一种与猪肉pH值性状相关的分子标记鉴定及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于家畜分子标记制备【技术领域】，具体涉及两个与猪肉pH值性状相关的SNP分子标记和由这两个SNP构成的单倍型定位及应用。该SNP分子标记由全基因组关联分析中得到，其核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO：1-2以及图2-3所示。再利用所得到的SNP经单倍型分析得到一个如图4所示的相应的单倍型。本发明的标记及单倍型可用于猪肉pH值性状相关检测中。
【专利说明】一种与猪肉PH值性状相关的分子标记鉴定及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于家畜分子标记制备【技术领域】，具体涉及两个与猪肉PH值性状相关的SNP分子标记和这两个SNP构成的单倍型的鉴定及应用。
【背景技术】
[0002]近几年，在猪育种工作中，提高瘦肉含量和降低背膘厚一直被育种者作为主要育种目标，并取得了显著的成效。但这种选育方式的遗传选择最终导致肌内脂肪含量的下降，进而导致猪肉品质的下降。随着消费者对肉质要求的不断提高，改善猪肉品质的遗传研究已成为畜牧业的研究热点。
[0003]肉质性状是一个复杂的性质。影响肉质的因素很多，包括遗传、营养、环境卫生、屠宰前的管理、屠宰工艺和屠宰后的加工处理。评定猪肉品质好坏的指标主要包括:肌内脂肪含量、大理石纹、pH、肉色、系水力、滴水损失、肌纤维特性(类型、直径、面积比等)及肉品中脂肪酸的组成等。
[0004]pH值是肉品质测定的最重要的指标之一。pH值直接体现了肌肉酸度，对猪肉品质影响很大。肉品PH值多用pH计直接测定。机体在屠宰后肌肉的运动机能被终止并处于缺氧状态，但新陈代谢仍在继续消耗ATP，短时间内磷酸肌酸由肌酸激酶使ADP变成ATP，除此之外不会再生成ATP，这时糖酵解产生的乳酸使肌肉pH值降低，但随着ATP分解生成的胺的积累和PH值的降低使糖原酵解的酶活性减弱甚至失活，最终导致糖酵解停止，肌肉的pH值达稳定状态(Kocwin-Podsiadla, Przybylski et al.1995)。
[0005]由于肉质性状的测定只能在屠宰后进行而且相对困难，因此采取传统的育种方法进行肉质改良受到一定的限制。此外，目前对影响肉质性状的基因的研究，以及这些基因之间的通路研究尚不全面透彻，同样限制了育种进展。而分子育种可以克服这些困难，为提高猪肉品质提供另一条研究途径，直接从DNA水平上分析数量遗传变异，使单个基因甚至单个位点对数量性状影响的检测成为可能。因此，采用分子遗传学方法从本质上提高猪肉品质越来越受到关注，已经成为该研究方向的重要研究途径。
[0006]虽然候选基因法和QTL定位已经在猪标记辅助选择中用于猪肉质性状遗传标记的发现，并取得了一定的成效，如猪与所有性状相关QTL有8421个。但是候选基因法只能检索预先设定候选基因，而不能识别新基因；QTL定位的限制在于QTL区域一般跨度很大，很难做到精细定位。如今，全基因组关联分析(Genome-wide Association Study,GffAS)已成为识别与重要经济性质有关的候选基因或特定地基因组区域的新策略。相对候选基因法和QTL定位，GWAS可以更准确的定位和识别新基因。它在家畜育种中已经得到广泛的应用，如提高奶牛产奶量等。随着猪高密度的SNP(Single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)芯片的开发，以及猪基因组测序工作的完成(Groenen，Archibald et al.), GffAS为猪的分子育种开辟了一个新领域。[0007]目前为止，已经确认为猪肉质性状的主效基因有氟烷基因、酸肉基因和PRKAG3基因。[0008]氟烷基因(Halothane gene, Hal)是最早被发现的影响猪肉品质的一个重要标记基因。它位于猪6号染色体的兰尼定受体I基因(RyanodinereceptorI, RYR1)的发生突变，其隐形基因对猪肉品质造成了不利影响，导致白肌肉(pale, soft and exudative, PSE肉)的产生(Hradecky, Hruban et al.1980 ;Reik, Rempel et al.1983 !Hamilton, Ellis etal.2000)。酸肉(RN)基因位于15号染色体，其不利的突变RN最先在汉普夏猪中被发现，使猪屠宰后肌肉pH值偏低，影响猪肉品质。PRKAG3(AMP — activatedProteinKinase3)基因主要影响猪肉的PH值、肉色及滴水损失。该基因中第R200Q发生突变是引起了 RN效应，使猪屠宰后24小时肌肉pH值降低，滴水损失增加(Milan, Jeon et al.2000 ；Lindahl, Enf ?It et al.2004 ；Lindahl, Enf ? It et al.2004 ；Zamaratskaia, Madej et al.2005)。对于猪肉质性状的候选基因，目前已有多例报道，其中研究得较清楚的是H-FABP、MC4R、IGF2、MyoG, Myostatin, ACSL, PPAR y , AMPDU ADDl 和 CAST。
[0009]前人研究表明，DNAJC3 (P58IPK)基因编码的蛋白在人和小鼠的所有组织中都有表达，尤其是在胰脏和肝脏中高表达(Korth，Lyons et al.1996)。胰岛β细胞中有功能强大的内质网负责折叠、转运和加工新合成的胰岛素(Harding and Ron2002)。各种破坏内质网功能的刺激称作内质网应激，会导致未折叠的蛋白质在内质网中积累(Schr ? der andKaufman2005)。DNAJC3是负反馈回路中的重要成分，可以抑制eIF_2 α信号通路，并减弱未折叠蛋白反应(Schr? der and Kaufman2005)。在小鼠中敲除DNAJC3基因后小鼠体重降低，即使自由采食10~12个月，小鼠的体脂〈10%，进而减少肥胖的产生。导致体脂减少的机制可能是β细胞的凋亡和可用胰岛素的减少，进而阻止葡萄糖向脂肪的转化和储存(Ladiges, Knoblaugh et al.2005)。当胰岛β细胞不能补偿适当胰岛素分泌时的胰岛素抵抗，就产生二型糖尿病。
[0010]在人的二型糖 尿病人的胰脏中发现DNAJC3的蛋白水平上调。二型糖尿病的产生与胰岛素信号通路的损伤有关。而胰岛素控制着肝脏、肌肉和脂肪组织中葡萄糖和脂质的动态平衡。在肝脏中，胰岛素促进葡萄糖和脂肪酸的合成。在肌肉和脂肪组织中，胰岛素可以刺激葡萄糖的摄入(Stiles，Wang et al.2004)。在屠宰时肌肉中葡萄糖的含量和糖酵解决定了屠宰后24小时后猪肉pH值的高低(Fernandez and Tornbergl991)。
[0011]目前，研究猪DNAJC3基因功能的报道很少， 申请人:运用全基因组关联分析的方法对这个基因的部分内含子进行了关联分析和多态研究，并首次在猪DNAJC3基因的内含子找到的肉质性状SNP分子标记及其单倍型。
【发明内容】
[0012]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供两个与猪肉pH值性状相关的SNP分子标记和这两个SNP构成的单倍型的鉴定及应用。本发明运用全基因组关联分析的方法寻找与猪肉PH值性状相关的SNP分子标记及单倍型，以此作为猪肉pH值性状相关的SNP分子标记及单倍型在标记辅助选择中的应用。
[0013]本发明通过以下技术方案实现:
[0014] 申请人:通过克隆得到一个与猪肉pH值性状相关的SNP分子标记，该分子标记的核苷酸序列如下所示:
[0015]AGACGTGGCTTGGACCTGGCGTTGCTCTATGTCTGTGGTGTAGACCGGTGGCTGCAGCTCCGGTTCAACCCCTGGCCTGG GATCCTCCATAGGCTGCAGGTGCAGTCCTAAAACAAAAACACTCTTTGTTTTAATTTAACAATCCTCTAAATTAAATTTT TGTTTGATTTT R GGGTAAATCAGCTCTGTGGCTACAAAAAATAAAAGATCGTTCTAGGGCTGCCACTGACTTGAGCTTG TTATTTTCTCTCTGTAAGTGCTCTAATGTGCTCAACAGAATCTATCCCAGTGTCCCAGCCC
[0016]上述序列172位的碱基R是C或T，导致多态性。
[0017]本发明通过克隆得到另一个与猪肉pH值性状相关的SNP分子标记，该分子标记的核苷酸序列如下所示:
[0018]AGAGAGGACCAGGGCCAGGAGCTGAGTCTCTACAGCCGTGGAAGGTTTGGGCTGGGAGTGTCATGACAGGTGGGCTTTGA GGGAAACAGGTAGACATTTAGAACGTTAGATAAGGAAAGATGCCATGACTGGAGAAGGGAGAAGGAAGAATTAAGTAAGA TGCCCA RGTTTTTGGAGTGTTCAAATTGGTATGTGTTCAAGCTGTTCCCTGAGAAATTATTTAGAGGAGAAGAAAGGGT ACAAAAAATACAGCTCTCATAAAGACTTCCTGATTCTCAGCAGTTTATTTAATAATTTCTA
[0019]上述序列的167位中的碱基R是A或G，导致多态性。
[0020]上述制备的分子标记可以单独或组合使用在猪肉pH性状检测中的应用。
[0021] 申请人:提供了一种与猪肉pH值性状相关的SNP分子标记的制备方法，其在于下列步骤:
[0022]I)提取猪基因组DNA;
[0023]2)采集猪的背最长肌，用pH计测量三次试验猪背最长肌肉样的pH值，取三次所测结果的平均值作为该肉样的PH值；
[0024]3)将猪基因组DNA样品在全基因组芯片上做基因分型；
[0025]4)采用PLINK软件进行全基因组关联分析；从中选取与屠宰后24小时的猪肉pH值显著关联的SNP,运用Ensembl网站的Variant Effect Predictor工具，注释该SNP ;然后利用生物信息学方法，对目标区域内的基因进行功能注释；通过QTLdb网站检索该位点是否落在报道的与猪肉PH值性状有关的QTLs中，进一步确定与猪肉pH值性状相关联的SNPs ;利用Haploview进行连锁不平衡分析和单倍型分析。
[0026]本发明通过全基因组关联分析(GWAS)的方法得到与猪的部分肉质性状特别是与猪肉PH值性状相关联的SNP分子标记，为猪的分子标记辅助选择提供了两个新的分子标记和一个单倍型。
[0027]更详细的技术方案参见《【具体实施方式】》。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]序列表SEQ ID NO:1是从NCBI网站下载的与猪肉质性状相关基因DNAJC3内含子I部分核苷酸序列，经过检测分析得到本发明的第一个分子标记，序列长度为300bp，在该序列的172bp处存在一个等位基因的突变，即由C突变为T。
[0029]序列表SEQ ID NO:2是从NCBI网站下载的与猪肉质性状相关基因DNAJC3内含子IV部分DNA序列。经过检测 分析得到本发明的第二个分子标记，序列长度为300bp，在该序列的167bp处存在一个等位基因的突变，即由A突变为G。
[0030]图1:是本发明的技术流程图。
[0031]图2:本发明克隆的猪DNAJC3基因内含子I的部分序列，其中位于猪11号染色体DNAJC3基因第I个内含子第23633位碱基处(在本克隆的片段中的第172bp处)的即括号内为等位基因的突变位点。
[0032]图3:本发明克隆的猪DNAJC3基因内含子IV的部分序列，其中位于猪11号染色体DNAJC3基因第4个内含子第8181位碱基处(在本克隆的片段中的第167bp处)的即括号内为等位基因的突变位点。
[0033]图4:本发明分析得到的由多态性位点rs80855156和rs80882127构成的一个单倍型。
【具体实施方式】
[0034]一、实验样品采集
[0035]实验猪群来自湖北金林原种畜牧有限公司种猪场的233头纯种大白猪公猪(已阉害I]，体重为90kg左右)。猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。[0036]在屠宰前，采集所有试验猪的耳组织样品，放入75%乙醇中保存，为提取猪基因组DNA(具体方法参照北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒提供的说明书)备用。屠宰完后，从胸、腰椎间砍断脊柱与眼肌。然后切取左半胴体背最长肌为肉样，用于肌肉品质测定。
[0037]二、背最长肌pH值测定
[0038]试验猪死亡后24h，用手术刀在胴体上划开一个小口，将电子温度计插入样品中测定温度，并根据当时室温用pH = 4.0和pH = 7.0的标准液对酸度计进行标定；于样品最少Icm深处用手术刀或剪刀将肉样捣碎；小心地将探头插入捣碎的肉样中，让探头与肉样充分接触；待酸度计读数稳定时，记下PH值；然后在采样部位另选两处，按上述同样的方法进行测定；取三次检测结果的平均值，作为该肉样的PH值。
[0039]二、猪基因组DNA的提取与检测
[0040]试验采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANamp GenomicDNA Kit)从猪耳组织中提取猪基因组DNA，具体操作步骤如下:
[0041]I)用眼科手术剪(用前酒精棉擦拭干净)将取自大白猪耳样剪成糊状，加200 μ I缓冲
[0042]液GA (该试剂盒自带)，振荡至彻底悬浮。
[0043]2)加入20 μ I蛋白酶K溶液(该试剂盒自带)，混匀，置于56°C水浴锅消化过夜。
[0044]3)加入200 μ I缓冲液GB (该试剂盒自带)，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶
液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0045]4)加入200 μ I无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0046]5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(~13，400Xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0047]6)向吸附柱CB3中加入500 μ I缓冲液⑶(该试剂盒自带)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0048]7)向吸附柱CB3中加入600 μ I漂洗液PW(该试剂盒自带)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0049]8)重复操作步骤7。
[0050]9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0051]10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μ 1洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，OOOrpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0052]11)取2 μ L上一步所得溶液DNA溶液和I μ L加样缓冲液混匀，上样于1.2%的琼脂糖凝胶，120V电压电泳20分钟左右，紫外灯下观测电泳结果并拍照，以判断DNA的完整性。用 NanoDrop2000 核酸蛋白分析仪(Thermo Fisher Scientific,USA)对提取后的 DNA进行质量检测，A260/A280的比值在1.7-2.1之间，A260/A230在1.8-2.2之间被判定为合格。对合格的DNA进行浓度测定，然后将浓度统一稀释至200ng/ μ L，放入_20°C的冰箱存放。不合格的DNA样品则需要重新提取。
[0053]四、SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控
[0054]将233头猪耳样中提 取的基因组DNA样品在Illumina公司研制的PorcineSNP60BeadChip全基因组芯片上杂交。该芯片中包含61177个SNP位点。
[0055]采用PLINK软件对所有个体的原始基因型数据进行质控检验，以SNP基因型检出率(SNP call rate) >90%、最小等位基因频率(minor allele frequency, MAF) >0.01、哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE)检验的P值〈10-6以及样本检出率(sample call rate) >90%等指标为标准。
[0056]五、数据整理与分析
[0057]I)表型数据分析
[0058]利用SAS9.2统计分析软件，对屠宰后24小时的pH测定值，进行描述性统计分析，包括计算该性状的平均值、标准差、最大值和最小值。
[0059]2)全基因组关联分析
[0060]采用PLINK软件，进行GWAS分析。 申请人:运用下述混合模型分析数据。模型为:
[0061]Yij = μ +Genotypei+ ε i j
[0062]其中，Yij为处理后的性状值；μ为每个性状的均值；genotypei为基因型效应；ε ij为随机效应。
[0063]3)检验SNP与性状关联的显著性。
[0064]当某个SNP符合P〈10_4条件时，我们就认为这个SNP达到了全基因组的基因组水
平显著。
[0065]4) SNP 注释
[0066]根据芯片SNP 信息，在 Ensembl 网站(www.ensembl.0rg)的 Sus scrofa Buidl0.2数据库中，运用Variant Effect Predictor工具,注释该SNP,即确定SNP位点所在染色体及其在染色体上的物理位置，并由此确定这些显著SNPs在Ensembl数据库中已知基因的内部还是侧翼区域内。然后利用生物信息学方法，根据Ensembl、NCBI (www.ncb1.nlm.nih.gov)、DAVID(david.abcc.ncifcrf.gov)等网站提供的基因结构、基因类型、基因功能和通路等信息，对目标区域内的基因进行功能注释。最后通过QTLdb (cn.animalgenome.0rg/cg1-bin/QTLdb/index)网站检索该位点是否落在已报到的与肉质性状有关的QTLs中，进一步确定与猪肉质性状相关联的SNPs。
[0067]5)单倍型分析
[0068]选定染色体上包含所有与pH值性状相关的显著SNPs的区域，并利用Haploview(Version4.2)进行连锁不平衡分析和单倍型分析。具体步骤如下:将待分析的SNP相应的map文件和ped文件导入到Haploview软件分析。其中，map文件有两列，一列是SNP的ID号，一列是该SNP在染色体上的位置(参照NCBI数据库猪10.2版的基因组)；ped文件的前六列是固定的，依次为家系ID、个体ID、父本ID、母本ID、性别(“I”代表公畜；“2”代表母畜)、表型值，其次是基因型。
[0069]六、结果分析
[0070]对猪DNAJC3基因内含子I多态性位点rs80855156 (ASGA0051428)基因型检测结果表明在233个个体中AA(TT)基因型有7个，AB (TC)基因型有61个，BB (CC)基因型有165个。所分析的肉质性状是屠宰后24小时的pH。所得到的相关性状是屠宰后24小时的pH。结果见表2。
[0071]表1DNAJC3基因内含子I多态性位点rs80855156基因型与屠宰后24小时pH的关联分析
[0072]
【权利要求】
1.一个与猪肉PH值性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示:
AGACGTGGCTTGGACCTGGCGTTGCTCTATGTCTGTGGTGTAGACCGGTGGCTGCAGCTCCGGTTCAACCCCTGGCCTGG GATCCTCCATAGGCTGCAGGTGCAGTCCTAAAACAAAAACACTCTTTGTTTTAATTTAACAATCCTCTAAATTAAATTTT TGTTTGATTTT R GGGTAAATCAGCTCTGTGGCTACAAAAAATAAAAGATCGTTCTAGGGCTGCCACTGACTTGAGCTTG TTATTTTCTCTCTGTAAGTGCTCTAATGTGCTCAACAGAATCTATCCCAGTGTCCCAGCCC 上述序列172位的碱基R是C或T，导致多态性。
2.一个与猪肉pH值性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示:
AGAGAGGACCAGGGCCAGGAGCTGAGTCTCTACAGCCGTGGAAGGTTTGGGCTGGGAGTGTCATGACAGGTGGGCTTTGA GGGAAACAGGTAGACATTTAGAACGTTAGATAAGGAAAGATGCCATGACTGGAGAAGGGAGAAGGAAGAATTAAGTAAGA TGCCCA RGTTTTTGGAGTGTTCAAATTGGTATGTGTTCAAGCTGTTCCCTGAGAAATTATTTAGAGGAGAAGAAAGGGT ACAAAAAATACAGCTCTCATAAAGACTTCCTGATTCTCAGCAGTTTATTTAATAATTTCTA 上述序列的167位中的碱基R是A或G，导致多态性。
3.权利要求1或2所述的SNP分子标记构成一个猪基因型的单倍型的标记。
4.权利要求1或2所述的分子标记单独或组合使用在猪肉pH值性状检测中的应用。
5.一种与猪肉pH值 性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于下列步骤: 1)提取猪基因组DNA； 2)采集猪的背最长肌，用pH计测量三次试验猪背最长肌肉样的pH值，取三次所测结果的平均值作为该肉样的PH值； 3)将猪基因组DNA样品在全基因组芯片上作基因分型； 4)采用PLINK软件进行全基因组关联分析，从中选取与屠宰后24小时的猪肉pH值显著关联的SNP,运用Ensembl网站的Variant Effect Predictor工具，注释该SNP,然后利用生物信息学方法，对目标区域内的基因进行功能注释，通过QTLdb网站检索该位点是否落在报道的与猪肉PH值性状有关的QTLs中，进一步确定与猪肉pH值性状相关联的SNPs ；利用Haploview进行连锁不平衡分析和基因型的单倍型分析。
【文档编号】C12Q1/68GK103911377SQ201410176021
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】曹建华, 董谦, 赵书红, 李新云 申请人:华中农业大学