一种食管癌诊断标志物及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及一种长链非编码RNA及其应用，根据该长链非编码RNA序列，设计并合成特异性实时定量PCR引物和探针，制备用于食管癌辅助诊断或者疗效预测的制剂。利用实时定量PCR制剂，在食管癌临床病例标本中检测该长链非编码RNA的表达水平，发现该长链非编码RNA在食管癌中表达显著下调，本发明有望制备用于食管癌辅助诊断、疗效预测或者预后判断的制剂。
【专利说明】一种食管癌诊断标志物及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种长链非编码RNA及其应用，具体而言，本发明涉及一种长链非编码RNA在制备食管癌辅助诊断或者预后制剂中的应用。
【背景技术】
[0002]食管癌(Esophageal Carcinoma, EC)是严重危害全人类健康的恶性疾病，全球范围内其发病率和死亡率分别居第八位和第六位。EC主要有两种病理类型:食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC)和食管腺癌(EsophagealAdenocarcinoma, EA C),我国病理类型以鳞癌为主(占90%以上)。据世界卫生组织公布的最新资料显示，我国每年新发ESCC患者超过25万人，因食管癌死亡的患者约20万人，发病率居全国各类恶性肿瘤第5位，死亡率居第4位，均远超世界平均水平。尽管，目前临床上用于食管癌检查和治疗的技术手段在不断改进，但患者总体5年生存率仍然极低。近半个世纪以来，国内外关于EC发病机制的研究已在mRNA、蛋白质以及miRNA领域取得了一系列成果，但其确切的发病机制目前仍在积极的研究探索之中。(Jemal A, et al.Globalcancer statistics.CA:a cancer journal for clinicians2011，61:69-90 ；EnzingerPC，et al.Esophageal cancer.N Engl J Med2003，349:2241-2252 ;陈万青.2004-2005 年中国恶性肿瘤发病与死亡的估计.中华肿瘤杂志2009，31:664-668 ;赫捷，等.中国食管癌流行病学现状、诊疗现状及未来对策.中国癌症杂志，2011，(7) =501-504.)
[0003]人类基因组测序计划完成以后，证实长期备受关注的蛋白编码基因仅约占整个转录组的2%，超过98%的转录产物为ncRNA(noncoding RNA, ncRNA)。随着RNA组学研究的进展，起初被认为是基因组转录“噪音”的ncRNA，被逐步证实其在包括人类在内的多物种，甚至是植物的生理及病理活动中，均具有鲜为人知的广泛而多样化的功能。目前证实具有调控作用的ncRNAs主要分为长度> 200nt的LncRNAs以及< 200nt的microRNAs，虽然miciORNAs是目前为止研究相对比较深入的一类小ncRNAs，但随后人们发现在各个物种中，LncRNAs不仅数量大、种类多，而且在基因的转录和翻译、细胞分化和个体发育、遗传和表观遗传等生命活动中的调控作用较microRNAs更为广泛、精细和复杂(BirneyE，et al.1dentification and analysis of functional elements ini % of thehuman genome by the ENCODE pilot project.Nature2007,447:799-816 ；Wilusz JE,et al.Long noncoding RNAs !Functional surprises from the RNA world.Genes andDevelopment2009，23:1494-1504 ;Prasanth KV, et al.Eukaryotic regulatory RNAs:An answer to the ! genome complexity' conundrum.Genes and Development2007,21:11-42 ；Tsai MC, et al.Long intergenic noncoding RNAs:new links in cancerprogression.Cancer Res2011，71:3_7 ;Pauli A,et al.Non-coding RNAs as regulatorsof embryogenesis.Nature Reviews Genetics2011，12:136-149 ;Van LeeuwenS，etal.Long non-coding RNAs:Guardians of development.Differentiation2010,80:175-183 ;0romUA，et al.Long Noncoding RNAs with Enhancer-like Function in HumanCells.Cell2010,143:46-58 ；Caley DP, et al.Long noncoding RNAs, chromatin，anddevelopment.The Scientific World Journal 2010，10:90-102.)。
[0004]长链非编码RNA (long non-coding RNA，I ncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，近年研究发现它是一类具有重要生物学功能的RNA，参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中均发挥重要的调控作用。近年来，越来越多的权威研究证实IncRNA在肿瘤的发生发展中起着抑制或促进肿瘤的作用，在调控肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭转移能力等方面，均具有十分重要作用。目前已有较多LncRNAs被证实在包括乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、结直肠癌、膀胱癌等在内的人类多种肿瘤中存在差异表达并执行重要的调控功能(Gupta RA, et al.Long non-codingRNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.Nature2010,464:1071-1076 ；Cui Z,et al.The prostate cancer-up-regulated long noncoding RNAPlncRNA-1modulates apoptosis and proliferation through reciprocal regulation ofandrogen receptor.Urologic Oncology:Seminars and Original Investigations2013,31:1117-1123 ；Khaitan D，et al.The melanoma—upregulated long noncoding RNASPRY4-1T1 modulates apoptosis and invasion.Cancer Research2011，71:3852-3862 ;Du Y，et al.Elevation of Highly Up-regulated in Liver Cancer (HULC)by HepatitisB Virus X Protein Promotes Hepatoma Cell Proliferation via Down-reguIatingpl8.J Biol Chem 2012,287:26302-26311 ；Ling H，et al.CCAT2,a novel noncoding RNAmapping to 8q24， underlies metastatic progression and chromosomal instabilityin colon cancer.Genome Research 2013，23:1446-1461 ;Liu Z，et al.Downregulationof GAS5Promotes Bladder Cancer Cell Proliferation， Partly by Regulating CDK6.PLoS ONE 2013,8:9Article Number e73991.)。为探索LncRNA在ESCC 中是否具有功能，发明人在人ESCC组织及细胞系中，用目前已经证实在其它肿瘤中具有相关功能的LncRNA进行探索性研究，证实在乳 腺癌组织中发现的LncRNA HOTAIR不仅在ESCC癌与配对正常组织中差异表达，而且在ESCC细胞株中可明显抑制肿瘤细胞凋亡并促进肿瘤转移(Chen FJ, etal.Upregulation of the long non-coding rna hotair promotes esophageal squamouscell carcinoma metastasis and poor prognosis.Molecular Carcinogenesis2013，52:908-915.)。此外，发明人也证实在前列腺中发现的PlncRNA-1在ESCC组织中均显著上调并可调控肿瘤细胞增殖能力(Wang CM，et al.Upregulation of the Long Non-codingRNA PlncRNA-1 Promotes Esophageal Squamous Carcinoma Cell Proliferationand Correlates with Advanced Clinical Stage，Dig Dis Sci 201 3.doi:10.1007/sl0620-013-2956-7.)。
[0005]然而，追踪文献发现除发明人所在课题组外，关于食管鳞状细胞癌的IncRNA表达谱及其相关指标的功能性的研究目前还较少。为系统探索ESCC的IncRNA表达谱，发现与ESCC发生发展特异性相关的一组IncRNAs，发明人釆用芯片技术筛选到一条在人ESCC癌组织中显著低表达的IncRNA，该基因被命名为CTB-174D11.1 (Ensemble database)，其转录区域位于5号染色体正义链168，440，266-168，453，396bp对之间，基因全长为1489bp。发明人研究证实:与配对正常组织相比，该IncRNA在人ESCC癌组织中显著低表达，并在后期的大样本组织 qRT-PCR (Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,实时定量PCR)实验中进一步证实该指标在人ESCC癌组织中的表达，显著低于配对正常组织。为便于后期研究及论述，发明人将其命名为 HDESCC_lncRNA6 (highly down-regulated in esophagealsquamous cell carcinoma, long noncoding RNA 6)。本发明人重点关注了 ESCC 的 IncRNA表达谱，这一类新型的基因调控因子将有望进一步丰富和完善包括食管鳞癌在内的肿瘤发病机制的研究，也为发现肿瘤诊断及预后判断的标志物、新的肿瘤治疗靶点带来希望。
【发明内容】
[0006]为系统研究人食管鳞状细胞癌的IncRNA表达谱，发现与人食管鳞状细胞癌发生与发展密切相关的新的IncRNAs，由发明人提供的6对食管癌和配对正常组织标本，通过Qiagen公司的RNA提取试剂盒(RNeasy Micro KU，货号74004)提取RNA后，采用北京博奥生物有限公司的晶芯IncRNA芯片V2(4X180K)检测筛选出一条在食管癌组织中显著低表达的IncRNA，命名为HDESCC-lncRNA6，其基因序列如序列表SEQ ID N0.1所示。后期经过共110对人ESCC癌与配对正常组织样本qRT-PCR验证发现，在77对样本中该IncRNA表达在癌组织中显著下调。该IncRNA有望成为肿瘤诊断和预后判断的标志物，同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点。
[0007]本发明的目的是提供一种检测在食管鳞状细胞癌组织中低表达的IncRNA序列及其应用方法。
[0008]本发明系统的研究食管鳞状细胞癌的IncRNA表达谱，发现与食管鳞状细胞癌发生与发展密切相关的新的IncRNA。
[0009]本发明的目的 是提供一种检测在食管鳞状细胞癌组织中低表达的HDESCC-lncRNA6 序列。
[0010]本发明提供了所述HDESCC-1ncRNAe序列的检测应用方法，根据该序列制备用于食管癌辅助诊断或者疗效预测的制剂。
[0011]本发明根据所述HDESCC-lncRNA6序列设计了 3对引物用于检测HDESCC_lncRNA6序列。
[0012]Pairl 上游引物:SEQ ID N0.2
[0013]Pairl 下游引物:SEQ ID N0.3
[0014]Pair2 上游引物:SEQ ID N0.4
[0015]Pair2 下游引物:SEQ ID N0.5
[0016]Pair3 上游引物:SEQ ID N0.6
[0017]Pair3 下游引物:SEQ ID N0.7
[0018]本发明根据所述HDESCC_lncRNA6序列设计并合成出用于实时定量PCR的检测引物组。所述引物组适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针等的检测。
[0019]优选的用于染料类实时定量PCR检测的引物组分别为:
[0020]Pair2 上游引物:SEQ ID N0.4
[0021]Pair2 下游引物:SEQ ID N0.5
[0022]本发明中，qRT-PCR、实时定量PCR、荧光定量PCR是同一概念，可以相互替换使用。[0023]本发明的另一目的是提供一种检测HDESCC_lncRNA6表达水平的荧光定量PCR试剂盒及使用方法，该荧光定量PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0024]本发明制备了一种检测IncRNA表达水平的染料类实时定量PCR试剂盒，组分如下:特异性引物、标准DNA模板、突光染料、实时定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID N0.4，下游引物序列为SEQ ID N0.5。所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer缓冲液。所述荧光染料优选SYBRGreen II, Taq酶优选热启动酶。
[0025]本发明还公开了一种检测食管鳞癌的染料类荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量PCR体系:
[0026]上游引物(10μπιο1/1)2μL ;下游引物(10 μ mol/L) 2 μ L ;样品 cDNA4 μ L (或标准 DNA 模板 DNA2 μ L) ；50XROX Reference Dyel μ L ;2X SYBR Premex Ex Taq II(TIiRNaseH Plus) 25 μ L，加离子水至50 μ L。荧光定量PCR程序:95°C 30s预变性，接40个循环:95V 5s,60°C 30-34s。
[0027]本发明还公开了一种长链非编码RNA的检测方法，包括样品总RNA的提取、样品cDNA 的制备、HDESCC-lncRNA6 的扩增。
[0028]以上所述的样品总RNA的提取、样品cDNA的制备、HDESCC_lncRNA6扩增的具体步骤包括:
[0029]I)样品总RNA的提取 :按照Life Technologies公司的TRIZOL?试剂(货号15596026)所需试剂及步骤提取食管鳞状细胞癌组织或肿瘤的Total RNA ;再用NanoDropND-1000 核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies,Wilmington,Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度，甲醛变性胶电泳质检确保提取的RNA的完整性。
[0030]2)样品 eDNA 的制备:米用 TaKaRa 试剂盒 PrimeScript? RT reagent Kit withgDNA Eraser (Perfect Real Time)(货号 RR047A)对提取的总 RNA 反转录合成 cDNA ;该试剂盒内含RNase-Free DNase，可有效去除混杂的基因组DNA。
[0031]第一步去除基因组DNA反应，反应体系及条件如下:
[0032]
【权利要求】
1.一种长链非编码RNA在制备用于食管癌辅助诊断或者疗效预测试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述食管癌为食管鳞状细胞癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述长链非编码RNA序列如序列表中SEQID N0.1 所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的用于食管癌辅助诊断或者疗效预测的试剂为实时定量PCR检测试剂。
5.一种用于食管癌辅助诊断或者疗效预测的实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括根据核苷酸序列为SEQ ID N0.1的长链非编码RNA设计并合成出特异性用于实时定量PCR的检测引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，用于长链非编码RNA实时定量PCR检测的特异性引物如序列表中SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。
7.一种长链非编码RNA的检测方法，包括样品RNA的提取、样品cDNA的制备、IncRNA的扩增。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的样品RNA的提取、样品cDNA的制备、IncRNA的扩增的具体步骤包括: 1)样品总RNA的提取:按照LifeTechnologies公司的TRIzol?_试剂所需试剂及步骤提取食管鳞状细胞癌组织或肿瘤的Total RNA ;再用NanoDiOp ND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware)定量所提取的 RNA 的纯度和浓度，甲醒变性胶电泳质检确保提取的RNA的完整性。 2)样品cDNA 的制备:米用 TaKaRa 试剂盒 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNAEraser (Perfect Real Time)(货号RR047A)对提取的总RNA反转录合成cDNA ;该试剂盒内含RNase-Free DNase，可有效去除混杂的基因组DNA。 3)IncRNA 的扩增:采用 TAKARA SYBR Premix Ex Taq? II (TIi RNaseH Plus)荧光定量试剂盒，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。
【文档编号】C12Q1/68GK103952474SQ201410122636
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】曹秀峰, 李苏卿, 仝宇梭, 史卫红, 庹磊, 汪春梅, 谢海伟, 刘子豪, 杨同昕, 吕进, 纪律, 朱斌, 王和明, 李义生 申请人:南京市第一医院