一种叶酸靶向磁性显色纳米粒及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种叶酸靶向磁性显色纳米粒及其制备方法，所述叶酸靶向磁性显色纳米粒包括四氧化三铁纳米粒、形成在所述四氧化三铁纳米粒表面与所述四氧化三铁纳米粒通过物理作用将其进行包裹的聚丁二炔纳米粒和形成在所述聚丁二炔纳米粒表面与所述聚丁二纳米粒通过化学键连接的叶酸分子。本发明的叶酸靶向磁性显色纳米粒具有聚丁二炔的显色性和变色性，又有四氧化三铁纳米粒的磁靶向作用，还保留有叶酸靶向作用。
【专利说明】一种叶酸靶向磁性显色纳米粒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米医学领域，涉及一种叶酸靶向磁性显色纳米粒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 含有丁二炔结构的有序排列的单体，在254 nm的紫外光照射下，通过拓扑聚合形 成薄膜或囊泡结构并显示特有的蓝色，这种聚丁二炔结构随着所处环境的温度、溶剂、pH及 其受到的机械应力的改变，其颜色都会发生蓝色到红色的变化，是生物传感器中的信号传 输元件的理想材料。当用物理或化学方法在聚丁二炔链端连接化学或生物敏感的基团，可 组装成聚丁二炔生物传感器。常用的化学法有：（1)活化的丁二炔羧基端与功能分子（如 抗体）与氨基端反应生成酰胺键；（2)通过巯基将功能分子连接到丁二炔上，包括可逆偶 联的二硫键和不可逆的硫醚键；（3)间接偶联法，利用了近年来新兴的一些标记分子，如分 别将聚丁二炔和功能分子（如抗体，DNA)生物素化，通过加入对生物素有特异性亲和力的 亲和素使两者连接起来。而物理方法是，制备带有疏水末端的受体，通过受体末端的疏水链 与含有丁二炔结构的分子的疏水链之间的相互作用，将功能分子引入聚丁二炔结构中，组 装成生物传感器，可使囊泡更稳定、可降低聚丁二炔构象变化的活化能，提高检测灵敏度， 主要用于病毒、细菌和蛋白等物质的检测。
[0003] 磁性四氧化三铁纳米颗粒是一种非常重要的磁性材料，因其具有独特的磁学性 能，可以广泛用作生物分离和检测领域等。同时，因磁性四氧化三铁纳米粒子具有小尺寸 效应、良好的磁导向性、生物相容性、生物降解性和活性功能基团等特点，在核磁共振成像、 靶向药物、酶的固定、免疫测定等生物医学领域表现出潜在的应用前景。
[0004] 叶酸对叶酸受体具有高度的亲和性，并且是细胞增殖时碱基合成所必须的维生 素，很多研究发现叶酸受体在多种恶性肿瘤细胞表面高水平表达。叶酸靶向纳米载体诊疗 肿瘤已经成为近年来国内外研究的热点。
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明目的在于提供一种既包含了聚丁二炔的色变功能， 又保留了叶酸的靶向作用，还包含了四氧化三铁的磁性分离富集功能的叶酸靶向磁性显色 纳米粒。
[0006] 本发明同时还提供一种叶酸靶向磁性显色纳米粒的制备方法，该制备方法工艺简 单、性质稳定且成本低。
[0007] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下： 一种叶酸祀向磁性显色纳米粒，包括四氧化三铁纳米粒、形成在所述四氧化三铁纳米 粒表面与所述四氧化三铁纳米粒通过物理作用将其进行包裹的聚丁二炔纳米粒和形成在 所述聚丁二炔纳米粒表面与所述聚丁二纳米粒通过化学键连接的叶酸分子。
[0008] 所述聚丁二炔纳米粒由含有丁二炔结构的单体在254 nm的紫外光照射下通过拓 扑聚合形成。
[0009] 所述含有丁二炔结构的单体具有羧基，包括所有能呈现蓝色-红色变化的单体， 如10，12 -二十三联炔酸（TRCDA)，但并不局限于它。
[0010] 所述四氧化三铁纳米粒具有超顺磁性功能，其粒径为l(T3〇 rim。加入的磁性四氧 化三铁粒径不宜太小，若粒径太小，磁性较弱。
[0011] 一种上述叶酸靶向磁性显色纳米粒的制备方法，该方法包括以下步骤： (1)将含有丁二炔结构的单体和四氧化三铁纳米粒溶于有机溶剂中混合，然后除去所 述有机溶剂，再加入纯水，超声分散均匀后，置于波长为254 nm的紫外光下照射:Γ20 min， 得到蓝色或深蓝色的聚丁二炔磁性纳米粒溶液； (2 )取出一定量步骤（1)中所述聚丁二炔磁性纳米粒溶液，在所述聚丁二炔磁性纳米粒 溶液中加入过量的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC)和过量的羟基琥珀 醜亚胺（NHS)，室温避光振汤1.5 3 h，然后加入叶酸，室温振汤16 18 h，反应完成后，用纯 水透析23~25 h，制得叶酸祀向磁性显色纳米粒。
[0012] 步骤（1)中，所述纯水的加入量与所述有机溶剂的加入量相等。
[0013] 步骤（1)中，所述含有丁二炔结构的单体与所述四氧化三铁纳米粒的质量比例并 不限于一种特定比例，而包括所有可能存在的比例，这种比例并不影响聚丁二炔的变色反 应，所述含有丁二炔结构的单体与所述四氧化三铁纳米粒的最佳质量比为50:1。
[0014] 所述叶酸与所述含有丁二炔结构的单体的摩尔比为1:2~1:10。
[0015] 所述1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC)和所述羟基琥珀酰亚胺 (NHS)的摩尔比为1:1。
[0016] 由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点： 本发明的叶酸靶向磁性显色纳米粒在聚丁二炔纳米粒的基础上引入了磁性四氧化三 铁纳米粒和叶酸分子，使得这种纳米粒即包含了聚丁二炔的色变功能，又保留了叶酸的靶 向作用，还包含了四氧化三铁的磁性分离富集功能。
[0017] 本发明的叶酸靶向磁性显色纳米粒中叶酸接入到聚丁二炔纳米粒上，可以特异靶 向叶酸高表达的肿瘤细胞。本发明的叶酸靶向磁性显色纳米粒可以广泛地应用于肿瘤细胞 的分离和检测。
[0018] 本发明的制备方法简单易行，便于操作推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为本发明的叶酸靶向磁性显色纳米粒的结构示意图； 图2为本发明的叶酸靶向磁性显色纳米粒在磁铁作用下分离前后对照图。
【具体实施方式】
[0020] 在聚丁二炔磁性显色纳米粒表面修饰叶酸分子，经外加紫外、磁场及叶酸三重主 动靶向作用下，可以加强靶细胞对目的纳米颗粒摄取。
[0021] 本发明的叶酸靶向磁性显色纳米粒，结构如图1所示，其通过物理作用，在聚丁二 炔纳米粒的内部表面结合一定比例的超顺磁四氧化三铁纳米粒，形成稳定的一个核/壳结 构，组装成磁性显色纳米粒，该磁性显色纳米粒通过化学键将叶酸分子连接到聚丁二炔纳 米粒表面，利用其特异性结合的特点，使其产生快速肉眼可见的明显颜色变化。这类叶酸靶 向磁性显色纳米粒具有制备简单、成本低廉，快速检测的优点，可以通过色变反应定性或定 量检测生物活性分子的存在，可广泛应用于活性药物帅选、临床检验诊断等方面。
[0022] 本发明的叶酸靶向磁性显色纳米粒在磁铁作用下，可实现快速分离，如图2所示， 其中，磁分离前，深蓝色的纳米粒分散均匀，磁分离后，深蓝色的纳米粒聚集到一起。
[0023] 下面通过实施例对本发明的【具体实施方式】进行说明。
[0024] 实施例1 将10，12 -二十三联炔酸（TRCDA)溶于氯仿中混合，使得TRCDA的浓度为1 mmol/L， 用0. 8 μ m滤膜滤去杂质，然后加入粒径为15nm磁性四氧化三铁纳米粒（四氧化三铁纳米粒 与TRCDA的重量比为50:1)，旋蒸除去氯仿，真空干燥至恒重，形成均匀分散的薄膜。取上 述干燥后的样品，加入与氯仿等量的纯水，超声分散均匀后，置于254nm紫外交联仪中照射 lOmin，得到深蓝色的聚丁二炔磁性显色纳米粒溶液。
[0025] 取出0. 4 mL的上述聚丁二炔磁性显色纳米粒溶液，加入60 μ L 8 mmol/L NHS和 60 yL 8 mmol/L EDC，室温避光振荡2 h，活化羧基端，再加入叶酸，叶酸的加入量按叶酸与 TRCDA的摩尔比为1:10加入，室温振荡17 h。反应结束后，用纯水透析24 h，每隔2 h换一 次水，即得叶酸靶向磁性显色纳米粒，接入叶酸的含量采用紫外分光光度计测定（286 nm)， 测得接入的叶酸含量为〇. 648 ug/mL。
[0026] 实施例2 本实施例中相比实施例1，只改变叶酸的加入量，叶酸的加入量按叶酸与TRCDA的摩尔 比为1:5加入，最后制得的叶酸靶向磁性显色纳米粒中的叶酸接入量为0. 743 ug/mL。
[0027] 实施例3 本实施例中相比实施例1，只改变叶酸的加入量，叶酸的加入量按叶酸与TRCDA的摩尔 比为3:10加入，最后制得的叶酸靶向磁性显色纳米粒中的叶酸接入量为0. 826 ug/mL。
[0028] 实施例4 本实施例中相比实施例1，只改变叶酸的加入量，叶酸的加入量按叶酸与TRCDA的摩尔 比为2:5加入，最后制得的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒中的叶酸接入量为0. 873 ug/mL。
[0029] 综上所述，本发明的叶酸靶向磁性显色纳米粒具有如下优点： (1)本发明制备的磁性显色纳米粒在交变磁场等条件下，其颜色会发生蓝色-红色的 变化。
[0030] (2)采用薄膜分散法制备的聚丁二炔磁性纳米粒，所制备的纳米粒粒径均匀，分布 范围窄，结构稳定。
[0031] (3)制备的聚丁二炔磁性纳米粒通过碳化二胺法接入叶酸分子，得到具有色、磁靶 向及叶酸分子祀向的纳米粒。
[0032] (4)本发明的制备方法简便易行，便于操作推广。
[0033] 以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本 发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施 例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种叶酸靶向磁性显色纳米粒，其特征在于，包括四氧化三铁纳米粒、形成在所述四 氧化三铁纳米粒表面与所述四氧化三铁纳米粒通过物理作用将其进行包裹的聚丁二炔纳 米粒和形成在所述聚丁二炔纳米粒表面与所述聚丁二纳米粒通过化学键连接的叶酸分子。
2. 根据权利要求1所述的叶酸靶向磁性显色纳米粒，其特征在于，所述聚丁二炔纳米 粒由含有丁二炔结构的单体在254 nm的紫外光照射下通过拓扑聚合形成。
3. 根据权利要求2所述的叶酸靶向磁性显色纳米粒，其特征在于，所述含有丁二炔结 构的单体具有羧基功能团。
4. 根据权利要求2所述的叶酸靶向磁性显色纳米粒，其特征在于，所述含有丁二炔结 构的单体为10，12-二十三联炔酸。
5. 根据权利要求1所述的叶酸靶向磁性显色纳米粒，其特征在于，所述四氧化三铁纳 米粒的粒径为1〇~30 nm。
6. -种如权利要求1~5中任一项权利要求所述的叶酸靶向磁性显色纳米粒的制备方 法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤： (1)将含有丁二炔结构的单体和四氧化三铁纳米粒溶于有机溶剂中混合，然后除去所 述有机溶剂，再加入纯水，超声分散均匀后，置于波长为254 nm的紫外光下照射:Γ20 min， 得到蓝色或深蓝色的聚丁二炔磁性纳米粒溶液； (2 )取出一定量步骤（1)中所述聚丁二炔磁性纳米粒溶液，在所述聚丁二炔磁性纳米粒 溶液中加入过量的1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺和过量的羟基琥珀酰亚胺， 室温避光振荡1.5~3 h，然后加入叶酸，室温振荡16~18 h，反应完成后，用纯水透析23~25 h，制得叶酸祀向磁性显色纳米粒。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，所述纯水的加入量与所 述有机溶剂的加入量相等。
8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，所述含有丁二炔结构的 单体与所述四氧化三铁纳米粒的质量比为50:1。
9. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述叶酸与所述含有丁二炔结构的 单体的摩尔比为1:2~1:10。
【文档编号】C12N5/09GK104087555SQ201410337432
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】刘 东, 郑明彬, 黄桂贤 申请人:江苏东博生物医药有限公司