专利名称：一套检测人博卡病毒的荧光定量pcr引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物检测技术、尤其是下呼吸道感染人博卡病毒的核酸检测技术范畴。本 发明涉及一套检测人博卡病毒的荧光定量PCR引物和探针，该套探针的序列及用途。
背景技术：
博卡病毒(Human Bocavirus)是最近从小儿下呼吸道感染分泌物中分离到的一种新人细 小病毒(Parvovirus)。据报道瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院的TobiasAllander儿童医院的 医生在对540名儿童下呼吸道感染患者进行治疗时发现的。在这批儿童患者中，17名儿童体 内存在这种新病毒，瑞典医生将之命名为"博卡病毒"。小儿下呼吸道感染可以由不同病毒引 起，其中包括呼吸道合胞体病毒、流感病毒、腺病毒及冠状病毒。迄今为止，约10-39%的小 儿下呼吸道感染的病因为未知。新分离的人博卡病毒被认为至少是引起5%比例的小儿下呼 吸道感染的病因。据世界卫生组织统计，下呼吸道感染是全世界范围内造成五岁以下儿童死 亡的主要疾病，患儿常表现出一般气喘病的症状。在美国，下呼吸道感染是小儿住院治疗的 首要疾病，每年约有二百五十万病人。在中国，每年由于不明原因导致儿童住院治疗的人数 也逐年上升。尽管病毒感染是小儿下呼吸道感染的重要原因，但在临床上，有相当比例的小 儿下呼吸道感染病因不明。博卡病毒的发现无疑对小儿下呼吸道感染的病因研究和下呼吸道 感染的诊治提供了新的科学依据。
临床上对于感染性新发致病体快速、准确的检测是诊断和治疗的关键。人博卡病毒是2005 年才发现的一种感染儿童下呼吸道病毒，因此，针对该病毒的鉴定还没有一个快速、有效的 方法。目前，对于人博卡病毒的检测和鉴定的报道只有Xiaoming Ma等运用PCR技术检测 318例临床样本，阳性检出率为5.7%。本课题组对人博卡病毒中的VP2基因进行成功表达， 并将纯化的抗原结合Western Blot和ELISA技术，建立了该病毒的蛋白质水平检测体系。荧 光定量PCR技术是近些年发展起来的分子生物学技术，以其快速、准确、可以定量等特点被 广泛应用到各种检测体系中。本研究的目的是通过已报道的人博卡病毒基因序列，选取NS1 基因中的约80bp片断，设计引物和检测探针，建立人博卡病毒的荧光定量PCR检测方法。
发明内容
本发明提供了一套用于检测人博卡病毒的荧光定量PCR的引物和探针，引物和探针长度 在20—30碱基之间。引物和探针序列5'或3'末端经化学标记(修饰)不同的基团，尤其是 探针5'端标记FAM或其他荧光基团，3'端标记TAMRA或其他荧光淬灭基团。 上游弓I物AGC TTT TGT TGA TTC AAG GCT ATA ATC 下游引物TGTTTCCCGAATTGTTTGTTCA 探针 TCT AGC CGT TGG TCA CGC CCT GTG
此外，本发明还提供了上述寡核苷酸探针的用途，利用一套引物和探针可对样品中的人博卡 病毒相应基因进行检测，尤其适用于基于荧光定量PCR技术的检测
具体的说，本发明内容是这样实现的
根据GenBank上人博卡病毒全基因组序列(NC 007455)，应用VECTORNTI SUITE 9、 PRIMER5.0等程序设计检测NSl基因的引物和TaqMan探针。引物和探针序列长度在20-30 碱基之间。
利用上述的一套引物和探针，可以通过荧光定量PCR反应对样品中的人博卡病毒进行检 测，具有较高的灵敏度和特异性。
本发明提供的引物和探针能够快速、准确、高效地检测出样品中的人博卡病毒。如果制 备成相应的试剂盒，可以广泛用于临床疾病的诊断、抗病毒药物筛选、环境监测与评价、卫 生监督与食品检疫、流行病学调査等方面。
图1为人博卡病毒基因片段重组质粒的IO倍梯度稀释液(5.0X10' 5.0Xl(^拷贝/mL7)作为 标准模板进行荧光定量PCR扩增的结果。卜7号分别为5.0X10' 5.0Xl(^拷贝/mL，对应的 CT值分别为22、 24、 27、 30、 33、 36、 39
图2为博卡病毒荧光定量PCR标准曲线标准曲线为Y=-2。 264xlgX+36.879; Y:对应的 CT值；X:标本的拷贝数
图3为博卡病毒荧光定量PCR检测临床样本的结果。图中样本编号为WL108、WL102、WL211、 WL223、 WL226对应的CT值分别为19、 24、 27.5、 27.5、 29
具体实施例方式
为了进一步说明一套检测人博卡病毒的荧光定量PCR引物和探针的实施方式和用途，参 照以下实施例进行说明。实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明的范围，本领域技 术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例1.荧光定量PCR检测儿童下呼吸道感染博卡病毒 1引物和探针的特异性
引物和探针的特异性是本实验建立的检测方法中最重要的因素。根据GenBank中人博卡 病毒序列，选取NS1特异性基因设计引物和探针，通过BLAST比对，结果显示无论是设计 的引物还是检测探针的序列均具有很高的特异性，完全达到检测人博卡病毒的要求。 2建立标准曲线的结果
将重组的人博卡病毒重组质粒进行10倍梯度稀释成5.0X 101 5.0X 107拷贝/mL 7个浓度 后，进行定量PCR扩增。检测的灵敏度可达到5.0X10'拷贝/mL，将阳性梯度的模板浓度和 对应的CT值进行标准曲线的计算，标准曲线为Y=-2.264xlgX+36.879;其中Y:对应的CT 值；X:标本的拷贝数。通过标准曲线可以将未知样本中的人博卡病毒进行定量测定。标准 曲线的扩增见附图1;标准曲线的计算结果见附图2。 3临床样本的检测结果
分别对样本吸痰组和样本咽拭子组进行定量PCR检测，结果显示样本咽拭子均无阳性结果出 现，而样本吸痰组的检测结果中，有5例阳性结果，检测的阳性率达到2.84%， 5例样本编 号分别为WL108、 WL102、 WL2U、 WL223、 WL226，通过标准曲线对检测的模板进行定量， 结果感染人博卡病毒的浓度分别为3.95X109、 1.46X 107、 6.95X10S、 6.94X 105 、 5.45X 104。 定量PCR扩增结果见附图3，感染人博卡病毒阳性病例的临床症状和相关信息见表1。
表1感染人博卡病毒阳性病例的临床症状和相关信息
编 号样本号年龄性别样本类型临床症状
1WL10832个月男吸痰发热1天，咳嗽10天，咳加剧3天
2WL10213个月女吸痰咳嗽伴发热10余天
3WL2212岁男吸痰发热咳嗽2天
4WL2233岁女痰发热3天
5WL2263岁男痰发热、咳嗽5天
以上实施例的技术要点如下:
1临床样本收集及模板的制备
本实验共收集240例临床样本，分别来自温岭市第一人民医院儿科住院患儿的吸痰或咽 拭子，对其根据样本的来源类型进行分类，分为样本吸痰组和样本咽拭子组。将吸痰的样本 用3倍体积的NaOH消化，离心取上清，-20'C保存，待用；咽拭子的样本用PBS缓冲液清 洗后，10000rpm离心5分钟，弃上清，加入去离子水，煮沸10分钟，10000rpm离心3分钟， 取上清，-2(TC保存，待用。
实验所用的酶和其他分子生物学拭剂均购自宝生物(大连)有限公司；荧光定量PCR仪 使用PE公司5700。 2引物和探针的设计
根据GenBank上人博卡病毒全基因组序列(NC 007455)，选取NS1基因设计引物和 TaqMan探针，引物和探针的合成均由军事医学科学院放射与辐射医学研究所九室合成，引物 和探针的序列见表2。
表2引物和探针的序列名称序列(5，-3，)位点
上游引物FAGC TTT TGT TGA TTC AAG GCT ATA ATC1418-1444
下游引物RTGT TTC CCG AAT TGT TTG TTC A1504-1478
探针FAM-TCT AGC CGT TGG TCA CGC CCT GTG-TAMRA1446-1469
3荧光定量PCR扩增
PCR反应扩增体系10Xbuffer， 5.0ul; Mg2+， 3.5mM; dNTP， 200uM;上下游引物均 为0.2uM;TanMan探针，50nM; Taq酶，1.25U;模板，2.0ul;加去离子水至50ul。 PCR反 应为94°C 5min; 94°C 15s 、 58°C 45s，共40循环。 4标准曲线的建立
将人博卡病毒VP2基因克隆重组到杆状病毒(BacHBoVCap)中，计算出初始拷贝数， 然后进行10倍梯度稀释成5.0X 10匕5.0X 104考贝/mL。 PCR扩增反应条件同上。
权利要求
1.一套用于检测人博卡病毒的荧光定量PCR的引物和探针，引物和探针长度在20-30碱基之间。上游引物AGC TTT TGT TGA TTC AAG GCT ATA ATC下游引物TGT TTC CCG AAT TGT TTG TTC A探针TCT AGC CGT TGG TCA CGC CCT GTG
全文摘要
一套检测人博卡病毒的荧光定量PCR引物和探针，属于微生物检测技术领域(生物工程类检测产品)。该套引物和探针根据GenBank上人博卡病毒全基因组序列(NC 007455)设计，寡核苷酸序列长度在20-30碱基之间，具有较高的灵敏度和特异性。利用该套引物和探针，在一定条件下，可对样品中的人博卡病毒相应基因进行检测，尤其适用于基于荧光定量PCR技术的检测。该套引物和探针可用于多种方面，如临床疾病诊断、抗病毒药物筛选、环境监测与评价、卫生监督与口岸卫生检疫、流行病学调查等。
文档编号C12Q1/68GK101096704SQ200610083499
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月1日 优先权日2006年6月1日
发明者杨宁敏, 峰 林 申请人:杭州致远医学检验所有限公司;温岭市第一人民医院