一种用于植物寄生线虫基因组dna微量提取的裂解液及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液及其应用，其关键创新点为新发明的裂解液可直接用于植物寄生线虫全基因组DNA的微量提取，无需切割、挤破、研磨、冻融线虫，操作步骤更加简捷，最大程度地减少了DNA提取过程中样品污染和损失的环节，提取效率和成功率显著提高，有效地解决了以前植物寄生线虫DNA微量提取过程中存在的效率低、稳定性差、不易操作、步骤繁多等问题。利用本发明中的方法提取获得的线虫DNA满足植物寄生线虫DNA条码鉴定、RFLP酶切鉴定、特异引物PCR鉴定等分子检测技术的需求，可在我国口岸及农林部门检疫鉴定工作中推广应用。
【专利说明】—种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物寄生线虫检疫鉴定领域，提供了一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液及其应用，具体而言，所述方法通过使用新的DNA提取裂解液，极大地简化了植物寄生线虫基因组DNA提取程序，显著提高了 DNA提取效率和成功率，有效地解决了以前植物寄生线虫DNA微量提取过程中存在的效率低、稳定性差、不易操作、步骤繁多等问题，适用于口岸及农林业相关检疫鉴定实验室应用。
【背景技术】
[0002]传统的植物线虫鉴定方法主要依赖于形态特征和形态测量值，要求鉴定者要有极为丰富的经验和技巧。基于DNA的分子鉴定方法对鉴定者的要求相对较低，是形态鉴定的重要辅助手段，目前在线虫的分类鉴定中应用广泛。线虫分子鉴定的首要步骤是DNA的提取，通常来说包括线虫DNA大量提取和线虫DNA微量提取两种方法。而其中线虫DNA微量提取方法因其需要线虫量少、无需线虫纯化，同时具有简捷、廉价等优点，因而在线虫分子鉴定中备受青睐。
[0003]关于线虫DNA微量提取方法有较多的研究报道。Barstead等(1991)和Williams等(1992)使用WLB裂解液成功提取了单条秀丽小杆线虫的DNA，也是目前能够追溯的最早建立的线虫DNA微量提取方法。Stanton等(1998)以根结线虫的二龄幼虫为材料，系统比较了微波加热法、水浴加热法、蛋白酶裂解法、直接磨碎法和NaOH法提取线虫DNA的效果，发现NaOH法提取成功 率可达81 %，直接磨碎法成功率为50%，其它方法效率较低。沈锡权等(2005)从单条固定海洋线虫中提取得到基因组DNA，并用于18S rRNA基因PCR扩增，发现蛋白酶K法获得的DNA比NaOH裂解法所获得的更适合PCR扩增。2011年，王江岭等提出使用液氮替代-80 0C冰箱冷冻线虫，进一步提高了单条线虫DNA提取的效率，可高效、稳定的提取滑刃类线虫的DNA，但提取短体线虫时效果较差。王金成等(2012)对王江岭等建立的方法进行了再次改进，解决了单条短体线虫DNA微量提取问题。
[0004]虽然线虫DNA微量提取的方法很多，但大多数方法因操作复杂、步骤繁多或效率不高、稳定性不够等原因被淘汰，只有酶裂解法被广泛应用。但实践表明，酶裂解法的效率和稳定性仍然需要优化提高，操作步骤需要进一步简化，以适合更加多样的线虫DNA的提取。本研究以相对成熟的一种酶裂解法为基础，对其关键试剂一裂解液的组份和浓度进行了系统性的筛选和优化，以提出一种更加高效、稳定、廉价、简捷的线虫DNA微量提取方法，为植物寄生线虫的检疫鉴定提供部分技术支持。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有植物寄生线虫基因组DNA微量提取技术中存在的效率低、成功率低、步骤繁杂等缺陷，提供一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液及其应用，所述裂解液如下:[0006]所述裂解液的配方包含:
[0007]IOmM Tris-HCl (ρΗ8.3)，1.5mM MgCl2,60mM KCl，10mg/mL TritonX-100 (即曲拉通X-100)，0.2mM DTT (即二硫代苏糖醇)和 300 μ g/mL Proteinase K(即蛋白酶 K)。
[0008]进一步地，本申请提供一种上述裂解液的制备方法，其特征在于:
[0009]所述裂解液由10 XPCR Buffer (含 15mM 的 Mg2+)、IOOmM 的 KCl 溶液、IOOmg/mL的TritonX-100溶液、3000 μ g/mL的Proteinase K溶液、ImM的DTT溶液和双蒸水按1:1:1:1:2: 4的体积比混合配制而成。
[0010]进一步地，本发明涉及一种将上述裂解液用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的应用，其特征在于:
[0011]首先用双蒸水将线虫清洗干净，然后挑取单条线虫放入含5~20 μ L所述裂解液的PCR管中，最后56°C保温0.5~4h，95°C加热lOmin。经上述步骤提取获得的上清液即可用于分子实验。
[0012]优选地，裂解液的使用量为10~15μ L，56°C保温的时间为I~3h。
[0013]本申请的裂解液适用于多种植物线虫的基因组DNA微量提取，特别地，适用于穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、斯氏短体线虫(Pratylenchus scribneri) >松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(B.mucronatus)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)。 [0014]所述双蒸水即为经过两次蒸馏的无菌水，其通常用于分子生物学实验。
[0015]所述裂解液配制所需试剂中的10XPCR Buffer (含15mM的Mg2+)和ProteinaseK(即蛋白酶K)均为TAKARA公司生产，产品货号分别为R001B和9033 ;所述裂解液中的KCl(即氯化钾)为天津市风船化学试剂科技有限公司生产，分析纯，批号为2013408 ;所述裂解液中的TritonX-100 (即曲拉通-100)和DTT (即二硫代苏糖醇)均为上海源叶生物科技有限公司生产，产品货号分别为12023和11175。
[0016]与现有技术相比，本发明的进步在于:本发明的裂解液可直接用于植物寄生线虫全基因组DNA的微量提取，无需切割、挤破、研磨、冻融线虫，操作步骤更加简捷，最大程度地减少了 DNA提取过程中样品污染和损失的环节，提取效率和成功率显著提高，有效地解决了以前植物寄生线虫DNA微量提取过程中存在的效率低、稳定性差、不易操作、步骤繁多等问题。利用本发明的裂解液提取获得的线虫DNA满足植物寄生线虫DNA条码鉴定、RFLP酶切鉴定、特异引物PCR鉴定等分子检测技术的需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1使用裂解液I提取的线虫DNA样品用于核糖体ITS区PCR扩增检测结果；
[0018]图2使用裂解液2提取的线虫DNA样品用于核糖体ITS区PCR扩增检测结果；
[0019]图3使用裂解液3提取的线虫DNA样品用于核糖体ITS区PCR扩增检测结果；
[0020]图4使用裂解液4提取的线虫DNA样品用于核糖体ITS区PCR扩增检测结果；
[0021]图中各字母含义如下:泳道1-4:南京水稻干尖线虫；泳道5-8:拟松材线虫；泳道9-12:松材线虫；泳道13-16:穿刺短体线虫；泳道17-20:斯氏短体线虫。
【具体实施方式】[0022]为能进一步了解本发明的
【发明内容】
、特点及功效，兹举以下实施例，并配合附图详细说明如下:
[0023]标本来源
[0024]本实验测试了 5个线虫群体，其中包括I个穿刺短体线虫群体,I个斯氏短体线虫群体，I个松材线虫群体，I个拟松材线虫群体，I个水稻干尖线虫群体。详情见下表:
[0025]
【权利要求】
1.一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液，其特征在于，所述裂解液的配方包含:
IOmM Tris-HCl (pH8.3)，1.5mM MgCl2, 60mM KCl, 10mg/mL TritonX-100,0.2mM DTT 和300 μ g/mL Proteinase K0
2.根据权利要求1所述的裂解液的制备方法，其特征在于: 所述裂解液由 10XPCR Buffer、IOOmM 的 KCl 溶液、100mg/mL 的 TritonX-1OO 溶液、3000 μ g/mL 的 Proteinase K 溶液、ImM 的 DTT 溶液和双蒸水按 1:1:1:1: 2: 4 的体积比混合配制而成，所述IOXPCRBuffer含15mM的Mg2+。
3.根据权利要求1所述的裂解液用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的应用，其特征在于: 首先用双蒸水将线虫清洗干净，然后挑取单条线虫放入含5~20 μ L所述裂解液的PCR管中，最后56°C保温0.5~4h，95°C加热lOmin。经上述步骤提取获得的上清液即可用于分子实验。
4.根据权利要求3的应用，其特征在于，裂解液的使用量为10~15μL，56°C保温的时间为I~3h。
5.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述植物寄生线虫为穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、斯氏短体线虫(Pratylenchus scribneri)、松材线虫(Bursaphelenchu s xylophilus)、拟松材线虫(B.mucronatus)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)。
【文档编号】C12Q1/68GK104004748SQ201410257794
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月11日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】王金成, 顾建锋, 林宇, 张裕君, 冯洁, 陈先锋, 黄国明 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心