一种具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株的构建的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株的构建，属于酶工程领域。通过把酿酒酵母TDH3启动子序列、酵母分泌信号肽编码序列、柚苷酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列按顺序合成，在两端加上限制性内切酶位点，通过酶切构建到pPIC9K质粒中，再将该质粒转化到酵母中得到具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株，其生产柚苷酶的回收率达到92%，发酵后柚苷酶的酶活达到5.0U/g湿酵母。本发明实现了柚苷酶生产和同步浓缩回收的一步完成，降低了能源消耗，降低了成本，具有较强的实用性。
【专利说明】一种具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株的构建
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于酶工程领域，具体涉及一种具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株的构建。
【背景技术】
[0003]中国柑桔的产量仅仅比美国和巴西低，柑桔的产量排列在世界第三位。利用柑桔生产的果汁饮料具有含糖量高，风味清香醇和等特点。而且柑桔果汁具有易于榨取等便于工业化生产和加工的特点，可以用来生产果酒等高附加值的产品。但是柑桔果汁常常具有很浓烈的苦味，该苦味大大限制了果汁的利用和产品的推广。去除苦味的柑桔果汁，才能有更广阔的市场和利用空间。
[0004]利用柚苷酶可以把果汁中的苦味有效地去除掉。柚苷酶的生产有固体发酵和液体发酵两种方法。固体发酵虽然酶的浓度高，但是其传质和传热阻力非常大。传质和传热阻力大的固体发酵，非常不利于大规模的工业化生产，因为其温度和酸度等在工业化规模中不容易控制。
[0005]液体发酵具有发酵体积大，易实现自动化控制等特点，因而液体发酵在许多产品的生产上体现出巨大优势。特别是在现在劳动力成本上升，国际大力推进机械化和自动化背景下，液体发酵具有 更广阔的空间。柚苷酶的生产也有越来越倾向于液体发酵。但是液体发酵生产的酶类产品浓度低。生产的柚苷酶等都游离在发酵醪液中，为得到高浓度的柚苷酶的固体粉末，需要对发酵醪液进行浓缩。为纯化浓缩纤维素酶往往需要通过真空蒸发或喷雾干燥等工艺来浓缩纤维素酶。在纤维素蒸发浓缩或喷雾干燥的过程中，柚苷酶的活性丧失一部分，而且浓缩工艺大幅度提高了纤维素酶的生产成本。在蒸发或喷雾干燥的过程中，消耗大量的能源如电或燃气等。因此降低浓缩成本，成为降低液体发酵生产柚苷酶生产成本的必然选择。
【发明内容】
[0006]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株。
[0007]本发明的另一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的DNA片段。
[0008]本发明的再一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的质粒。
[0009]本发明的目的还在于提供上述酵母菌株的构建方法。
[0010]本发明的目的通过下述技术方案实现:
用于构建具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株的DNA片段，包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、柚苷酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列；上述序列分别如SEQID N0.1~5所示。
[0011]优选的，所述的用于构建具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ ID N0.6所示。
[0012]用于构建具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株的质粒为包含上述DNA片段的真核表达质粒。所述的真核表达质粒优选为pPIC9K质粒。
[0013]所述的用于构建具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株的质粒通过包含如下步骤的方法制备得到:合成两端有限制性内切酶识别位点含有上述DNA片段的序列，通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。所述的真核表达质粒PPIC9K质粒时，限制性内切酶优选为Aat II和Not I。
[0014]一种具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株，含有上述质粒。所述的酵母菌株优选为酵母菌株SMDl 168。
[0015]所述的具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株的构建方法，包括如下步骤:制备酵母电转化感受态细胞，将上述质粒通过电转化转进酵母中得到。
[0016]本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
本发明的酵母菌株能在生产柚苷酶的同时，把柚苷酶吸附在菌株自身表面，通过简单过滤，就能达到浓缩柚苷酶的目的。
[0017]本发明大大简化了柚苷酶的浓缩工艺，降低了能源消耗，大幅度降低了成本，因此该发明具有较强的实用性。
[0018]本发明把柚苷酶基因在酵母内表达，并实现了柚苷酶生产和同步浓缩回收的一步完成，现有技术未有相关报道，具有较高的创新性。
[0019]本发明酵母菌株生产柚苷酶的回收率达到92%，发酵后柚苷酶的酶活达到5.0 U/g湿酵母。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0021]实施例1
(l)pPIC9K质粒的提取
I)接1%含PPIC9K质粒的大肠杆菌细胞于2 mL LB培养基。
[0022]2)37 °C振荡培养 12 h。
[0023]3)取1.5 mL菌液于EP管，以4000 rpm离心3 min,弃上清液。
[0024]4)加 0.1 mL 溶液 I (1% 葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0,25 mM Tris-HCl pH 8.0)充分混合。
[0025]5)加入0.2 mL溶液II (0.2 mM NaOH, 1% SDS),轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min。
[0026]6)加入0.15 mL预冷溶液111(5 mol/L KAc, pH4.8),轻轻翻转混匀,冰浴5 min。
[0027]7)以10000 rpm离心20 min，取上清液于另一新EP管中。
[0028]8)加入等体积的异戊醇，混匀后静置10 min。
[0029]9)再以 10000 rpm 离心 20 min,弃上清。
[0030]10)用70%乙醇0.5 mL洗涤一次,抽干所有液体。[0031]11)待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE缓冲液中。
[0032](2)大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备
I)将大肠杆菌DH5a置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37 °C下过夜培养。
[0033]2)高温灭菌大的离心瓶(250~500 mL)以备第二天摇瓶用。
[0034]3)准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。
[0035]4)转移0.2~I mL过夜培养物至装有20 mL LB (或其他营养丰富的培养基)的100 mL摇瓶。
[0036]5)37 1:下剧烈振荡培养6小时。
[0037]6)监控0D600值(培养I小时后每半小时测定一次)。
[0038]7)当0D600值达到0.5~1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15分钟。
[0039]8)细胞在4 V 5000g下离心15分钟，弃上清液。
[0040]9)用灭菌的冰水重悬浮细胞，先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。
[0041]10)照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
[0042]11)照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
[0043]12)离心，弃上清液。
[0044]13)用20 mL灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞。
[0045]14)照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)。
[0046]15)用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2~3 mL。
[0047]16)将细胞按150 μ L等份装入微量离心管，于-80 °C保存。
[0048](3) pPIC9K-Naringinase 粒构建
I)用限制性内切酶Aat II ,Not I分别酶切质粒PPIC9K。限制性内切酶Aat I1、Not I(TAkaRA)各 1.5 μ?，提取的 pPIC9K 质粒溶液 6 μ?, IOXK Buffer I μ? 加入到 100 μ? EP管中，在30 °C水浴锅中酶切60 min。再通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切的质粒pPIC9K，回收条带为9.25 kb左右。
[0049]2)序列合成
合成两端具有Aat II和Not I识别序列的序列，序列包括CCGACGTC-酿酒酵母TDH3启动子序列-酿酒酵母分泌信号肽编码序列-柚苷酶编码序列-酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列-酿酒酵母TDH3终止子序列-GCGGCCGCGG，各片段及全长片段如SEQ ID N0.1~6所示。
[0050]3)连接
合成的碱基序列 20 μ?, Aat I1、Not I (TAkaRA) 12 μ?, IOXK Buffer 加入到 400 μ?EP管中，在30 °C水浴锅中酶切80 min，酶切后，取序列酶切液15μ?，酶切的pPIC9K质粒5μ?, Τ4 DNA ligase (TAkaRa) 5μ?，IOXbuffer 5μ?, ddH20 ΙΟμ?，加入 100 μ? EP 管中，16
°C连接过夜。
[0051]4)将上述连接产物电转化到大肠杆菌DH5 α，电转化具体方法如下:
4.1)在冰上解冻大肠杆菌DH5 α感受态细胞添加I~10 μ L连接产物，冰上放置约5分钟。
[0052]4.2)转移连接产物/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器中。[0053]4.3)加载电转化仪，准备好300 yLLB*2XYT。
[0054]4.4)对电穿孔容器进行脉冲(200欧姆，25 μ F，2.5千伏)，检查时间常数，应该在3以上。
[0055]4.5)立即添加300 μ L的LB或2ΧΥΤ至电转杯中。
[0056]4.6)37 °C下培养细胞40分钟至I小时以复苏。
[0057]4.7)复苏后离心弃掉150 μ L上清，剩余150 μ L重悬菌体涂布到含有氨苄(100Kg/mL)的LB或2XYT培养基的固体平板上，于37 °C培养过夜。
[0058]5)挑去固体平板上生长的单克隆，通过培养，提取质粒，用Aat II和FspA I对质粒进行酶切鉴定，鉴定正确的质粒再进一步测序，得到质粒pPIC9K-Naringinase。
[0059](4)酵母感受态细胞的制备
1)挑一环酵母菌(SMD1168)接种于5 mL YEPD培养基中，30 V 250~300 rpm培养过夜得到一级种子。
[0060]2)取I mL—级种子分别接种于两瓶50 mL YEPD培养基中，30 V 250~300 rpm培养约 16 ~18 h (0D600 约 1.3 ~1.5)。
[0061]3)于4 °C离心收集菌体，用25 mL冰预冷无菌水洗涤一次后，细胞用10 mL冰预冷无菌水重悬，可换成较小的离心管。
[0062]4)加入I mL pH 7.5的10XTE缓冲液，摇晃均匀，再加入I mL IOXLiAc,旋转摇匀，于30 1:轻轻摇动45 min。
[0063]5)再加入0.4 mL 1mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30 °〇轻轻摇动15 min。
[0064]6)于4 °C离心，弃上清(用枪吸)，再用25 mL冰预冷无菌水洗涤。
[0065]7) 2.5 mL冰预冷的I mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清(用枪吸)。
[0066]8)每管用100 yL I mol/L山梨醇溶解，分装于3个EP管中(80 yL/管)，于_70°C冰箱保存。
[0067](5) pPIC9K-Naringinase 质粒电转化酵母
1)向酵母感受态细胞中加入约5~10 μ g (体积小于10 μ L) pPIC9K_Naringinase质粒，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min。
[0068]2)擦干电转杯，电击，电击参数:1.5 KV，25 yF，200欧姆。
[0069]3)立即加入I mL冰预冷的I mol/L山梨醇，转移至离心管中，于30 °C静置lh。
[0070]4)离心，弃上清，加入I mL YEPD后，于30 °C>200 rpm培养2 h。
[0071]5)离心得菌体后，吸除550 μ L上清液，然后取150 μ L涂100 Pg/mL氨苄YETO板于30 °C培养至长出转化子。
[0072](6)酵母转化子发酵
挑取的转化子在YEro培养基中30 °C培养24 h，以10%接种量(v/v)接种于发酵培养基(酵母浸膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，50 mM柠檬酸缓冲液，麸皮200 g/L，羟甲基纤维素20g/L，l L水)中。发酵在500 mL摇瓶中发酵，装液量为20% (v/v)。在发酵培养基中培48h0
[0073](7)柚苷酶的回收
发酵液在离心机中4000 r/m离心10 min，收集上清(上清中有游离的柚苷酶，用于柚苷酶回收率的计算)，按酵母沉淀湿重与蒸馏水质量比1:10的比例加入蒸馏水，用蒸馏水洗涤两次，收集酵母沉淀，柚苷酶吸附在酵母表面。
[0074](8)柚苷酶酶活测定:试管中分别加入2 mL pH 4.0,0.1 M醋酸一醋酸钠缓冲溶液，2 mL质量浓度400 mg/L的柚皮苷溶液，40 °C下保温5 min，加入预先稀释的酶液I mL，保温10 min，立即用沸水浴灭活10 min，高效液相色谱法测定剩余柚皮苷的量，通过计算可得柚皮苷的减少量。色谱条件:色谱柱为大连依利特C18 Hypersil (250 mmX4.6 mm, 5Ixm);流动相为甲醇:5%乙酸溶液(55:45);流速I mL/min ;检测波长283 nm ;柱温30 °C。
[0075]酶活定义为:在40 °C，pH值4.0条件下，每分钟分解I Pg柚皮苷的酶量为I U。
[0076]柚苷酶回收率(％)=酵母沉淀吸附的酶活/(上清液的酶活+酵母沉淀吸附的酶活)X 100%O
[0077]经过测定柚苷酶的回收率达到92%，发酵后柚苷酶的酶活达到5.0 U/g湿酵母。柚苷酶较高的回收率，说明在发酵的时候，构建的酵母能很好的富集浓缩柚苷酶，实现了发酵和浓缩的一步完成。
[0078]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都 包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.用于构建具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株的DNA片段，其特征在于:包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、柚苷酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列。
2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的序列分别如SEQID N0.1~5所示。
3.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的DNA片段的序列如SEQIDN0.6所示。
4.用于构建具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株的质粒，其特征在于:为包含权利要求1-3任一项所述的DNA片段的真核表达质粒。
5.根据权利要求4所述的质粒,其特征在于:所述的真核表达质粒为pPIC9K质粒。
6.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于通过包含如下步骤的方法制备得到:合成两端有限制性内切酶识别位点含有权利要求1-3任一项所述的DNA片段的序列，通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。
7.根据权利要求6所述的质粒,其特征在于:所述的真核表达质粒为pPIC9K质粒时，限制性内切酶为Aat II和Not I。
8.一种具有生产和回收柚苷酶双重功能的酵母菌株，其特征在于:包含权利要求4-7任一项所述的质粒。
9.根据权利要求8所述的酵母菌株，其特征在于:所述的酵母菌株为酵母菌株SMDl168。
10.权利要求8或9所述的酵母菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤:制备酵母电转化感受态细胞，将权利要求4-7任一项所述的质粒通过电转化转进酵母中得到。
【文档编号】C12N1/19GK103789332SQ201410084899
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】薛栋升, 陈茂彬, 汪江波 申请人:湖北工业大学