调节谷子抗逆能力的转录因子SiARDP及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种调节谷子抗逆能力的转录因子SiARDP及其编码基因与应用。所述转录因子的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，编码基因如SEQ?ID?No.2所示。利用所述调节谷子抗逆能力的转录因子SiARDP及其编码基因，本发明提供了增强植物抗非生物胁迫的新方法，有利于农业生产。
【专利说明】调节谷子抗逆能力的转录因子SiARDP及其编码基因与应 用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因，具体地说，涉及一种调节谷子抗逆能力的转录因子SiARDP 及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 自然界中植物的生长和发育会受到许多不良自然灾害的影响，其中干旱、高温、低 温、盐碱和病虫害是限制作物产量的主要因素。我国正处在快速工业化进程中，随着工业化 的加剧，环境所承受的压力越来越大，各种极端的气候频频出现，严重威胁着我国的粮食安 全。干旱是我们国家面临的严重环境威胁之一。据统计，我国大约有1/2的国土面积处在 干旱和半干旱状态，并且我国的水资源呈现南多北少、东多西少分布不均的现象。因此，研 究植物本身的抗旱机制，提高植物对干旱胁迫的耐受力，从而获得适宜干旱半干旱地区种 植且具有优良农艺性状的作物品种，在实际的农业生产中具有非常重要的意义。
[0003] 在植物逆境胁迫信号转导通路中，DREB和AREB类转录因子是两类起调控作用重 要因子，它们分别属于不依赖ΑΒΑ和依赖ΑΒΑ的信号转导通路。从1997年利用酵母单杂首 次克隆到DREB类转录因子到目前，对DREB类转录因子的研究已经有十多年的时间。DREB 类转录因子主要参与植物抵御非生物胁迫的信号调控。在植物中不同的DREB类转录因子 有着不同的功能，有的对植物中胁迫应答下游基因起到激活作用，有的起到抑制作用，有的 在植物中超表达会影响转基因植株正常生长，有的则不会影响。对DREB类转录因子下游靶 基因的研究发现，不同的转录因子对所结合的DRE元件碱基偏好性不同，所以它们下游所 选择的靶基因也不同。对DREB转录因子上游调控基因的研究，首先被报道的是ICE1，可以 调控与低温胁迫相关的DREB1的转录。但对于DREB2类转录因子的调控报道较少。目前， 大部分DREB类转录因子属于不依赖ΑΒΑ的信号通路，但已有很多报道显示部分DREB类转 录因子的转录水平会受外源ΑΒΑ的诱导。这些DREB类转录因子在受到非生物胁迫时很可 能参与到依赖和不依赖ΑΒΑ的两种信号通路中，这说明非生物胁迫调控网络中两种信号通 路并不是相对孤立的，而是相互联系，相互补充的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种调节谷子抗逆能力的转录因子SiARDP及其编码基因与 应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种调节谷子抗逆能力的转录因子 SiARDP，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0006] 本发明还提供了编码所述转录因子SiARDP的基因。
[0007] 进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0008] 本发明还提供了含有前述基因的载体。
[0009] 本发明还进一步提供了前述转录因子在提高植物抗逆性上的应用，所述转录因子 通过调控干旱胁迫相关基因的表达来提高植株耐旱能力。
[0010] 本发明还进一步提供了前述基因在提高植物耐旱能力上的应用，超表达所述基因 能够提商植物对干旱和商盐的耐受:力。
[0011] 本发明的有益效果在于：
[0012] 本发明首次通过酵母单杂技术从谷子非生物胁迫cDNA文库中筛选到了一个编 码 DREB 类转录因子的 cDNA，称之为 SiARDP。qRT-PCR(quantitative real-time PCR)和 Northern blot结果显示SiARDP受干旱、高盐、脱落酸（abscisic acid, ABA)和低温诱导 表达（图2)。SiARDP基因在谷子的根、茎、叶和花序中都有表达，并且在叶中表达量较高。 谷子原生质体亚细胞定位显示SiARDP蛋白定位于细胞核；凝胶阻滞（electrophoretic mobility shift assay, EMSA)实验表明原核表达的SiARDP-His融合蛋白能与DRE元件结 合；酵母转录激活实验证明SiARDP蛋白具有转录激活活性。在拟南芥中异源表达SiARDP 基因能够提高植物对干旱和高盐的耐受力，干旱胁迫下转基因植株比野生型植株积累更多 的脯氨酸，高盐胁迫下转基因植株的离子渗透率低于野生型植株。在谷子中超表达SiARDP 提高了转基因谷子的耐旱性，并且干旱胁迫下转基因谷子比野生型谷子积累了更多的脯氨 酸。超表达转基因谷子中多个启动子区存在DRE元件与干旱胁迫相关基因的表达量升高， 说明超表达谷子植株中SiARDP通过调控干旱胁迫相关基因的表达来提高植株耐旱能力。
[0013] 本发明利用所述的调节谷子抗逆能力的转录因子SiARDP及其编码基因，提供了 增强植物抗非生物胁迫的新方法，有利于农业生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为本发明所述基因 SiARDP的核甘酸序列。
[0015] 图2为本发明所述基因 SiARDP胁迫处理下的表达模式分析。
[0016] 图3为本发明所述基因 SiARDP在谷子原生质体中的亚细胞定位；A :红色荧光；B : 绿色荧光；C :绿色荧光与红色荧光叠加 ；D :明场；Bar = 10 μ m。
[0017] 图4为本发明所述基因 SiARDP转录活性检测。
[0018] 图5为T3代SiARDP转基因拟南芥RT-PCR检测。
[0019] 图6为SiARDP转基因拟南芥种子抗旱与抗盐分析。
[0020] 图7为SiARDP转基因拟南芥幼苗抗盐分析。
[0021] 图8为SiARDP转基因拟南芥植株盐胁迫下离子渗漏分析。
[0022] 图9为野生型和SiARDP转基因植株干旱胁迫下的表型分析。
[0023] 野生型和转基因拟南芥干旱处理表型分析。正常条件下生长3周的拟南芥停止浇 水两周，复水5天，结果重复三次。
[0024] 图10为野生型和SiARDP转基因植株干旱胁迫下存活率和脯氨酸含量分析。
[0025] A :干旱胁迫下存活率统计；B :干旱胁迫下拟南芥植株的游离脯氨酸含量测定。
[0026] 图11为谷子抗性愈伤的筛选和再生植株的获得；
[0027] A :转化前幼穗诱导的愈伤组织；B :抗性筛选后的潮霉素抗性愈伤组织；C :抗性愈 伤分化出苗；D :瓶中的谷子再生植株；E :花盆中的谷子再生植株；F :温室中的谷子再生植 株。
[0028] 图12为SiARDP超表达转基因谷子在干旱胁迫下的表型分析
[0029] A :野生型和转基因谷子干旱胁迫下表型分析；B :干旱处理后，存活率统计；C :干 旱胁迫下野生型和转基因植株脯氨酸含量分析。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0031] 实施例1受非生物胁迫诱导基因 SiARDP的克隆
[0032] 将受干旱、盐和低温胁迫的谷子材料混合后，提取总RNA，构建cDNA文库。以 RD29A启动子区DRE元件序列（ATACTACCGACATGAGC)为诱饵，利用Clontech公司酵母单杂 试剂盒，从谷子非生物胁迫cDNA文库中克隆到了 SiARDP,其全长序列见图1。Northern和 qRT-PCR分析显示，该基因受ΑΒΑ处理和干旱等非生物胁迫的诱导（图2)。
[0033] 实施例2SiARDP具有转录因子功能
[0034] 为了研究SiARDP在细胞中的定位情况，构建了带有GFP标签的质粒 35S: SiARDP-GFP。另外，以已知核定位的AHL22为正对照，构建带有RFP标签的质粒 35S:AHL22-RFP。将两个质粒共转化谷子黄化苗的原生质体，避光培养16小时后在激光共 聚焦显微镜下观察SiARDP蛋白定位。结果显示，SiARDP定位位置与AHL22相同，定位于 细胞核中（图3)，这与预测SiARDP为转录因子的性质相吻合。利用酵母转录激活系统对 SiARDP的转录活性进行了分析。将SiARDP构建到pBD-GAL4质粒中，转化酵母YRG-2。将 转化得到的阳性酵母用无菌水稀释至〇D 6(?为0. 5,点10 μ L至相应营养缺陷培养基上，培 养3天观察。结果显示转SiARDP酵母与转正对照的酵母在双缺培养基上能生长，并且能激 活LacZ表达，而转负对照酵母不能在双缺培养基上生长并且不能激活LacZ表达。这说明 SiARDP作为转录因子具有转录激活活性（图4)。
[0035] 实施例3SiARDP异源表达拟南芥植株的获得
[0036] 为了研究SiARDP的功能，构建了 35S启动子驱动的SiARDP表达载体 p35S: SiARDP，并通过农杆菌介导转化法将p35S: SiARDP转入野生型拟南芥植株中。通过潮 霉素筛选共得到48株阳性植株，经过两代筛选，在T3代得到的纯合单拷贝植株中选出3株 作为进一步研究的材料，分别命名为L4、L15和L22。分别提取野生型和转基因拟南芥总RNA 进行PCR检测和RT-PCR检测，引物为RT-SiARDPS和RT-SiARDPR，转基因植株均有SiARDP 插入并且转录表达（图5)。
[0037] 实施例4异源表达拟南芥植株的抗旱和抗盐性分析
[0038] 为了研究SiARDP在逆境胁迫中的作用和功能，首先观察了野生型拟南芥和转基 因拟南芥萌发阶段对干旱胁迫和盐胁迫的响应。将春化处理后的拟南芥种子分别点种于含 有200mM、300mM甘露醇和100mM、150mM、175mM NaCl的MS培养基中，萌发生长8天观察并 测定胁迫处理材料的生物量。结果显示，在不同胁迫处理条件下，转基因拟南芥的萌发和生 长状态都好于野生型拟南芥（图6)。这说明异源表达SiARDP的拟南芥在萌发阶段的抗旱 和抗盐能力要强于野生型植株。为了进一步验证SiARDP在盐胁迫下的功能，将MS培养基 上萌发生长5天的野生型和转基因拟南芥幼苗转移至含有0、150、200、250禮似(：1的1^培 养基中处理4天并观察结果。实验结果显示，转基因拟南芥和野生型拟南芥在无 NaCl胁迫 MS培养基中生长无差别，但在NaCl胁迫下尤其是在250mM NaCl处理下，野生型拟南芥叶 子完全白化，而转基因拟南芥植株生长状态相对较好（图7)。离子渗漏率分析显示在NaCl 胁迫处理下，转基因植株与野生型相比具有更低的离子渗漏率（图8)，说明转基因植株在 抵御NaCl胁迫方面要强于野生型植株。为了验证SiARDP在干旱胁迫下的功能，我们将在 土中正常生长3周的野生型和转基因拟南芥幼苗停止浇水两周后，再恢复浇水4天，重复三 次（图9)，统计存活率。数据为三次实验的平均值土SD，*P〈0. 05, #P〈0. 01 (t-test)。存 活率显示，约5 %的野生型拟南芥干旱处理后能存活，而转基因拟南芥的存活率可达58 %。 游离脯氨酸是重要的渗透调节物，干旱胁迫下可以对细胞进行保护。游离脯氨酸含量检测 显示，转基因拟南芥中游离脯氨酸的积累量要高于野生型拟南芥（图10)。
[0039] 实施例5SiARDP超表达谷子的获得
[0040] 为了进一步明确SiARDP功能，构建了 Ubiqutin启动子驱动的SiARDP超表达载 体pUbi-SiARDP-hpt，用于谷子转化。选取生长状态良好的冀谷11号幼穗（幼穗长度小于 1. 5cm为宜）为材料，切成长度约为0. 5cm的小段，放置在诱导培养基上28°C黑暗培养，诱 导愈伤，每两周继代一次，继代培养2-3次后，挑选生长状态较好、质地紧密、颜色鲜黄的谷 子愈伤作为外植体，通过农杆菌介导将构建好的超表达载体进行转化。转化后的谷子愈伤 在恢复培养基上黑暗恢复培养一周，然后将愈伤转到含有潮霉素的筛选培养基上进行抗性 筛选。每两周继代一次，两次筛选潮霉素浓度分别为5mg/L和8mg/L。两轮筛选后的愈伤组 织已经大部分褐化，少部分愈伤仍为黄色，为抗性愈伤。将抗性愈伤转移至分化培养基见光 分化（光周期为16h光照/8h黑暗，28°C )，每两周继代一次。抗性愈伤见光分化两周之内 在愈伤表面出现绿色芽点。当再生幼苗长出主茎后，除去周围多余的叶子，移入生根培养基 进行生根，生根培养基中含有5mg/L的潮霉素进一步筛选谷子阳性幼苗。大部分谷子幼苗 不能在含有潮霉素的生根培养基中生长，不能长出根系，叶子褐化死亡。少部分谷子在含有 潮霉素的生根培养基中能够长出根系，根系发达后，将谷子幼苗移至温室炼苗3天，洗净根 上残留的培养基后，将谷子再生苗移栽至小花盆中，一至两周后，再将成活的谷子小苗移栽 至温室土壤中继续生长（图11)。
[0041] 实施例6SiARDP超表达谷子的抗旱性分析
[0042] 为了研究SiARDP在谷子干旱胁迫下的功能，选取了两个SiARDP超表达转基因株 系（L7和L15)的T2代植株进行研究。为了验证SiARDP是否在干旱胁迫下发挥作用，我们 对野生型谷子和SiARDP超表达转基因谷子进行了干旱胁迫处理。将吸胀1天后的野生型 和转基因谷子种子每盆12棵种于土中，在28°C正常生长条件下生长2周，停止浇水，干旱处 理2周，再恢复浇水，4天后观察。存活率统计结果显示，干旱处理条件下野生型植株存活率 低于10%，而SiARDP超表达转基因植株存活率在50%以上。对干旱胁迫10天和12天时 野生型和转基因谷子中游离脯氨酸含量进行分析，结果在转基因植株中脯氨酸含量积累较 多，尤其胁迫处理12天时转基因植株中脯氨酸积累要明显高于野生型植株（图12)。这些 结果说明，SiARDP超表达植株对干旱胁迫表现出较强的耐受力。
[0043] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0001] 序列表 <110>中国农业大学 <120〉调节谷子抗逆能力的转录囚子SiARDP及其编码基因与应用 <130> KHP141112613.0 <160〉 2 <丄70> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 333 <212> PRT <213〉 SiARDP <400> 1 Met Thr Val Asp Leu Lys Gin Ala Met Pro Met Gin Ala Gin Ala Met 15 10 15 Gin Pro Gly Ser Arg Lys Lys Arg Pro Arg Arg Leu Arg Asp Gly Pro 20 25 30 Thr Ser Val Ala Ala Val lie Gin Arg Trp Ala Glu His Asn Lys Gin 35 40 45 Leu Glu His Asp Ser Glu Gly Ala Lys Arg Pro Arg Lys Ala Pro Ala 50 55 60 Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn 65 70 75 80 Thr His Cys Gly Tyr Arg Gly Val Arg Gin Arg Thr Trp Gly Lys Trp 85 90 95 Val Ala Glu lie Arg Glu Pro Asn Arg Ala Asn Arg Leu Trp Leu Gly 100 105 110 Thr Phe Pro Thr Ala Glu Asp Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Gin Ala Ala 115 120 125 Arg Ala Met Tyr Gly Glu Val Ala Arg Thr Asn Phe Pro Arg Gin Asn 130 135 140 Ala Va] Ala Ser Ser Gin Va] Ala Trp Ala Ala Thr Pro Ala Gin Val 145 150 155 160 Ala Pro Ser Val Val Glu Gly Val Val His Ser Thr Ser Cys Glu Ser
[0002] 165 170 175 Thr Thr Thr Ser Asn His Ser Asp He Ala Ser Thr Leu His Lys Pro 180 185 190 Glu Val Ser Asp Leu Ser Ser Ser Val Lys Val Glu Cys Pro Glu Val 195 200 205 Val Glu Ala Gly Ser Arg Krg Ser Glu Met Val Ser Gly Thr Ser His 210 215 220 Gin His Glu Asp Ser His Pro Ser Thr Gin Ala Ser Thr Pro Asn Val 225 230 235 240 Gly Asp Lys G丄u Val Phe Glu Pro Leu G丄u Pro lie Ala Asn Leu Pro 245 250 255 Glu Gly Asp Phe Asp Gly Phe Asp lie Asp Glu Met Leu Arg Met Met 260 265 270 Glu Ala Asp Pro Gin Asn Glu Gly Gly Ala Gly Ala Gly Met Glu Gin 275 280 285 Pro Phe Tyr Phe Asp Gly Leu Asp Ser Ser Leu Leu Glu Ser Met Leu 290 295 300 Gin Ser Glu Ser Glu Pro Tyr Ser Leu Phe Glu Glu Gin Asp Met Phe 305 310 315 320 Leu Ala Gly Phe Glu Ser Pro Gly Phe Phe Glu Gly Leu 325 330 <210〉 2 <211> 1002 <212> DNA <213> SiARDP <400> 2 atgacggtgg atctgaagca ggccatgccg atgcaggcgc aggccatgca gcccggaagc 60 aggaagaagc gtcctcgcag attgcgcgat gggccaacct cagtggcagc tgtcatccag 120 cggtgggctg agcacaacaa gcagttggag cacgattctg agggcgcgaa gcgaccaagg 180 aaagcacctg ctaagggttc aaaaaagggc tgcatgaegg gaaaaggagg gcctgagaat 240 acrdGactgtg g-aLaccgLgg agLgaggcag eg'iacL Lggg gLaagLgggL Lgctgaaalc 300 cgagagccga atcgggccaa cagactctgg ctggggacct tcccaactgc agaggatgca 360 gccagggcct atgatcaggc ggccagagcg atgtatggag aagtcgcccg caccaacttc 420
[0003] cccagacaga atgcagtggc ctctagccaa gttgcttggg cggcaacccc tgcccaggtt 480 gctccatcag ttgttgaagg tgttgtacat agcacatcat gcgagtcaac gacaacatca 540 aatcactcag atattgcatc caccttgcat aagccggaag tatccgacct ttcaagctct 600 gtgaaggtgg agtgcccaga agttgtggag gctggttcac gtaggtctga gatggtatct 660 ggtacttcgc atcagcatga agacagccat cccagtaccc aagctagcac acccaatgta 720 ggtgacaagg aagttttcga gccacttgaa cctattgcca accttccaga gggtgatttt 780 galggttttg atattgatga gatgctgaga atgatggaag ctgatccaca gaalgaaggt 840 ggtgctggtg ctggcatgga gcagcccttt tactttgatg ggttggattc aagtttactg 900 gagagtatgc tccagtcgga gtcagagcca tattccctgt ttgaggaaca ggacatgttc 960 cttgctggct ttgaaagtcc tggttttttc gagggcctgt ag 1002
【权利要求】
1. 一种调节谷子抗逆能力的转录因子SiARDP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 编码权利要求1所述转录因子SiARDP的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
4. 含有权利要求2或3所述基因的载体。
5. 权利要求1所述的转录因子在提高植物抗逆性上的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转录因子通过调控干旱胁迫相关基 因的表达来提高植株耐旱能力。
7. 权利要求2或3所述基因在提高植物耐旱能力上的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，超表达所述基因能够提高植物对干旱和 商盐的耐受:力。
【文档编号】C12N15/84GK104059138SQ201410175682
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】于静娟, 李丛, 岳静 申请人:中国农业大学