一株瓜顶孢霉及其产蒽醌类物质的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于微生物资源利用领域，涉及一株瓜顶孢霉及其产蒽醌类物质的应用。所述瓜顶孢霉（Acremonium?cucurbitacearum）菌株编号为AJ014，保藏号为CGMCC?No.8729。该菌株可通过液体发酵生产蒽醌类物质，本发明进一步公开了发酵配方和发酵条件。本专利的瓜顶孢霉菌株及其产蒽醌类的发酵配方和发酵条件可提供于扩大化的工业生产。
【专利说明】一株瓜顶孢霉及其产蒽醌类物质的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物资源利用领域，涉及到微生物医药产业中蒽醌类天然活性产物生产微生物菌株的培养和发酵，具体就是一株瓜顶孢霉及其所产蒽醌类化合物的液体发酵
培养基配方。
【背景技术】
[0002]醌类化合物是存在于自然界中一类分子内具有不饱和环二酮结构(醌式结构)或容易转变成这类结构的化合物的总称。按照芳环的数目、骈合情况分为四类:苯醌、菲醌、萘醌和蒽醌。蒽醌是醌类化合物中最重要的一类物质，具有止泻、抗菌、利尿、止血、抗癌和抗病毒等多方面的生理活性。目前已发现的蒽醌化合物近200种，主要分布于高等植物中，其他则主要存在于真菌及地衣中，在动物及细菌中也偶有发现，在真菌、地衣和动物中存在的蒽醌类化合物的结构还常常比较特殊。竹黄中的羟基蒽醌是一种天然色素，由沈云修等(2002)首次分离获得。之后，国外仍无对竹黄蒽醌的研究，国内的研究也较少，主要是对其分离纯化及结构进行了研究。楼志华等(2006)利用化学试剂显色反应、紫外光谱和液质联用等手段初步确定一株竹黄菌(Shiraia bambusicola P.Hennigs) LBR 一 SB6发酵天然色素为蒽醌类化合物，发酵配方为2%木糖、0.2%NaN03、0.1%K2HP04、0.05%MgS04.7H20、0.05%KC1、0.001%FeS04.7Η20。张梁等(2006)确定竹黄中的蒽醌化合物为1，5 一二羟基一3 —甲氧基一 7 —甲基蒽醌。同年，江南大学对竹黄菌发酵制备天然蒽醌类色素的方法申请了专利，专利中使用的菌株为竹黄菌Shiraia bambusicola P.Hennigs LBR — SB6,所使用的摇瓶发酵的培养基配方为:葡萄糖15~35g/L，马铃薯100~250g/L ;摇瓶培养的培养条件是:培养温度24~30°C，转速120~160r/min，培养时间120~140h ;装液量为:摇瓶培养基和三角瓶容积之比为3:10，所得产物是天然蒽醌类色素中的1，5 一二羟基一 3 —甲氧基一 7 —甲基蒽醌，为棕红色固体粉末。Cai等(2008)首次从竹黄的深层发酵液中分离到了一种抗癌抗菌素，经分析证明是蒽醌物质。
[0003]目前已经公开的产蒽醌物质的微生物菌株有:(I)竹黄菌(Shiraia bambusicolaP.Hennigs)LBR — SB6(专利CN100509963C)，其摇瓶发酵使用的培养基组成为:葡萄糖15~35g/L，马铃薯100~250g/L ;摇瓶培养的培养条件是:培养温度24~30°C，转速120~160r/min，培养时间120~140h ;装液量为:摇瓶培养基和三角瓶容积之比为3:10。所得产物是天然蒽醌类色素中的1，5 —二羟基一 3 —甲氧基一 7 —甲基蒽醌，为棕红色固体粉末。(2)野生叶点霉菌(专利CN102994581A)，其发酵使用的培养基为PDA液体培养基。(3)青霉菌SHKl - 27(任虹，顾谦群，崔承彬，海洋来源常现青霉菌SHKl — 27生产的蒽醌衍生物及其抗肿瘤活性[J]，中国药物化学杂志，2007)，发酵配方为:2%的甘露醇、1%的葡萄糖、2%的麦芽糖、1%的谷氨酸钠、0.1%的玉米糖浆、0.05%的磷酸二氢钾、0.003%的七水硫酸镁、0.3%的酵母膏，培养条件为:培养温度28°C，摇床转速120r/min，培养周期为9d。(4)红树植物内生真菌(陈乙铨,林军,舒永志等,红树植物内生真菌来源的蒽醌类代谢产物的研究进展[J]，世界临床药物，2013)。(5)尖孢镰刀菌(崔堂兵，刘清香，尖孢镰刀菌生产蒽醌色素的液体发酵条件研究[J]，中国生物工程杂志，2010):斜面培养及平板培养均采用PDA培养基。种子培养基(g/L):马铃薯200，葡萄糖20，pH自然。发酵基础培养基(g/L):马铃薯200，葡萄糖20。培养条件为:30°C、200r/min的条件下，发酵培养6d。
[0004]目前已经公开的产蒽醌物质的植物有:掌叶大黄(杨世海，刘晓峰，果德安等，不同培养基对掌叶大黄毛状根克隆系质量的影响[J]，中草药，2006)，使用的培养基配方为:无机盐均为1/2的无激素WP、N6、MS、B54种培养基，培养条件为:培养温度为25°C，转速为lOOr/min，培养周期为40d。红大戟(赵峰，王素娟，吴秀丽等，红大戟中的蒽醌类化学成分[J]，中国中药杂志，2011)。苍耳子(王虹，何桂霞，姚颖，苍耳子中总蒽醌的含量测定[J]，中国现代药物应用，2009)。
[0005]竹黄是分布于我国和日本的一属单种真菌，在其分布的我国长江以南等诸省是一种民间药物，主要用于治疗虚寒胃痛、风湿性关节炎、气管炎、百日咳、坐骨神经痛、跌打损伤、贫血头痛等病症。现代药物化学分析表明，竹黄能够产生多糖、竹红菌素(茈醌)和蒽醌等代谢物，具有药用价值。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是从竹黄子实体的伴生真菌中获得产蒽醌的微生物菌株，并得到其产蒽醌物质最优的发酵配方和发酵条件。
[0007]本发明采用的菌株为从竹黄子实体中分离的一株伴生真菌——瓜顶孢霉(Acremonium cucurbitacearum),菌株编号为AJ014,于2014年01月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)保藏，分类命名为瓜顶孢霉(Acremonium cucurbitacearum),保藏编号为CGMCC N0.8729。
[0008]本发明还公开了瓜顶孢霉(Acremonium cucurbitacearum)AJ014在产蒽醌类物质中的应用。
[0009]本发明进一步公开了利用本发明菌株产蒽醌类物质的方法，是通过瓜顶孢霉AJ014液体发酵生产蒽醌类物质，其中产蒽醌类物质的培养基配方为:2%~6%的碳源、0.1%~0.5%氮源、0.1%~0.4%磷酸二氢钾、0.01%~0.09%硫酸镁、0.01%~0.05%七水硫酸亚铁、10 μ g/1OOmL~13 μ g/1OOmL的VBl、pH5.0~7.0,碳源为葡萄糖和D —果糖,氮源为蛋白胨和尿素；其产蒽醌类物质的发酵条件为25°C~30°C,摇床转速为120r/min~210r/min,培养周期为5~10d。最优配方为:4%的葡萄糖、0.4%的尿素、0.2%的磷酸二氢钾、0.05%的硫酸镁、0.03%的七水硫酸亚铁、13 μ g/1OOmL的VB1、初始pH为6.5，培养温度27°C，摇床转速210rpm，培养周期7d。在最优发酵配方和条件下蒽醌类物质的产量为4.73g/L。
[0010]本发明通过对竹黄子实体进行了菌种分离和鉴定，又进行了菌种筛选和天然产物的检测，从中获得一株非竹黄菌而是其伴生菌的真菌具有较强的产生蒽醌类化合物的能力。本专利对这株经形态和分子鉴定为瓜顶孢霉(Acremonium cucurbitacearum)的产蒽醌类物质的发酵培养基成分进行了优化研究，获得了瓜顶孢霉(Acremoniumcucurbitacearum)AJ014生产蒽醌类物质的发酵工艺流程。本专利的瓜顶孢霉菌株及其产蒽醌类的发酵配方和发酵条件可提供于扩大化的工业生产。【具体实施方式】
[0011]实施例1产蒽醌物质菌株的分离
[0012](I)组织分离法
[0013]采用组织分离法对菌种进行分离，即选取较新鲜的竹黄子座，先用75%乙醇对其进行表面消毒，再用已灭菌的刀片将子实体切割成约0.4mm X 0.4mm X 0.4mm~0.6mmX0.6mmX0.6mm的小块，于75%的酒精中消毒2min，然后转入1%的升汞溶液消毒2min,再以无菌水冲洗4~5次,置于已倒有菌种分离培养基的平皿上,每个平皿中放入3~4个组织块，在27°C恒温培养箱中培养，观察菌落生长状况。
[0014]观察的结果为:培养Id后，在培养基表面以及组织块表面观察不到菌丝；培养2d后，培养基上以及大部分组织块的表面已可见白色菌丝；培养3d后，菌种已适合转移纯化；培养时间如进一步延长，培养5d后菌落逐渐扩大，多成棉絮状。该方法分离的部分菌株，其生长较为迅速，影响到其他生长缓慢的菌株的生长，因此获得的菌株数量较少。共分离菌株
11株，命名为 AJ001 — AJOlI。
[0015](2)孢子分离法
[0016]慢慢刮去子座表面红色的拟薄壁组织，直至黄色基质出现，再用刀片小心刮取黄色基质，转移到装有无菌水的试管中震荡均匀，然后依次制成IO-1UO-2UO-3UO-4UO-
5、10 —6、10 —7七个 浓度梯度的孢子悬液，用移液枪分别吸取0.2mL悬液加入已倒有各类菌种分离培养基的平皿上，用涂布棒涂布均匀后，置于27°C恒温培养箱中培养，观察结果如下:培养2d后，在培养基表面观察不到菌丝；培养3~4d后，在少量的组织粉末边缘会出现小的白色菌落；培养5d左右，菌落直径变大，已适合转移纯化；若培养时间延长,菌落逐渐扩大，多为棉絮状。该方法可能由于组织粉末经涂布较为分散，获得菌株较多，菌株分离率在两种分离方法中是最高的，平均一块培养基上可以分离得到4~5株菌株。共分离菌株117株，命名为AJ012 - AJ128。其中三株菌产生色素，产色素的菌株编号是AJ014、AJ085和AJ121。
[0017]实施例2AJ014菌株的获得
[0018](I)直观筛选
[0019]天然存在的醌类化合物因母核上多有酚羟基等助色基团的引入，颜色呈黄、橙、棕红色以至紫红色等。在菌株筛选的初期，最直观的判断方法是观察菌株是否在培养基中产生色素。对于实施例1中已分离的菌株，针对性地筛选具有产生色素能力的菌株，接入新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平皿，27°C培养，产色素的菌株反复纯化，去除杂菌，然后接入马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基中，27°C培养，待菌落长满斜面后，4°C保藏。其中一个菌株在马铃薯葡萄糖琼脂上生长旺盛，随着培养时间的延长，菌丝颜色逐渐由白变黄，呈浅黄色至橙黄色，在菌落中间的一些菌丝表面出现一些紫红色小液滴状物质，该菌株的代号是AJ014。
[0020](2)发酵成分筛选
[0021]对获得的具有产生色素能力的AJ014、AJ085和AJ121菌株进行摇瓶发酵培养，针对其各自发酵成分进行进一步筛选，通过显色反应以检测发酵液中是否含有醌类化合物。
[0022]发酵液中产蒽醌物质的测定方法是:配制马铃薯葡萄糖液体培养液，250mL三角瓶中装液100mL。用接种针挑取少许活化后的菌丝接种。于27°C、150r/min下培养6~7天后，过滤菌丝，收集发酵液。将所得发酵液减压浓缩至20mL，加入等体积的氯仿，多次萃取后，将有机相合并后，60°C水浴蒸干氯仿，得到少量发酵液粗品。依据文献(李嘉容主编.天然药物化学实验[M].北京:中国医药科技出版社，2000)辨识蒽醌类化合物的显色反应。
[0023]①碱性显色反应
[0024]羟基醌类在碱性溶液中发生颜色改变，多呈橙、红、紫红以及蓝色。
[0025]具体步骤:取2mL发酵液粗品的氯仿溶液，加入等量的l%NaOH溶液，摇匀，观察有机相与水相的颜色变化；加入少量30%过氧化氢溶液，在沸水浴中加热5min，观察水相颜色变化；加入稀盐酸溶液，观察颜色变化；加入10%Na0H，再观察颜色变化。
[0026]②醋酸镁显色反应
[0027]取ImL发酵液粗品的乙醇溶液，加入少量0.5%醋酸镁的甲醇溶液，摇匀，观察颜色变化。显色结果如下表1:
[0028]表1瓜顶孢霉AJO14菌株发酵产物显色结果
【权利要求】
1.一株瓜顶孢霉(Acremonium cucurbitacearum),该菌株编号为AJ014,分离自竹黄子实体，菌株专利保藏号为CGMCC N0.8729。
2.权利要求1所述的瓜顶孢霉AJ014在产蒽醌类化合物中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的瓜顶孢霉AJ014生产蒽醌类化合物的生产方法，其特征在于，通过瓜顶孢霉AJ014液体发酵生产蒽醌类物质，其中产蒽醌类物质培养基配方为:2%~6%的碳源、0.1%~0.5%氮源、0.1%~0.4%磷酸二氢钾、0.01%~0.09%硫酸镁、0.01% ~0.05% 七水硫酸亚铁、10μ g/100mL ~13μ g/100mL 的 VBl、pH5.0 ~7.0，碳源为葡萄糖和D—果糖,氮源为蛋白胨和尿素；发酵条件为25~30°C,摇床转速为120r/min~210r/min，培养周期为5~10d。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述瓜顶孢霉AJ014产蒽醌类物质培养基配方为:4%的葡萄糖、0.4%的尿素、0.2%的磷酸二氢钾、0.05%的硫酸镁、0.03%的七水硫酸亚铁、13 μ g/1OOmL的VBl、pH为6.5，培养温度27°C，摇床转速210rpm，培养周期7d。
【文档编号】C12N1/14GK103897989SQ201410144833
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】陈双林, 黄珍, 闫淑珍 申请人:南京师范大学