一种简便高效的基因编辑方法

一种简便高效的基因编辑方法【专利摘要】本发明公开了一种简便高效的基因编辑方法。本发明方法利用复制过程中基因组高频自发断裂和chi位点促进同源重组的原理，设计合成或构建带有并行重复序列和双向筛选标记基因的同源重组核酸片段，该片段在引入基因组后通过分子内同源重组消除引入的外源标记基因。相对于需要进行两次转化的传统基因编辑方法，本发明方法仅需要一次转化，并且可有效地提高负筛选的效率，最高可达到50%。本发明的方法可以实现基因的删除、替换、插入等基因编辑操作。【专利说明】一种简便高效的基因编辑方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种基因编辑方法。【
背景技术：
】[0002]近年来，随着第二代和第三代高通量测序技术的发展，功能基因组学和合成生物学的迅速发展迫切需要一种快速、无痕、高效的基因编辑工具，实现对基因组的定向编辑改造。模式微生物例如酵母菌、大肠杆菌等的无痕编辑技术近年来受到重视(Birdetal.，High-efficiencycounterselectionrecombineeringforsite-directedmutagenesisinbacterialartificialchromosomes.Naturemethods,2012.9(I):p.103-109)，所开发的无痕编辑工具丰富多样。例如在酵母菌的双向筛选标记基因URA3的上游引入酶切位点提高无痕编辑的效率(Noskov，etal.，Tandemrepeatcoupledwithendonucleasecleavage(TREC):aseamlessmodificationtoolforgenomeengineeringinyeast.Nucleicacidsresearch,2010.38(8):p?2570-2576)，在大肠杆菌开发多种双向筛选标记基因galK，thyA，tolC，tetA-sacB(Warmingetal.,SimpleandhighlyefficientBACrecombineeringusinggalKselection.Nucleicacidsresearch,2005.33(4):p.e36；Wongetal.,EfficientandseamlessDNArecombineeringusingathymidylatesynthaseAselectionsysteminEscherichiacol1.Nucleicacidsresearch,2005.33(6):p.e59；Greggetal.，RationaloptimizationoftolCasapowerfuldualselectablemarkerforgenomeengineering.Nucleicacidsresearch,2014.DO1:10.1093/nar/gktl374；Lietal.,PositiveandnegativeselectionusingthetetA—sacBcassette:recombineeringandPltransductioninEscherichiacol1.Nucleicacidsresearch,2013.41(22):p.e204)。但是，到目前为止基因编辑技术的难点，即双向筛选系统中标记基因的高效删除，仍未有效解决。[0003]出于转基因的安全性及无痕编辑等要求，通常需要在完成所需的基因编辑后删除标记基因。传统的双向筛选标记基因的删除首先通过将含有插入位点上下游同源区的单链或双链核酸片段转化进入细胞，然后通过同源重组替换基因组上的抗性标记基因，最后通过在培养基中加入负筛底物完成对重组细胞的富集，以挑选出去除筛选标记基因，获得无痕编辑的细胞。因此，传统的基因编辑技术需要两次转化，第一次转化用于将带有目的基因和标记基因的核酸片段转入细胞进行同源重组，同源重组后目的基因和标记基因进入靶基因组；第二次转化用于删除标记基因，即将含有插入位点上下游同源区的核酸片段转入细胞，通过同源重组替换基因组上的抗性标记基因。此外，用这种方法删除标记基因的效率往往很低。[0004]基因编辑技术中用于筛选重组子的双向筛选系统包含正筛选和负筛选，正筛选一般通过抗生素抗性标记基因赋予重组子对抗生素的抗性或通过营养缺陷型基因赋予在相应选择缺陷型培养基生长的特性来实现，负筛选一般利用某些基因赋予重组子对某些物质的敏感性来实现，例如利用sacB-neo融合基因来进行正/负筛选，neo(卡那霉素)抗性用于正筛选，而由于sacB基因的表达而产生的鹿糖毒性用于负筛选(Warmingetal.,SimpleandhighlyefficientBACrecombineeringusinggalKselection.Nucleicacidsresearch,2005.33(4):p.e36)。双向筛选也可通过一个双向筛选标记基因来实现，例如tolC基因既可用于正筛选又可用于负筛选(Greggetal.,RationaloptimizationoftolCasapowerfuldualselectablemarkerforgenomeengineering.Nucleicacidsresearch,2014.DO1:10.1093/nar/gktl374)。负筛的成功率往往极低甚至常常失败。这主要是由于负筛选的致死过程需要有毒物质的生产与积累，在积累过程中细胞容易发生自发突变产生对有毒物质的抗性，使得细胞能够在保有负筛基因的情况下生存。不仅如此，负筛前的转化过程也常常引入对负筛物质不敏感的外源细胞而导致负筛过程的失败。[0005]因此，本领域需要一种能够快速、高效地进行基因编辑的方法。【
发明内容】[0006]针对传统基因编辑方法的上述及其他缺陷，本发明提供一种基因编辑方法，包括以下步骤:[0007]a.提供靶细胞，所述靶细胞包含带有待修饰位点的靶核酸；[0008]b.用包含所述待修饰位点的上下游同源序列、目的基因、并行重复序列和双向筛选标记基因的核酸片段转化所述靶细胞，以使所述核酸片段和靶核酸发生同源重组，从而在所述待修饰位点产生所需要的基因编辑；[0009]c.进行正筛选以筛选出在靶核酸上整合了目的基因和双向筛选标记基因的重组子细胞；[0010]d.允许所述核酸片段上的并行重复序列和待修饰位点的上游或下游的相应并行重复序列发生同源重组，以删除标记基因；[0011]e.进行负筛选以富集删除了双向筛选标记基因的重组子细胞。[0012]一种优选实施方式中，上述步骤b中核酸片段上的并行重复序列为靶核酸上待修饰位点上游或下游的原始序列。另一种优选的实施方式中，步骤b中核酸片段上的并行重复序列与靶核酸上紧邻修饰位点的上游或下游的序列同源，以实现无痕编辑。[0013]另外一种实施方式中，步骤d中在不含正负筛选物质的培养基中培养步骤c筛选出的重组子细胞以允许所述核酸片段上的并行重复序列和待修饰位点的上游或下游的相应并行重复序列发生同源重组，从而删除标记基因。[0014]另外一种实施方式中，步骤b中的双向筛选标记基因包含一个或多个Chi位点以提高双向筛选标记基因删除的效率。优选实施方式中，可以在不影响双向筛选标记基因功能的前提下，将Chi位点引入到双向筛选标记基因的任意一个或多个位点。所述Chi位点可以是正向的或反向的，多个Chi位点之间可以是连续的或不连续的。在不同类型的基因组中可使用不同的Chi位点，且在同一类型的基因组中可使用不同强度的Chi位点序列。[0015]一种实施方式中，本发明方法用于原核细胞或真核细胞基因组任意位置基因的编辑，即靶核酸为原核细胞或真核细胞的基因组。另外一种实施方式中，本发明方法用于在质粒或人工染色体(BAC)上进行基因编辑,即祀核酸为质粒或人工染色体。【专利附图】【附图说明】[0016]附图1:基因编辑的三种主要方式。[0017]附图2:并行重复序列辅助基因编辑的原理示意图。[0018]附图3:含有Chi位点的双向筛选标记基因不意图。[0019]附图4:并行重复序列和Chi位点辅助基因编辑的原理示意图。[0020]附图5:用本发明方法在大肠杆菌中进行基因编辑的示意图。[0021]附图6:质粒pMD18-T图谱(购自TaKaRa公司)。[0022]附图7:质粒pEASY-cat-sacB图谱。[0023]附图8:质粒pKD46图谱。[0024]附图9=FADEI的序列，分别示出了FADE上游同源区、cat_sacB、FADE上游同源区、和FADE下游同源区。[0025]附图10:FAA-URA3的序列，分别示出了faal起始密码子上游同源区、faal起始密码子上游同源区、faal终止密码子下游同源区。[0026]附图11:pMD-ldhA1-cat-sacB-FAR的序列，分别示出了插入位点上游序列、cat-sacB、插入位点上游同源区、FAR、插入位点下游同源区。[0027]附图12:pMD-tesC-cat-sacB-FAR的序列，分别示出了tesC上游同源区、cat-sacB、tesC上游同源区、FAR、tesC下游同源区。【具体实施方式】[0028]本发明利用基因组高频自发断裂后同源重组重启复制叉的原理，通过在标记基因两端串联并行重复序列的方法，实现了一步转化两步重组完成基因编辑的过程。相对于传统的基因编辑方法(需要两次转化)，由于本发明提供的方法只需要一次转化就可以实现预期的改造和双向筛选标记基因的删除，因此在很大程度上简化了基因编辑的操作步骤。另外，本发明提供的方法提高了双向筛选标记基因的删除效率。不受任何理论的限制，双向筛选标记基因删除效率的提高可能是由于传统上删除双向筛选标记基因的方法是通过分子间的同源重组，这种重组在很大程度上受到转化效率(一般不超过1/1000)的影响，而本发明的方法是靠分子内重组完成的，每个细胞都含有发生同源重组的片段。此外，本发明方法通过在双向筛选标记基因中引入Chi位点的方式提闻了负筛选的效率，最闻可达到50%。由于本发明的方法可以进行基因的无痕编辑，因此可以连续实现基因的删除、替换、插入等操作。[0029]在本发明上下文中，术语“靶细胞”是指待转化的细胞，靶细胞中含有靶核酸，用根据本发明设计和构建的核酸片段转化该细胞，使核酸片段与靶核酸发生同源重组，从而实现所需的基因编辑。[0030]术语“靶核酸”是指需要进行基因编辑的核酸，靶核酸可以是原核细胞或真核细胞的基因组，也可以是质粒或人工染色体(BAC)等。[0031]本发明上下文中，术语“核酸”包括DNA、cDNA、和RNA。[0032]术语“基因编辑”是指在待修饰位点改变基因序列，包括基因删除、插入和替换。本发明上下文中的基因编辑包括对基因或任意碱基进行编辑，即用基因或任意碱基删除、插入或替换靶核酸上原始的基因或碱基。[0033]术语“无痕编辑”或“无痕基因编辑”是指经编辑的核酸上不存在不需要的多余碱基。[0034]术语“待修饰位点”或“修饰位点”是指靶核酸上需要进行基因编辑的具体位置。[0035]术语“同源”，例如“同源序列”中的“同源”，是指两个核酸之间的核苷酸序列相似性或一致性。本领域技术人员知晓，可通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交进行同源性的评估(如Haines和Higgins(主编)的《核酸杂交》(NucleicAcidHybridization)(IRL出版社，牛津，英国)中所述)，或通过比较两个核酸之间的序列一致性来进行同源性的评估。对本发明目的而言，“同源”是指两个核酸之间至少具有30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%,98%,99%或100%的序列相似性或一致性，优选具有60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%,99%或100%的序列相似性或一致性，更优选具有80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性或一致性，最优选具有90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性或一致性。可用于进行序列比对的软件例如BLAST和ClustalW程序，两种程序都可以从网上找到。[0036]术语“本发明构建的核酸片段”或“根据本发明设计和构建的核酸片段”是指包含待修饰位点的上下游同源序列、目的基因(当用于基因删除时，不存在目的基因)、并行重复序列和双向筛选标记基因的核酸片段。其中与待修饰位点的上下游序列同源的序列位于该核酸片段的两端，用于与靶核酸同源重组。[0037]术语“目的基因”是指用于在待修饰位点进行基因编辑的基因，例如在待修饰位点取代靶核酸上原始的基因或插入到靶核酸上，当用于在靶核酸上删除基因或碱基时，不需要目的基因，即在本发明构建的核酸片段上目的基因为不存在。[0038]术语“并行重复序列”是指在本发明构建的核酸片段上的一段序列与靶核酸上待修饰位点的上游或下游序列同源，例如本发明构建的核酸片段5’端含有与待修饰位点的下游(即3’端)同源的并行重复序列(即待修饰位点的下游的相应并行重复序列)，或本发明构建的核酸片段3’端含有与待修饰位点的上游(即5’端)同源的并行重复序列(即待修饰位点的上游的相应并行重复序列)。本发明构建的核酸片段上的这段序列和靶核酸上与其同源的序列在本发明中均称为“并行重复序列”。并行重复序列的长度可变，例如在30个碱基至1000个碱基范围内，本领域技术人员可根据具体需要确定并行重复序列的长度。术语“双向筛选标记基因”或“标记基因”是指既可以进行正筛选又可以进行负筛选的基因，可以是一个或多个基因，例如，tolC、galK、thyA、neo-sacB、tetA-sacB、cat-sacB等。[0039]“正筛选”具有本领域技术人员通常理解的含义，即一般通过抗生素抗性标记基因赋予重组子对抗生素的抗性或通过营养缺陷型基因赋予在相应选择缺陷型培养基生长的特性来实现，例如利用正筛选物卡那霉素或氯霉素，尿嘧啶缺陷型培养基等。[0040]“负筛选”具有本领域技术人员通常理解的含义，即其特征一般是在特定的限定条件下，负筛选物的存在对细胞有不利影响，例如使细胞死亡或阻碍/抑制细胞生长。最常用的负筛选标记是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的sacB。当sacB被引入异源宿主例如大肠杆菌时，其在外源蔗糖存在的情况下会导致细胞死亡。[0041]“Chi位点”或“Chi序列”是基因组中一段短的DNA片段，在该位点附近发生同源重组的几率增加。不同类型有机体的基因组中Chi位点的序列可能是不同的。[0042]下面参考附图对本发明做进一步的说明。[0043]图1示出了基因编辑的三种主要方式，即基因或碱基的删除、替换或插入。[0044]图2是并行重复序列辅助基因编辑的原理示意图。如图中所示，根据本发明设计和构建的核酸片段在其两端含有与待修饰位点的上游和下游同源的序列，因此所述片段在转化到细胞中之后能够与靶核酸(基因组或质粒)发生同源重组，所述核酸片段整合到靶核酸上，将待修饰位点的基因或碱基删除、替换待修饰位点的基因或碱基、或者插入到待修饰位点。在发生上述第一步的同源重组之后，通过正筛选富集重组子，例如如果所述核酸片段上的双向筛选标记基因之一是cat，即氯霉素抗性基因，则可以用含有氯霉素的培养基筛选经过转化的细胞，以富集发生了同源重组从而具有氯霉素抗性的重组子细胞。[0045]在正筛选之后，需要去除标记基因。本发明方法利用两个并行重复序列之间的同源重组剔除标记基因。所述并行重复序列一个位于待筛选位点的上游或下游，一个在根据本发明构建的核酸片段上，两个并行重复序列之间是双向筛选标记基因。如果本发明构建的核酸片段在5’端含有并行重复序列，则该序列与待修饰位点的3’端上游序列同源，如果本发明构建的核酸片段在3’端含有并行重复序列，则该序列与待修饰位点的5’端上游序列同源，从而当这两个并行重复序列位于同一分子内时能够发生同源重组并将它们之间的标记基因删除。所述两个并行重复序列之间至少具有30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性或一致性，优选具有60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%,98%,99%或100%的序列相似性或一致性，更优选具有80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性或一致性，最优选具有90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性或一致性。一种特别优选的实施方式中，核酸片段上的并行重复序列为靶核酸上待修饰位点上游或下游的原始序列。并行重复序列的长度可根据需要变化，例如在30至1000个碱基范围内，本领域技术人员可根据具体需要确定并行重复序列的长度。如图2所示，在发生第一步同源重组之后，靶核酸上含有这两个并行重复序列，两个并行重复序列之间隔着标记基因，然后允许这两个并行重复序列发生分子内同源重组，例如通过在不含正负筛选物质的培养基中培养重组子细胞一段时间，从而除去标记基因。[0046]本发明方法可以进行基因的无痕编辑。仍然参考图2，如果本发明构建的核酸片段上的并行重复序列与靶核酸上紧邻修饰位点的上游或下游的序列同源，则可以实现无痕编辑。“紧邻修饰位点的上游或下游的序列”是指所述上游或下游序列与修饰位点之间是连续的，没有碱基间隔。[0047]本发明方法中，在双向筛选标记基因中引入一个或多个Chi位点进一步提高了双向筛选标记基因删除的效率(参见图3和图4)，使最终负筛选的效率最高可达到50%。可以在不影响双向筛选标记基因功能的前提下，将Chi位点引入到双向筛选标记基因的任意一个或多个位点。所述Chi位点可以是正向的或反向的，多个Chi位点之间可以是连续的或不连续的。根据不同的靶细胞类型，可选择使用不同的Chi位点，在同一类型靶细胞中，也可选择使用不同强度的Chi位点序列。[0048]图5是用本发明方法在大肠杆菌中进行基因编辑的示意图。首先用目标DNA片段即本发明构建的核酸片段转化大肠杆菌感受态细胞，然后在含有氯霉素的平板上筛选含有cat-sacB双向筛选标记基因的大肠杆菌重组子细胞，筛选出的重组子细胞先在不含正负筛选物的普通LB培养基上培养，然后用含有负筛选物蔗糖的LB培养基培养，再用含有蔗糖的LB平板筛选富集阳性克隆，最后可用PCR验证获得的阳性克隆。[0049]图6、图7和图8是本发明实施例中使用的质粒的图谱。[0050]本发明方法可用于原核细胞例如大肠杆菌或真核细胞例如酵母的基因组上任意位置基因的编辑，也可用于在质粒或人工染色体上进行基因编辑。[0051]上文结合附图对本发明做了详细的描述。本领域技术人员理解，这些描述只是为了更好地阐释和理解本发明，并不意于对本发明的范围做任何限制。下文将结合具体实施例对本发明作进一步的说明。同样，这些实施例只是为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，并不构成对本发明范围的任何限制。本发明的范围仅由所附的权利要求书限定。[0052]本领域技术人员认可，可对本发明的形式进行多种变化和改动而不脱离本发明的精神和范围，这些变化和改动由于属于本发明的等同形式而落入本发明权利要求保护的范围内。[0053]除本文另有说明以外，本申请中所用术语具有本领域技术人员所理解的一般含义。分子生物学和基因工程领域的实验操作，例如质粒构建、转化和筛选的一般技术是本领域技术人员熟知的，也可参见本领域的参考书例如《分子克隆实验指南》，第3版，J.萨姆布鲁克。大肠杆菌(Escherichiacoli)的某闵鉬序列可在HTTP://ffffff.NCB1.NLM.NIH.GOV/GEN0ME/1677PR0TECTID=57779获得。海洋杆菌(MarinobacteraquaeoleiVT8)的基因组序列可在HTTP://ffffff.NCB1.NLM.NIH.G0V/GEN0ME/?TERM=MARIN0BACTER+AQUAE0LEI获得。[0054]实施例[0055]实施例1无痕删除大肠杆菌(Escherichiacoli)fadE[0056](I)合成含有fadE两端同源区，5’端并行重复序列和cat-sacB的DNA，命名为fadEI(SEQIDN0.:1，也参见图9)。[0057](2)片段fadEI转化含pKD46的E.coliMG1655感受态细胞，孵育后涂布于含氯霉素的LB固体培养基。待长出后经PCR和测序验证获得重组菌MG1655ΔfadE::cat-sacB。[0058](3)纯化MG1655ΔfadE::cat_sacB,如附图5所示负筛选流程,取单菌落接种于IOOmLLB液体培养基，培养12h;取ImL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h;取300μL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h。[0059](4)取上述培养液适当稀释涂布10%蔗糖的LB固体培养基，待长出单菌落，以fadEpl(TTGAAACCGAAATCATTACCGACGC,SEQIDN0.:2)和fadEp2(CGTGTTATCGCCAGGCTTTAGGAGG,SEQIDN0.:3)为引物PCR进行PCR检测，PCR反应程序为:940C4min94°C30s,62°C30s,72°C2min35cycles,72°C5min(以下所有实施例所用的PCR程序均与此处相同)测序验证获得无痕删除菌株。[0060]实施例2无痕删除大肠杆菌tesC[0061](I)利用PCR反应以E.coliMG1655基因组为模板，使用上下游引物tesCpl(GCACTGCTCATTACCCTGTCCCTG,SEQIDN0.:4)和tesCp2(TGGATGTCACCCTGCTCAACGAG，SEQIDN0.:5)扩增大肠杆菌tesC基因及上下游部分序列获得tesCI片段，将该片段与pMD18_T获得pMD18-tesC。[0062](2)利用PCR反应以pMD18-tesC为模板，使用上下游引物tesCp3(AAAATTGCCACTATGCAAATTAATTACAGGG,SEQIDN0.:6)和tesCp4(ACGTTTTGTGGTGCCGGATGCTC，SEQIDN0.:7)反向扩增获得tesCII片段。[0063](3)利用PCR反应以pEASY-cat-sacB为模板，使用磷酸化上下游引物P5(GTGACGGAAGATCACTTCGCAGA,SEQIDN0.:8)和tesCp6(AAAATTGCCACTATGCAAATTAATTACAGGGTTAATACCGCCAGATTACGATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGC,SEQIDN0.:9，下划线部分为tesC基因上游同源序列)扩增获得tesCIII片段。[0064](4)连接片段tesCII和tesCIII，转化E.coliDH5α菌株，获得pMD-tesC-cat-sacB质粒。[0065](5)利用PCR反应以pMD-tesC-cat-sacB为模板，使用上下游引物tesCpl和tesCp2扩增获得tesCIV片段。[0066](6)片段tesCIV电转化含pKD46的E.coliMG1655感受态细胞，孵育后涂布与含氯霉素的LB固体培养基。待长出后PCR检测，测序验证获得重组菌MGAtesC::cat-sacB。[0067](7)纯化MGAtesC::cat-sacB,如附图5所示负筛选流程,取单菌落接种于IOOmLLB液体培养基，培养12h;取ImL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h:取300μL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h。[0068](8)取上述培养液适当稀释涂布10%蔗糖的LB固体培养基，待长出单菌落，以tesCpl和tesCp2为引物PCR检测，测序验证获得无痕删除菌株。[0069]实施例3海洋杆菌(MarinobacteraquaeoleiVT8)FAR基因无痕替换大肠杆菌tesC[0070](1)使用引物FARF(ATGGCAATACAGCAGGTACATCACG,SEQIDN0.:10)和FARR(TCAGGCAGCTTTTTTGCGCTG,SEQIDN0.:11)，以海洋杆菌基因组为模板获得FARSI片段。[0071](2)以pMD-tesC-cat-sacB为模板，以tesCp4和tesCp6为引物扩增获得FARSII片段。[0072](3)连接片段FARSI和FARSII，转化E.coliDH5α菌株，获得pMD-tesC-cat-sacB-FAR质粒(SEQIDN0.:27，也参见附图12)。[0073](4)利用PCR反应以pMD-tesC-cat-sacB-FAR为模板，使用上下游引物tesCpl和tesCp2扩增获得FARSIII片段。[0074](5)片段FARSIII电转化含pKD46的E.coliMG1655感受态细胞，孵育后涂布与含氯霉素的LB固体培养基。待长出后PCR检测，测序验证获得重组菌MGΔtesC::cat-sacB-FAR。[0075](6)纯化MGAtesC::cat-sacB-FAR,如附图5所示负筛选流程,取单菌落接种于IOOmLLB液体培养基，培养12h;取ImL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h:取300μL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h。[0076](7)取上述培养液适当稀释涂布10%蔗糖的LB固体培养基，待长出单菌落，以tesCpl和tesCp2为引物PCR检测，测序验证获得无痕替换菌株。[0077]实施例4海洋杆菌FAR基因无痕插入大肠杆菌IdhA启动子下游[0078](1)利用PCR反应以E.coliMG1655基因组为模板，使用上下游引物FARIpI(GCCGAATATCATGGTGGAAAATGG,SEQIDN0.:12)和FARIp2(CTGGCGATTGCTCCGTCTGC，SEQIDN0.:13)扩增大肠杆菌IdhA启动子上下游部分序列获得KldhAI片段，将该片段与PMD18-T获得pMD18-KldhAI。(2)利用PCR反应以pMD18_KldhAI为模板，使用使用上下游引物FARIp3(CATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCC，SEQIDN0.:14)和FARIp4(AAGACTTTCTCCAGTGATGTTGAATCACAT,SEQIDN0.:15)反向扩增获得FARIII片段。[0079](3)利用PCR反应以pMD-cat-sacB为模板，使用磷酸化上下游引物P5和FARIp6(CATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGC，SEQIDN0.:16，下划线部分为插入位点上游同源序列)扩增获得FARIIII片段[0080](4)连接片段FARIII和FARIIII，转化E.coliDH5α菌株，获得pMD-ldhA1-cat-sacB质粒。[0081](5)利用PCR反应以pMD-ldhA1-cat-sacB为模板，使用上下游引物FARIp3和p5扩增获得FARIIV片段。[0082](6)使用磷酸化引物FARF和FARR，以海洋杆菌基因组为模板获得FARIV片段(7)连接片段FARIIV和FARIV，转化E.coliDH5α菌株，获得pMD-ldhA1-cat-sacB_FAR(SEQIDN0.:28，也参见附图11)质粒。[0083](8)利用PCR反应以pMD-ldhA1-cat-ch1-sacB-FAR为模板，FARIpl和FARIp2扩增获得FARIVI片段。[0084](9)片段FARSVI电转化含pKD46的E.coliMG1655感受态细胞，孵育后涂布与含氯霉素的LB固体培养基。待长出后PCR检测，测序验证获得FAR插入菌株MGKLFARI。[0085](10)纯化MGKLFARI，如附图5所示负筛选流程，取单菌落接种于IOOmLLB液体培养基，培养12h;取ImL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h:取300μL培养液接种于含10%鹿糖的LB液体培养基,培养12h。[0086](11)取上述培养液适当稀释涂布10%蔗糖的LB固体培养基，待长出单菌落，以FARIpl和FARIp2为引物PCR检测，测序验证获得无痕插入菌株。[0087]实施例5pMD_cat-chi_sacB的构建[0088](I)利用PCR反应以pEASY-cat-sacB为模板使用上下游引物pccs-pl(GTGACGGAAGATCACTTCGCAGA,SEQIDN0.:17)和pccs_p2(CCACCAGCCAGTAACAAACCCGCGCGATTT,SEQIDN0.:18，下划线为chi位点序列)获得catchi片段，将该片段与PMD18-T获得pMD18-cat-chi。[0089](2)利用PCR反应以pMD18-cat_chi为模板使用上下游引物pccs_P3(CCACCAGCCAGTAACAAACCCG,SEQIDN0.:19,下划线为chi位点序列)和pccs_P4(ATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACC,SEQIDN0.:20)获得pMD18_catchiF片段。[0090](3)利用PCR反应以pEASY-cat-sacB为模板使用磷酸化的上下游引物P5(GTGACGGAAGATCACTTCGCAGA)和pccs-p6(ATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGC,SEQIDN0.:21)获得chisacB片段。[0091](4)连接chisacB片段和pMD18-catchiF片段，转化E.coliDH5a菌株，获得pMD-cat-ch1-sacB质粒。[0092]实施例6高效法无痕删除大肠杆菌fadE[0093](I)合成含有fadE两端同源区,5’端并行重复序列和cat_chi_sacB的单链DNA,命名为fadEII(SEQIDN0.:22)。[0094](2)片段fadEII电转化含pKD46的E.coliMG1655感受态细胞，孵育后涂布与含氯霉素的LB固体培养基。待长出后PCR检测，测序验证获得重组菌MGΔfadE::cat-ch1-sacB[0095](3)纯化MGAfadE::cat_chi_sacB,如附图5所示负筛选流程,取单菌落接种于IOOmLLB液体培养基，培养12h;取ImL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h:取300μL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h。[0096](4)取上述培养液适当稀释涂布10%蔗糖的LB固体培养基，待长出单菌落，以fadEpl和fadEp2为引物PCR检测，测序验证获得无痕删除菌株。[0097]实施例7高效法无痕删除大肠杆菌tesC[0098](I)利用PCR反应以E.coliMG1655基因组为模板，使用上下游引物tesCpl和tesCp2扩增大肠杆菌tesC基因及上下游部分序列获得tesCI片段，将该片段与pMD18_T获得pMD18-tesC。[0099](2)利用PCR反应以pMD18_tesC为模板，使用使用上下游引物tesCp3和tesCp4反向扩增获得tesCII片段。[0100](3)利用PCR反应以pMD-cat-ch1-sacB为模板，使用磷酸化上下游引物P5和tesCp6扩增获得tesCIII片段。[0101](4)连接片段tesCII和tesCIII，转化E.coliDH5α菌株，获得pMD-tesC-cat-ch1-sacB质粒。[0102](5)利用PCR反应以pMD-tesC-cat-ch1-sacB为模板，使用上下游引物tesCpl和tesCp2扩增获得tesCIV片段。[0103](6)片段tesCIV电转化含pKD46的E.coliMG1655感受态细胞，孵育后涂布与含氯霉素的LB固体培养基。待长出后PCR检测，测序验证获得重组菌MGΔtesC::cat-ch1-sacB。[0104](7)纯化MGAtesC::cat_chi_sacB,如附图5所示负筛选流程,取单菌落接种于IOOmLLB液体培养基，培养12h;取ImL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h:取300μL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h。[0105](8)取上述培养液适当稀释涂布10%蔗糖的LB固体培养基，待长出单菌落，以tesCpl和tesCp2为引物PCR检测，测序验证获得无痕删除菌株。[0106]实施例8高效法海洋杆菌FAR基因无痕替换大肠杆菌tesC[0107](I)使用引物FARF和FARR，以海洋杆菌基因组为模板获得FARSI片段。[0108](2)以pMD-tesC-cat-ch1-sacB为模板，用引物tesCp4和sacBR(ATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGCAC,SEQIDN0.:23)扩增获得FARSII片段。[0109](3)连接片段FARSI和FARSII，转化E.coliDH5α菌株，获得pMD-tesC-cat-ch1-sacB-FAR质粒。[0110](4)利用PCR反应以pMD—tesC-cat-ch1-sacB-FAR为模板，使用上下游引物tesCpl和tesCp2扩增获得FARSIII片段。[0111](5)片段FARSIII电转化含pKD46的E.coliMG1655感受态细胞，孵育后涂布与含氯霉素的LB固体培养基。待长出后PCR检测，测序验证获得重组菌MGΔtesC::cat-ch1-sacB-FAR。[0112](6)纯化MGΔtesC::cat-ch1-sacB-FAR,如附图5所示负筛选流程,取单菌落接种于IOOmLLB液体培养基，培养12h;取ImL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h:取300μL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h。[0113](7)取上述培养液适当稀释涂布10%蔗糖的LB固体培养基，待长出单菌落，以tesCpl和tesCp2为引物PCR检测，测序验证获得无痕替换菌株。[0114]实施例9高效法海洋杆菌FAR基因无痕插入大肠杆菌IdhA启动子下游[0115](I)利用PCR反应以E.coliMG1655基因组为模板，使用上下游引物FARIpl和FARIp2扩增大肠杆菌IdhA启动子上下游部分序列获得KldhAII片段，将该片段与pMD18_T获得pMD18-KldhAI。[0116](2)利用PCR反应以pMD18-KldhAI为模板，使用使用上下游引物FARIp3和FARIp4反向扩增获得FARIII片段。[0117](3)利用PCR反应以pMD-cat-ch1-sacB为模板，使用磷酸化上下游引物P5和FARIp6扩增获得FARIIII片段[0118](4)连接片段FARIII和FARIIII，转化E.coliDH5α菌株，获得pMD-ldhA1-cat-ch1-sacB质粒。[0119](5)利用PCR反应以pMD-ldhA1-cat-ch1-sacB为模板，使用上下游引物FARIp3和P5扩增获得FARIIV片段。[0120](6)使用磷酸化引物FARF和FARR，以海洋杆菌基因组为模板获得FARIV片段[0121](7)连接片段FARIIV和FARIV，转化E.coliDH5α菌株，获得pMD-ldhA1-cat-ch1-sacB-FAR质粒。[0122](8)利用PCR反应以pMD-ldhA1-cat-ch1-sacB-FAR为模板，FARIpl和FARIp2扩增获得FARIVI片段。[0123](9)片段FARSVI电转化含pKD46的E.coliMG1655感受态细胞，孵育后涂布与含氯霉素的LB固体培养基。待长出后PCR检测，测序验证获得FAR插入菌株MGKLFARI。[0124](10)纯化MGKLFARI，如附图5所示负筛选流程，取单菌落接种于IOOmLLB液体培养基，培养12h;取ImL培养液接种于含10%蔗糖的LB液体培养基，培养12h:取300μL培养液接种于含10%鹿糖的LB液体培养基,培养12h。[0125](11)取上述培养液适当稀释涂布10%蔗糖的LB固体培养基，待长出单菌落，以tFARIpl和FARIp2为引物PCR检测，测序验证获得无痕插入菌株。[0126]实施例10无痕敲除酵母菌FAAl[0127](I)合成含有FAAl两端同源区，5’端并行重复序列和URA3的单链DNA，命名为FAA-URA3(SEQIDN0.:24，也参见附图10)。[0128](2)片段FAA-URA3电转化酿酒酵母感受态细胞，孵育后涂布于SD培养基。待长出后PCR检测，测序验证获得FAAl敲除菌TAMkf。[0129](3)纯化TAMkf，取单菌落接种于SD+尿嘧啶液体培养基，培养24h;取ImL培养液接种于SD+尿嘧啶+5-F0A(即5-氟乳清酸)液体培养基，培养24h:取300μL培养液接种于SD+尿嘧啶+5-F0A液体培养基，培养24h。[0130](4)取上述培养液划线于SD+尿嘧啶+5-F0A固体培养基，培养50h，挑取单菌落后点对点培养于SD+尿嘧啶和SD固体培养基。[0131](5)选取在SD固体培养基不生长，在SD+尿嘧啶培养基生长的菌落，以FAApl(TTAGGATACAATAAAAACTAGAACAAACAC,SEQIDN0.:25)和FAAp2(CTATCATGGAAATGTTGATCC,SEQIDN0.:26)为引物PCR，测序验证获得无痕删除菌株。【权利要求】1.一种基因编辑方法，包括以下步骤:a.提供靶细胞，所述靶细胞包含带有待修饰位点的靶核酸；b.用包含所述待修饰位点的上下游同源序列、目的基因、并行重复序列和双向筛选标记基因的核酸片段转化所述靶细胞，以使所述核酸片段和靶核酸发生同源重组，从而在所述待修饰位点产生所需要的基因编辑；c.进行正筛选以筛选出在靶核酸上整合了目的基因和双向筛选标记基因的重组子细胞；d.允许所述核酸片段上的并行重复序列和待修饰位点的上游或下游的相应并行重复序列发生同源重组，以删除标记基因；e.进行负筛选以富集删除了双向筛选标记基因的重组子细胞。2.权利要求1的方法，其特征在于步骤b中核酸片段上的并行重复序列为靶核酸上待修饰位点上游或下游的原始序列。3.权利要求1的方法，其特征在于步骤b中核酸片段上的并行重复序列与靶核酸上紧邻待修饰位点的上游或下游的序列同源，以实现无痕编辑。4.权利要求1的方法，其特征在于步骤d中在不含正负筛选物质的培养基中培养步骤c筛选出的重组子细胞以允许所述核酸片段上的并行重复序列和待修饰位点的上游或下游的相应并行重复序列发生同源重组，从而删除标记基因。5.权利要求1-4中任一项的方法,其特征在于步骤b中的双向筛选标记基因包含一个或多个Chi位点以提高双向筛选标记基因删除的效率。6.权利要求5的方法，其特征在于在不影响双向筛选标记基因功能的前提下，将Chi位点引入到双向筛选标记基因的任意一个或多个位点。7.权利要求5的方法，其特征在于所述Chi位点可以是正向的或反向的，多个Chi位点之间可以是连续的或不连续的。8.权利要求5的方法，其特征在于在不同类型的基因组中可使用不同的Chi位点，在同一类型的基因组中可使用不同强度的Chi位点序列。9.权利要求1的方法，其特征在于所述方法用于原核细胞或真核细胞基因组任意位置基因的编辑。10.权利要求1的方法，其特征在于所述方法用于在质粒或人工染色体上进行基因编辑。【文档编号】C12N15/63GK103898140SQ201410148355【公开日】2014年7月2日申请日期:2014年4月14日优先权日:2014年4月14日【发明者】马延和,刘谊兰,邢建民,王钦宏申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所