一种植物冷诱导表达启动子Poscold2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种植物冷诱导表达启动子Poscold2及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子。具体而言，本发明获得了上述启动子并将上述启动子应用在植物转基因工程中。本发明提供的启动子可以在冷诱导的条件下驱动外源基因在植物中表达，适用于单子叶禾谷类植物，尤其能够驱动外源基因在水稻植株中诱导表达，因此可以用于提高和改善水稻的生长特性，从而培育出理想的耐冷水稻品种。
【专利说明】一种植物冷诱导表达启动子Posco I d2及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和植物基因工程【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种植物冷诱导基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中在冷诱导条件下驱动目标基因在植株中表达。
【背景技术】
[0002]水稻是重要的粮食作物，属喜温作物，对低温反应比较敏感，当气温低于某一临界温度时，水稻生长发育就会收到抑制或危害，即低温冷害，因此，冷害是影响水稻生产的重要限制因子之一。根据对水稻影响不同，日本水稻专家把冷害分为延迟型、障碍型、稻瘟病型、混合型冷害。水稻从萌芽至成熟的各个时期都可能发生冷害，在世界范围内，高纬度、高海拔地区因低温冷害造成水稻减产的现象普遍发生，在中国以东北地区，西南地区特别突出，我国每年因低温冷害减产稻谷约30-50亿kg，损失严重。因此迫切需要发掘水稻耐冷种质资源，培育出水稻耐冷品种。
[0003]迄今，国内外的研究人员进行了坚持不懈的探索与研究，开展了抗冷胁迫新品种选育工作，取得了一定成绩。仲康等(2007)将锌指蛋白类似蛋白OsCOIN基因在水稻中过量表达使转基因水稻中脯氨酸含量升高，提高植物的耐冷性。张红生等(2009)将水稻锌指蛋白ZFP245基因在水稻中过量表达，发现超量表达ZFP245基因水稻在冷胁迫下使脯氨酸积累相关基因0sP5CS和脯氨酸转运基因OsProT基因的表达量提高，促使脯氨酸的量增加，增强植物的耐冷性。余淑美等(2010)发现MYBS3超量表达水稻能在4°C条件下处理后可以存活，且不影响其主要农艺性状。另外，对一些包括DREB/CBF、NAC等转录因子的过量表达可以提高水稻的耐冷性。
[0004]目前，随着分子生物学、生物信息学的飞速发展和转基因技术的日趋成熟，通过现代基因工程技术进行分子育种已成为改良水稻耐冷性的一种高效途径。
[0005]我国水稻资源丰富，从水稻种发掘、定位、克隆耐冷相关基因及其冷诱导启动子，将对水稻生产具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种驱动外源基因在冷诱导条件下特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
[0007]为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物冷诱导表达启动子P0SC0ld2，所述植物冷诱导表达启动子PoSCold2包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所不的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻冷诱导表达启动子，本文中称为Poscold2或启动子Poscold2。
[0008]优选地，本发明提供的植物冷诱导表达启动子P0SC0ld2的DNA序列为SEQ IDNo:1所示的序列，即Poscold2或启动子Poscold2。[0009]另一方面，本发明提供一种植物冷诱导表达启动子PosCold2，其DNA序列与SEQID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者,所述植物冷诱导表达启动子Poscold2为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述植物冷诱导表达启动子Poscold2具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些植物冷诱导表达启动子PoSCold2序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在冷诱导条件下在植物中特异性表达。
[0010]本发明所提到的冷诱导指的是对转基因植株施加一段时间的低温(例如，4摄氏度)，从而通过本发明的启动子诱导特定基因表达。
[0011]另一方面，本发明还提供一种包含上述植物冷诱导表达启动子P0SC0ld2的表达盒。
[0012]又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的植物冷诱导表达启动子Poscold2,在所述重组表达载体中，所述植物冷诱导表达启动子Poscold2连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-Poscold2，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即Poscold2或启动子Poscold2构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-Poscold2。或者，在实际应用中，选择耐冷基因作为待表达基因，通过本发明的启动子在冷诱导条件下，驱动耐 冷基因表达，从而提高植物的耐冷性。
[0013]另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物冷诱导表达启动子Poscold2、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地,所述宿主菌为根癌农杆菌。
[0014]另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物冷诱导表达启动子P0SC0ld2、上述表达盒、上述重组表达载体。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。
[0015]再一方面，本发明提供了上述植物冷诱导表达启动子P0SC0ld2在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物冷诱导表达启动子P0SC0ld2连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。所述待表达基因优选能够为植物提供耐冷性，即耐冷基因。
[0016]并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
[0017]本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:1中相同):
[0018]tccagttgat taccatcaga tgacacatga acatcaggat cagccgggag tgcacgtgat 60
[0019]tgtgccacca tgggtccatg gctgttttgg acacattgcg tgtgacgacg cccctcaatc 120
[0020]atctcaaacc tgatcaggtt ttctcaccgg agatgctcct atgatggctg tttggaataa 180
[0021]ccaggtagga gtagtactag tactacccaa gtggtgcacg tggcatggtg cgcctgacag 240
[0022]gtcgggccca cgggtcacga tccacatcgc ccccgaaaaa ggtcagtgga gaaaacaatg 300
[0023]agcggttgag cgcaaaacat gtggccgagg cgtgtctcgg agccctgcag cgccaacccg 360
[0024]taagcttgtg gccagggata gtccatttgt tcctctcacg gtggtacgga gaagagaaca 420
[0025]acaaacagcg ggttctctcc ctgctgtgcg cctctggttg ggcgacatgt ggcgggcggt 480[0026]gagttggcag ctgcgtgtct cggtggcttt gacgtgtcca aaaagcgagc gggtgggggc 540
[0027]cccctcctcc gctgcgcttt tcttttcttt ctatccatcc aaacagggac agtcctgtct 600
[0028]cctgtgccta gatttgcatg tcgccagata cgtctcctgt actcccttcg actacctccg 660
[0029]tccaaaaata taataacttt ttactataaa tctggacaca catgtgtcca aatttatagc 720
[0030]taaaaatgct tacatttttt tatggaggga gtatttcaat tgcagccatg attttccgtg 780
[0031]tctaacttta accgtctgtt ttatttaatt ttttttaaaa aaataaaaac ataagtcagg 840
[0032]agtaaagtat tgtttatatt ttatcatctc ataaaaaaaa ctaattacaa aattttttta 900
[0033]aataagatgg acgatcaaat tatgatcgca cttaaaataa aacggaggga gtagaagaga 960
[0034]aaaagctcaa taattcgtgt agtaccccga aagccagccg aggtgacatc accgcagttc 1020
[0035]tgctcatagt ttgatccaaa acagttttag agtttgttct cactactaag ttcaaccccc 1080
[0036]caagatattt tcattctttg cttgccaaaa atcatcagca gaaaaaaaca tgaactgctt 1140
[0037]gttaattcga tctataccaa ccgaagttta cctgaaactc tgataactgc agcctatcat 1200
[0038]gctccaccag ctgccagggc aattatggta ctatctccag agcacgcaca cagtaaatag 1260
[0039]cagcctaaca tccttcgatc ttatcgtcgg caaaacacac acgcatagag tggataggat 1320
[0040]cacaggaaca tgccatcgat tcgtgaagac ccacgaaagc gcacggtttt actcctacac 1380
[0041]ccacatacta gtagtagtag cggtagcagt acggtacatg tggctagtac tagcagtaat 1440
[0042]gcttggtccg gagcagcgag ccgtgtggtt gctgcagtgt gcgagtagcc aactagtggc 1500
[0043]aaccagacac atggacaagt agcagcgaag caggcgaagg aaggggcaag tgagtgccgt 1560
[0044]gaagcagcga gagccacaag aatcgagcgg cttccggggc tctctacagg attgaggcga 1620
[0045]aaagtgcaaa gccggaaagg gagagagaga aaaaagcgta gaaaaatccg atccgacgtg 1680
[0046]gcgccctggc ctgtgccctt tttctcctct ctcctgcctc ctcttggtct catttcccct 1740 [0047]tcctgccttg cctcctcgtc tccttctctg ctgctctcca agctcttcct gcttccatca 1800
[0048]ggttgtctcg agaaagattg gagtttttgg tggtttgggt tgtgcggttc ttgcttttgt 1860
[0049]tggcgcaagc gcatggctgg ttctgggaca tagtgagctg agatagagtt cttgtgttcg 1920
[0050]gtggagtttg gctttggtga atcttcgatt caagtctgga g 1961
[0051]需要说明的是:上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“tccagttgat taccatcaga tg”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp ;序列末尾以斜体并加粗表示的序列“a atcttcgatt caagtctggag”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp ；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。
[0052]综上所述,本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的1961bp的DNA序列，并将其命名为P0SC0ld2(序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在冷诱导处理后，整体上的Gus基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明该1961bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻冷诱导处理后特异性表达。[0053]本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化，在冷诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。在具体应用时，可以将靶标基因选择为具有提高植株耐冷性功能的基因(耐冷基因)，这样，通过冷诱导处理之后，该基因大量表达，增强植株的耐冷性。
[0054]技术效果
[0055]本发明所克隆的水稻启动子P0SC0ld2能够调控基因在植株中适时集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在植株中表达，代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的耐冷的转基因植物品种。
【专利附图】
【附图说明】
[0056]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0057]图1为将Poscold2启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391_Poscold2示意图，其中示出了利用Poscold2启动子驱动位于其下游的⑶S基因表达；
[0058]图2为萌发21天后的Poscold2::⑶S转基因植株组织染色图。在28°C条件下正常生长的水稻植株，经24小时染色后，根(A)，茎(B)，叶(C)均无⑶S活性，而在4°C冷处理24小时后，再经过30min染色后，在根(D)，茎(E)，叶(F)中均有⑶S强烈表达(标尺=10mm)η
[0059]图3为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
【具体实施方式】
[0060]以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0061]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0062]含有酶切位点的P0SC0ld2启动子的获得
[0063]步骤1、引物的设计
[0064]根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻PColel基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。
[0065]本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391 (图1A，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为:正向引物(SEQ ID No:2)5’端带Sail，酶切位点(GTCGAC)，反向引物(SEQ ID No: 3) 5’端带Smal，酶切位点(CCCGGG)，引物序列如下:
[0066]正向引物:GTCGACTCCAGTTGATTACCATCAGATGSail
[0067]反向引物:CCCGGGCTCCAGACTTGAATCGAAGATTSmaI
[0068]由深圳华大基因公司合成。[0069]步骤2、启动子Poscold2的获得
[0070]以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子PoscoId2，按常规PCR体系，采用如下扩增程序:
[0071]95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，执行 35 个从95°C预变性到72°C延伸的循环；最后72°C延伸lOmin。
[0072]回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1961bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上,按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和SmaI进行双酶切验证，如图3所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子Poscold2，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0073]植物表达载体的构建和农杆菌的转化
[0074]从上面“启动子P0SC0ld2的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用Sail和SmaI双酶切，回收启动子Poscold2片段。同时利用SalI和SmaI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收PCAMBIA1391，将上述的Poscold2片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子PoscoId2与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-Poscold2 (图1B)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，从冻融法所得产物中提取阳性质粒，用SalI和SmaI进行酶切验证,验证结果如图3中所示。
[0075]利用启动子Poscold2驱动Gus报告基因在水稻中表达
[0076]步骤1:农杆菌介导的水稻遗传转化
[0077]将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有I滴Tween20的50%次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4%)溶液浸泡种子40min (150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀对种子沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于农杆菌转化。
[0078]采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照 Yongbo Duan (Yongbo Duan, Chenguang Zhai, et al.An efficient andhigh-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice (Oryza sativa L)[J].Plant Cell Report, 2012.D0I10.1007/s00299-012-1275_3.)等提出的方法。
[0079]共获得22 株 pCAMBIA1391-Poscold2 植株(Poscold2::gus 转基因水稻植株)。
[0080]步骤2、冷处理和⑶S组织化学染色
[0081]将所获得植株在4°C下冷处理24小时后，再经过30min⑶S染色，染色方法参照Jefferson (Jefferson RA 等人.GUS fusion: β -Glucuronidase as a sensitive andversatile gene fusion marker in higher plant [J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中。脱色时在37°C条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。
[0082]把萌发21天后的Poscold2::⑶S转基因植株组织进行染色。如图2所示，在28°C条件下正常生长的水稻植株，经24小时染色后，根(A)、茎(B)、叶(C)均无⑶S活性，而在4°C冷处理24小时后，再经过30min染色后，在根(D)、茎(E)、叶(F)中均有⑶S强烈表达。
[0083 ]以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
【权利要求】
1.一种植物冷诱导表达启动子Poscold2,其特征在于,所述植物冷诱导表达启动子Poscold2包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的植物冷诱导表达启动子P0SC0ld2，其特征在于，所述植物冷诱导表达启动子Poscold2的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的植物冷诱导表达启动子P0SC0ld2，其特征在于，所述植物冷诱导表达启动子Poscold2的DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述植物冷诱导表达启动子Poscold2为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物； 或者，所述植物冷诱导表达启动子Poscold2具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。
4.一种表达盒,其特征在于,所述表达盒包含权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子Poscold2。
5.—种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体包含权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子PoSCold2，在所述重组表达载体中，所述植物冷诱导表达启动子Poscold2连接于载体中待表达的基因序列的上游； 优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-Poscold2，其中pCAMBIA1391为植物双元表达载体，或者，所述待表达基因是具有耐冷性的基因。
6.—种宿主菌，其特征 在于，所述宿主菌包含权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子P0SC0ld2、权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5所述的重组表达载体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。
7.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子P0SC0ld2、权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5所述的重组表达载体。
8.一种根据权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子P0SC0ld2在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括:将根据权利要求1-3中任意一项所述的植物冷诱导表达启动子Poscold2连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物:水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。
【文档编号】C12N15/113GK103849622SQ201410119971
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】魏鹏程, 杨剑波, 李 浩, 秦瑞英, 张银萍, 李莉, 马卉, 杨亚春, 宋丰顺, 倪金龙 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所