生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株及其构建的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株及其构建，属于酶工程领域。通过把酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、具有纤维素内切活性和葡糖苷酶活性的序列、酿酒就酵母TDH3终止子序列按顺序合成，在两端加上限制性内切酶位点，通过酶切构建到pPIC9K质粒中，再将该质粒转化到酵母中得到生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株。本发明实现了纤维素内切酶和葡糖苷酶活性的蛋白在酵母菌中的表达，具有较强的实用性。本发明的酵母菌株生产的纤维素内切酶和葡糖苷酶的活性达1.2U/mL和0.3U/mL。
【专利说明】生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株及其构建
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于酶工程领域，具体涉及一种生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株及其构建。
【背景技术】
[0003]纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源，是缓解能源危机，实现人类可持续发展的关键。
[0004]纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡糖苷酶的共同作用。其中内切酶降解长片段的纤维素成为二聚体，是纤维素降解的关键步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色、条件温和、转化率高的特点，但是纤维素酶较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。
[0005]降低纤维素酶成本一个有效的方法是提高酶的利用效率。由于纤维素的降解需要三种酶的协同作用，具有两种功能或多种功能的蛋白能显著地提高纤维素酶的利用效率，从而降低纤维素酶工业化利用的成本。同时纤维素酶的稳定性越好，纤维素酶能更长时间的降解纤维素，因此具有更大的应用价值。
【发明内容】
[0006]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株。
[0007]本发明的另一目的在于提供用`于构建上述酵母菌株的DNA片段。
[0008]本发明的再一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的质粒。
[0009]本发明的目的还在于提供上述酵母菌株的构建方法。
[0010]本发明的目的通过下述技术方案实现:
用于构建生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的DNA片段，包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、具有纤维素内切酶和葡糖苷酶活性的序列、酿酒酵母TDH3终止子序列；上述序列分别如SEQ ID N0.1~4所示。
[0011]优选的，所述的用于构建生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ ID N0.5所示。
[0012]用于构建生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的质粒为包含上述DNA片段的真核表达质粒。所述的真核表达质粒优选为PPIC9K质粒。
[0013]所述的用于构建生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的质粒优选通过包含如下步骤的方法制备得到:合成两端有限制性内切酶识别位点含有上述DNA片段的序列，通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。所述的真核表达质粒为PPIC9K质粒时，限制性内切酶优选为Aat II和Not I。
[0014]一种生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株，含有上述质粒。所述的酵母菌株优选为酵母菌株SMDl 168。
[0015]所述的生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的构建方法，包括如下步骤:制备酵母电转化感受态细胞，将上述质粒通过电转化转进酵母中得到。
[0016]本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
本发明构建了一个有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性的蛋白。同时，本发明把具有纤维素内切酶和葡糖苷酶活性的蛋白在酵母菌中实现了高效表达，纤维素内切酶和葡糖苷酶的活性达1.2 ~!1^和0.3 U/mL，进一步降低了纤维素酶的工业化利用成本。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0018]实施例1
A、大肠杆菌pPIC9K质粒提取
(I)接1%含PPIC9K质粒的大肠杆菌细胞于2 mL LB培养基。
[0019](2)37 °〇振荡培养 12 h。
[0020](3)取1.5 mL菌体`于EP管，以4000 rpm离心3 min,弃上清液。
[0021](4)加 0.1 mL 溶液 I (1% 葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0,25 mM Tris-HCl pH 8.0)充分混合。
[0022](5)加入0.2 mL溶液11(0.2 mM NaOH, 1% SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min。
[0023](6)加入0.15 mL预冷溶液111(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,冰浴5 min。
[0024](7)以10000 rpm离心20 min，取上清液于另一新EP管。
[0025](8)加入等体积的异戊醇，混匀后静置10 min。
[0026](9)再以 10000 rpm 离心 20 min,弃上清。
[0027](10)用70%乙醇0.5 mL洗涤一次,抽干所有液体。
[0028](11)待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE缓冲液中。
[0029]B、pPIC9K-END 质粒构建
(I)用限制性内切酶Aat II ,Not I分别酶切质粒PPIC9K。限制性内切酶Aat I1、Not I(TAkaRA) 3 μ?，提取的 pPIC9K 质粒溶液 6 μ?, IOXK Buffer 加入到 100 μ? EP 管中，在30 °C水浴锅中酶切60 min。
[0030](2)序列合成
合成两端具有Aat II和Not I识别序列的序列CCGACGTCGG-酿酒酵母TDH3启动子-酿酒酵母分泌信号肽编码序列-具有纤维素内切酶和葡糖苷酶活性的序列-酿酒酵母TDH3终止子序列-TTGCGGCCGCAACC，各片段及全长片段序列如SEQ ID N0.1~5所示。
[0031](3)连接
合成的碱基序列 20 μ?, Aat I1、Not I (TAkaRA) 12 μ?, IOXK Buffer 加入到 400 μ?EP管中，在30 °C水浴锅中酶切80 min，酶切后，取序列酶切液15μ?，酶切的pPIC9K质粒5 μ?,?4 DNA Iigase(TAkaRa) 5μ?，IOXbuffer 5PL，ddH20 ΙΟμ?，加入 100 μ? EP 管中，16°c连接过夜。
[0032](4)转化到大肠杆菌，按照A提取质粒，得到质粒PPIC9K-END。
[0033]C、电转化感受态细胞制备
(I)将E.coli DH5a置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37 °C下过夜培养。
[0034](2)高温灭菌大的离心瓶(250-500 mL)以备第二天摇瓶用。
[0035](3)准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。
[0036](4)转移0.2-1 mL过夜培养物至装有20 ml LB (或其他营养丰富的培养基)的100 mL摇瓶。
[0037](5)37 °〇下剧烈振荡培养6小时。
[0038](6)监控0.D.600值(培养I小时后每半小时测定一次)。
[0039](7)当0.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15分钟。
[0040](8)细胞在4 V 5000 g下离心15分钟，弃上清液。
[0041](9)用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。
[0042]( 10)照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
[0043]( 11)照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
[0044](12)离心，弃上清液。
[0045](13)用20 mL灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞。
[0046](14)照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)。
[0047](15)用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3 mL。
[0048](16)将细胞按150 μ L等份装入微量离心管，于-80 °C保存。
[0049]D、电转化
(I)在冰上解冻电转化感受态细胞添加1-10 μ L PPIC9K-END质粒，冰上培育约5分钟。
[0050](2)转移DNA/细胞混合物至冷却后的2 mm电穿孔容器中。
[0051](3)加载电转化仪，准备好300 yLLB或2XYT。
[0052](4)对电穿孔容器进行脉冲(200欧姆，25 μ Fd, 2.5千伏)(检查时间常数，应该在3以上)。
[0053](5)立即添加300 UL的LB或2ΧΥΤ至电穿孔容器中。
[0054](6)37 °C下培养细胞40分钟至I小时以复苏。
[0055](7)转移细胞至含有氨苄(100 Pg/mL)选择培养基上培养。
[0056]D、质粒转化酵母菌株
酵母电转化感受态细胞的制备
(I)挑一环酵母菌(SMD1168)接种于5 mL YEPD培养基中，30 °C >250-300 rpm培养过夜得到一级种子。
[0057](2)取I mL—级种子分别接种于两瓶50 mL YEPD培养基中，30 °C >250-300 rpm培养约 16-18 h (0D600 约 1.3-1.5)。
[0058](3)于4 °C离心收集菌体，用25 mL冰预冷无菌水洗涤一次后，细胞用10 mL冰预冷无菌水重悬，可换成较小的离心管。[0059](4)加入I mL pH 7.5的10XTE缓冲液，摇晃均匀，再加入I mL IOXLiAcJ^R摇匀，于30 1:轻轻摇动45 min。
[0060](5)再加入0.4 mL I mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30 1:轻轻摇动15 min。
[0061](6)于4 °C离心,弃上清(用枪吸),再用25 mL冰预冷无菌水洗漆。
[0062](7) 2.5 mL冰预冷的I mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清(用枪吸)；
(8)每管用100 UL I mol/L山梨醇溶解，分装管中(80 μ L管)，于_70°C冰箱保存。
[0063]电转化
Cl)向酵母感受态细胞中加入约5~10 μ g (体积小于10 μ L)的质粒PPIC9K-END，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min。
[0064](2)擦干电转杯，电击，电击参数:1.5 KV，25 yF，200欧姆。
[0065](3)立即加入I mL冰预冷的I mol/L山梨醇，转移至离心管中，于30 °C静置I h。
[0066](4)离心，弃上清，加入I mL YEPD后，于30 °C >200 rpm培养2 h。
[0067](5)离心得菌体后，吸除550 μ L上清液，然后取150 μ L涂100 Pg/mL氨苄YEPD板于30 °C培养至长出转化子。
[0068]E、酵母转化子发酵
挑取的转化子在YEro培养基上30 °C培养24 h，以10%接种量(v/v)接种于发酵培养基(酵母浸膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，50 mM柠檬酸缓冲液，麸皮200 g/L，羟甲基纤维素20g/L，l L自来水)，发酵在500 mL`摇瓶中发酵，装液量为20% (v/v)。在发酵培养基中培养48 h0
[0069]F、内切酶和葡糖苷酶活性测定
发酵的醪液用滤纸过滤，过滤的滤液4000 r/m离心15min，弃去沉淀，上清液为含有纤维素内切酶和葡糖苷酶重组蛋白的液体。
[0070]内切酶酶活测定:以羟甲基纤维素为底物，在50 °C进行酶降解反应。在25 mL试管中含有20 g/L的羟甲基纤维素柠檬酸缓冲液(0.05 M、pH 5.0) 10 mL，加入离心后上清液2.0 mL，在水浴锅中50 °C保温30 min，然后用沸水煮沸5 min。酶活定义为:每分钟释放出I Mfflol还原糖所需要的酶量。测定时上清液在沸水中煮沸5 min的酶液为对照。还原糖采用DNS法测定。
[0071]葡糖苷酶活性测定:以水杨苷为底物，在50 °C进行酶降解反应。在25 mL试管中加入含有20 g/L的水杨苷柠檬酸缓冲液(0.05 M、pH 5.0)10 mL，加入离心后上清液2.0mL，在水浴锅中50 °C保温30 min，然后用沸水煮沸5 min。酶活定义为:每分钟释放出IMfflol还原糖所需要的酶量。测定时上清液在沸水中煮沸5 min的酶液为对照。还原糖采用DNS法测定。
[0072]从上清液中测定的纤维素内切酶的活性为1.2 U/mL，葡糖苷酶的活性为0.3 U/mL。结果表明构建的重组蛋白具有纤维素内切酶和葡糖苷酶的活性，而且该蛋白在酵母菌中成功表达。
[0073]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.用于构建生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的DNA片段，其特征在于:包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、具有纤维素内切酶和葡糖苷酶活性的序列、酿酒酵母TDH3终止子序列。
2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的序列分别如SEQID N0.1~4所示。
3.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的DNA片段的序列如SEQIDN0.5所示。
4.用于构建生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的质粒，其特征在于:为包含权利要求1-3任一项所述的DNA片段的真核表达质粒。
5.根据权利要求4所述的质粒,其特征在于:所述的真核表达质粒为pPIC9K质粒。
6.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于通过包含如下步骤的方法制备得到:合成两端有限制性内切酶识别位点含有权利要求1-3任一项所述的DNA片段的序列，通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。
7.根据权利要求6所述的质粒,其特征在于:所述的真核表达质粒为pPIC9K质粒时，限制性内切酶为Aat II和Not I。
8.—种生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株，其特征在于:包含权利要求4-7任一项所述的质粒。
9.根据权利要求8所述的酵母菌株，其特征在于:所述的酵母菌株为酵母菌株SMDl168。`
10.权利要求8或9所述的酵母菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤:制备酵母电转化感受态细胞，将权利要求4-7任一项所述的质粒通过电转化转进酵母中得到。
【文档编号】C12R1/84GK103820443SQ201410084775
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月10日 优先权日:2014年3月10日
【发明者】薛栋升, 汪江波, 周敏 申请人:湖北工业大学