一种适用于培养γδT细胞的无血清培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种适用于培养γδT细胞的无血清培养基，由基础培养基组份I、γδT细胞特异性培养组份II以及水组成，经实验证明，采用本发明的适用于培养γδT细胞的无血清培养基培养γδT细胞，能够得到数量更多，纯度更高且杀伤效果更好的γδT细胞。本发明具有以下优点：1）避免了由γδT在细胞培养过程中使用的动物血清中动物成分对接受细胞治疗患者带来的风险以及动物血清中不确定的成分对细胞培养的结果造成的不确定影响；2）大大提高了γδT细胞得率；3）增加了γδT细胞培养的终密度，从而降低了细胞培养的成本。
【专利说明】—种适用于培养Y ST细胞的无血清培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种适用于培养Y δ T细胞的无血清培养基。
【背景技术】
[0002]Y δ T细胞发现于上个世纪80年代中期，主要有两种亚型:νr9/νδ2以及V5 I, r δ T在外周血T淋巴细胞中仅占0.5%~5%，其中大于90%的为Vy 9/νδ 2细胞。V51主要分布在上皮组织中，如肠道，脾脏，皮肤、小肠、食道、肺和生殖器官等。
[0003]r δ T细胞具有在体内快速反应的特性。在受到刺激时，会先于α β-T细胞释放促炎性细胞因子，如IFN-Y和TNF-α ;对肿瘤细胞有高杀伤性，能够通过细胞膜表面分子NKG2D识别肿瘤细胞表面的MICA/Β以及DNAM-1等膜蛋白从而启动多种杀伤肿瘤细胞方式，如释放穿孔素，颗粒酶，FasL，Trail等方式；r δ T细胞还能够激活NK细胞的肿瘤细胞毒作用；可以与DC细胞互刺激成熟；此外，r δ T细胞还具有APC细胞抗原提呈的功能，激活α β-Τ细胞的免疫效应。Bouet-Toussaint等人抽取了 6例结直肠癌和4例肝癌患者外周血进行Y δ T细胞的体外培养，发现结直肠癌和肝癌患者自体的肿瘤细胞能够被各自相应培养的V Y 9/V δ 2细胞裂解，而自体的正常组织细胞对V Y 9/V δ 2细胞裂解作用并不敏感，该结果提示体外扩增的Y δ T细胞回输治疗肝癌似是一种行之有效的方法。
[0004]目前在临床上，Yδ T细胞一般用于治疗各种肿瘤，对呼吸系统、消化系统、生殖系统以及部分血液恶性疾病疗效好。Y S T细胞与NK细胞形成互补，能杀伤对NK细胞不敏感的靶细胞，从而与NK细胞共同筑成机体抵抗肿瘤的天然基本防线。而临床上获得r δ T细胞的方法一般从外周血单个核细胞进行扩增，培养过程中一般需要加入动物血清来提高细胞培养的效果，动物血清能够提供细胞生长所需的基本营养物质:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，还可以提供激素和各种生长因子:胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。动物血清中这些物质的存在为临床上获得安全有效的细胞产品提供了坚强的保证。然而，由于动物血清中含有动物成分，若其用于临床细胞治疗体系中，可能会导致一些潜在的风险，这主要是由于动物血清成分复杂，虽含许多对细胞有利成分，但也有诸多不利细胞生长的因素存在:1)动物血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺、补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；2)动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致；3)取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性；4)大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。
【发明内容】
[0005]针对上述现有技术，本发明提供了一种适用于培养Y δ T细胞的无血清培养基，所含成分均为化学限定成分，不含任何动物血清成分，从而避免了使用动物血清可能导致的安全性的问题，且成本较低。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]一种适用于培养Y δ T细胞的无血清培养基，由基础培养基组份1、Y δ T细胞特异性培养组份II以及水组成，其中，所述基础培养基组份I是由以下浓度的组分组成的:
[0008]无水氯化|丐28 ~33.82mg/L, D-泛酸|丐 2.24 ~3.19mg/L, L-酪氨酸 4 ~5.9mg/L,L-蛋氨酸3~5mg/L, L-纟颜氨酸6~13.7mg/L, L-苯丙氨酸4~7mg/L, D-葡萄糖1789~1802mg/L,盐酸批卩多醇(维生素B6)0.055~0.066mg/L,次黄嘌呤3~5mg/L, L-丝氨酸7~15mg/L,氯化钠 7200 ~7599mg/L,核黄素 0.022 ~0.048mg/L,亚油酸 0.077 ~0.094mg/L, L-苏氨酸10~13.9mg/L,磷酸氢二钠120~149mg/L,胸苷0.22~0.39mg/L,硫辛酸0.12~0.29mg/L，L-天门冬酰胺7~18.01mg/L，L-精氨酸盐酸盐198~213mg/L，L-天门冬氨酸6~19.3mg/L，l，4 一丁二胺二盐酸盐0.11~0.19mg/L, L-半胱氨酸盐酸盐22~39.12mg/L, L-谷氨酰胺 113 ~149mg/L, L-谷氨酸 2 ~17.7mg/L,丙酮酸钠 100 ~IlOmg/L,维生素B120.312~0.657mg/L,甘氨酸6~8mg/L, L-亮氨酸11~13.4mg/L,维生素H0.004~(λ 008mg/L, L-赖氨酸盐酸盐34~39.5mg/L, L-组氨酸盐酸盐9~25mg/L，L-脯氨酸25~34.5mg/L ;如表1所不。
[0009]所述Υ δ T细胞特异性培养组份II是由以下浓度的组分组成的:
[0010]转铁蛋白20~100mg/L，TCRy δ单抗20~50mg/L，神经生长因子I~10mg/L，IL-450~100mg/L，成纤维素细胞生长因子I~10`0mg/L，胰岛素生长因子50~200mg/L，IL-1250~500mg/L，帕米磷酸二钠150~`500mg/L。如表2所示。本发明所用的神经生长因子、成纤维素细胞生长因子、胰岛素生长因子、IL-4、IL-12均采购自R&D公司，TCRy δ单抗采购自浙江瑞顺生物技术公司，帕米磷酸二钠采购自深圳海王药业。
[0011]表1
【权利要求】
1.一种适用于培养Y S T细胞的无血清培养基，其特征在于:由基础培养基组份1、Y ST细胞特异性培养组份II以及水组成，其中，所述基础培养基组份I是由以下浓度的组分组成的: 无水氯化钙28~33.82mg/L, D-泛酸钙2.24~3.19mg/L, L-酪氨酸4~5.9mg/L,L-蛋氨酸3~5mg/L, L-纟颜氨酸6~13.7mg/L, L-苯丙氨酸4~7mg/L, D-葡萄糖1789~1802mg/L,盐酸批卩多醇(维生素B6)0.055~0.066mg/L,次黄嘌呤3~5mg/L, L-丝氨酸7~15mg/L,氯化钠 7200 ~7599mg/L,核黄素 0.022 ~0.048mg/L,亚油酸 0.077 ~0.094mg/L, L-苏氨酸10~13.9mg/L,磷酸氢二钠120~149mg/L,胸苷0.22~0.39mg/L,硫辛酸0.12~0.29mg/L, L-天门冬酰胺7~18.01mg/L, L-精氨酸盐酸盐198~213mg/L, L-天门冬氨酸6~19.3mg/L，4 一丁二胺二盐酸盐0.11~0.19mg/L, L-半胱氨酸盐酸盐22~39.12mg/L, L-谷氨酰胺 113 ~149mg/L, L-谷氨酸 2 ~17.7mg/L,丙酮酸钠 100 ~IlOmg/L,维生素B120.312~0.657mg/L,甘氨酸6~8mg/L, L-亮氨酸11~13.4mg/L,维生素H0.004~(λ 008mg/L, L-赖氨酸盐酸盐34~39.5mg/L, L-组氨酸盐酸盐9~25mg/L，L-脯氨酸 25 ~34.5mg/L ； 所述Y δ T细胞特异性培养组份II是由以下浓度的组分组成的: 转铁蛋白20~100mg/L，TCRy δ单抗20~50mg/L，神经生长因子I~10mg/L，IL-450~100mg/L，成纤维素细胞生长因子I~100mg/L，帕米磷酸二钠150~500mg/L，胰岛素生长因子 50 ~200mg/L，1L-1250 ~500mg/L。
2.根据权利要求1所述的适用于培养YS T细胞的无血清培养基，其特征在于:所述基础培养基组份I是由以下浓度的组分组成的:无水氯化钙29mg/L，D-泛酸钙2.5mg/L,L-酪氨酸4.5mg/L, L-蛋氨酸4mg/L, L-缴氨酸13.5mg/L, L-苯丙氨酸6mg/L, D-葡萄糖1800mg/L,盐酸批卩多醇0.055mg/L,次黄嘌呤5mg/L, L-丝氨酸8mg/L,氯化钠7500mg/L,核黄素 0.028mg/L,亚油酸 0.079mg/L, L-苏氨酸 13mg/L,磷酸氢二钠 135mg/L,胸苷 0.25mg/L,硫辛酸0.19mg/L, L-天门冬酰胺14.4mg/L, L-精氨酸盐酸盐200mg/L, L-天门冬氨酸13.5mg/L，l，4 一丁二胺二盐酸盐0.18mg/L, L-半胱氨酸盐酸盐29mg/L，L-谷氨酰胺124mg/L, L-谷氨酸 13.9mg/L,丙酮酸钠 105mg/L,维生素 B120.35mg/L,甘氨酸 7mg/L, L-亮氨酸13.4mg/L,维生素H0.005mg/L, L-赖氨酸盐酸盐37.5mg/L, L-组氨酸盐酸盐14mg/L,L-脯氨酸 25.6mg/L ； 所述Y δ T细胞特异性培养组份II是由以下浓度的组分组成的: 转铁蛋白50mg/L, TCR y δ单抗50mg/L,神经生长因子10mg/L, IL_4100mg/L,成纤维素细胞生长因子50mg/L，帕米磷酸二钠250mg/L，胰岛素生长因子100mg/L，IL-12 250mg/L。
3.权利要求1或2所述的适用于培养yδ T细胞的无血清培养基的制备方法，其特征在于:步骤如下: (1)取组份I的各原料，混合混匀，在60°C真空下干燥15小时，备用；取组份II的各原料，在30°C真空下干燥18小时，混合混匀，备用； (2)将上述干燥后的组份I和组份II混合，针磨3个小时，过30目筛，得固态粉末，加水，混匀，0.2μπι滤膜过滤，即得适用于培养y δΤ细胞的无血清培养基。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中，针磨生产过程中，温度控制在20~25°C，湿度控制在15~20%，N2气体压力控制在150~300psi。
【文档编号】C12N5/0783GK103834615SQ201410120087
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】叶永清 申请人:叶永清