酶含有猪肝和狒狒肝尿酸氧化酶的一部分。
25.一种用来降低体液或组织中尿酸水平的药物组合物，包括权利要求9的缀合物和药学上可接受的载体。
全文摘要
一种从尿酸氧化酶溶液中分离四聚体尿酸氧化酶的方法，所述溶液包含四聚体尿酸氧化酶和尿酸氧化酶凝集物，包括步骤将所述溶液加到至少一个分离柱上，分离柱的pH介于约9－10.5；从所述柱子上收集一份或多份洗脱级分，级分含有分离的四聚体尿酸氧化酶，其中所述一份或多份的级分基本不含尿酸氧化酶凝集物。
文档编号C12N9/02GK1896231SQ20061008413
公开日2007年1月17日 申请日期1999年8月2日 优先权日1998年8月6日
发明者L·D·威廉斯, M·S·赫尔斯菲尔德, S·J·凯利, M·G·P·塞菲尔, M·R·舍尔曼 申请人:山景药品公司, 杜克大学