一种末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法，所述方法包括：首先根据单链模板合成引物，与单链模板退火，然后在四种脱氧核苷三磷酸中的一种的存在下进行TdT酶催化的3’端加尾反应，反应完成后在足量没有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶存在下进行聚合反应生成双链DNA，最后测定聚合反应完成后反应体系中双链DNA或单链DNA的相对量，并通过该检测结果推导出Poly(A)聚合酶活性程度，其中所用单链模板上引物3’方向上第一位的碱基与加尾反应中所用的那种脱氧核苷三磷酸不互补。本发明的方法与现有方法相比，无放射性污染，操作简单快捷，试剂准备成本低，并且灵敏度高。
【专利说明】一种末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生化【技术领域】，具体来说涉及一种末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方 法。
【背景技术】
[0002] 末端脱氧核苷醜转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)是一 种特殊的DNA聚合酶。TdT可不依赖模板，催化脱氧核苷三磷酸（dNTP)，逐个聚合至单链或 双链DNA片段的3' -OH端上。该酶特异分布于哺乳类动物的胸腺、骨髓及某些类型的白血 病患者的恶性细胞中，通过测定其活性，可用于白血病的诊断及预后。（Rudzka E et al.， Folia Haematol Int Mag Klin Morphol Blutforsch. 1985;112 (6):864-71) (Hutton JJ et al.，Blood. 1982 Dec;60 (6) :1267-76.)。因此，测定体内的TdT活性具有十分重要的 临床诊断价值。
[0003] TdT也是基因工程技术以及生命科学研究中一种重要的工具酶。在细胞凋亡的过 程中，染色体的DNA被内源核酸内切酶有规律的降解成长度约为180-200bp的整倍数的片 段，产生游离的3'-OH末端。TdT可在这些末端上掺入荧光标记的dUTP，因此可在荧光显微 镜下直接观察到凋亡细胞。这种被称为TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 的方法是目前原位检测细胞凋亡最重要、最准确的方法，而TdT酶是TUNEL实验中的核心。 目前商品化的TUNEL试剂盒中通常采用的是基因工程重组表达的TdT酶，其质量、活性决定 了 TUNEL结果的好坏。如果一个反应中加入的TdT酶活性过高，会导致非特异性染色；而加 入的TdT酶活性过低则会导致染色失败。因此，准确测定重组TdT酶的活性，保证批次活性 的稳定性，对于TUNEL试剂盒的质量具有至关重要的意义。
[0004] 经典的TdT酶活力测定法采用放射性底物掺入法，即采用以32P标记的dATP为底 物，经TdT催化使其掺入到oligo (ClA)25上，其反应式如下： --· η [ a -32p] -dATP + oligo (dA) 25 oligo (dA) 25 ([ a-32p]-dAMP) η + nppi 通过测定酸不溶性产物中放射性同位素的量，计算出TdT酶的活性。这种方法灵敏度 虽高，但受标记物质量所限，且操作过程繁琐，易产生放射性污染。
[0005] 张华等（生物化学与生物物理进展，1990, 17:387-389)将放射性底物 [a -32p] -dATP替换为荧光标记底物ε dATP，经TdT催化使其掺入到oligo (dA) 25上，其反 应式如下： .......................................................................................§?_ η ε dATP + oligo (dA)25 oligo (dA)25( ε dAMP) η + nppi 通过测定酸不溶性产物的荧光强度，计算出TdT酶的活性。这种方法无需放射性同位 素操作，但其荧光标记底物ε dATP无商品化试剂，需要实验者自行合成，合成难度大、周期 长，质量难以控制；此外反应产物需要经过蛇毒磷酸二酯酶水解，才能测定荧光强度，操作 步骤的繁琐程度更甚于放射性同位素法。
[0006] 目前，以上述两种方法为代表性的TdT测活方法本质上还是通过测定掺入的标记 dATP的量来计算酶活，这些方法可以统称为"掺入法"。"掺入法"的关键在于掺入产物和标 记dATP (放射性同位素或荧光标记）的分离。三氯乙酸TCA可使oligo (dA)25沉淀，而标 记的dATP不被沉淀；将TCA处理的产物加在Whatman滤纸上，就可以实现掺入产物和标记 dATP的分离。再经过洗涤、干燥、洗脱，最后测定放射性同位素或者荧光强度。因此，所有基 于"掺入法"的测活方法，都存在步骤多、周期长的缺陷，难以实现高通量、自动化。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的TdT酶测活方法。本发明采用了 一种全新的"转化法"替代传统的"掺入法"，其原理如图1所示。
[0008] 具体来说，本发明的技术方案如下： 一种末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根据单链 模板合成引物，与单链模板退火，然后在四种脱氧核苷三磷酸中的一种的存在下进行TdT 酶催化的3'端加尾反应，反应完成后在足量没有3' -5'外切酶活性的DNA聚合酶存在下进 打聚合反应生成双链DNA，最后测定聚合反应完成后反应体系中双链DNA或单链DNA的相对 量，并通过该检测结果推导出TdT酶活性程度，其中所用单链模板上引物3'方向上第一位 的碱基与加尾反应中所用的那种脱氧核苷三磷酸不互补。
[0009] 优选地，反应体系中双链DNA或单链DNA的相对量是利用仅与双链DNA或仅与单 链DNA结合的荧光染料，利用荧光法检测得到的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧 光强度表示的。在一个实施方案中，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。更优 选，所用荧光染料是成熟的市售双链DNA特异性荧光染料，例如picogreen染料。
[0010] 优选地，所采用的单链模板是单链环状DNA模板。更优选，所采用的单链模板是 M13噬菌体单链DNA，以便于建立标准化的检测体系。在一个相应的实施方案中，所用的引 物是 _aagccatccgcaaaaatgacctct_3,〇 [0011] 在一个实施方案中，所采用的DNA聚合酶是Taq酶。
[0012] 本发明的优点： 1. 无放射性污染； 2. 所有试剂均可购买，无需自己制备，成本低； 3. 操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤；可实现高通量、自动化的 活性测定。
[0013] 4.灵敏度高，可检测到0· I U的TdT活性。
[0014] 5.可用于不同种属来源的TdT酶活的测定。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是本发明测定方法的原理图。
[0016] 图2是根据采用本发明方法测得的结果绘制的荧光活性曲线图。
[0017] 图3是不同来源的TdT酶的荧光活性曲线图。
[0018] 图4是基因工程重组小牛胸腺TdT酶活性测定的荧光活性曲线图。
【具体实施方式】
[0019] 本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的TdT酶测活方法。本发明摈弃了 传统的"掺入法"，采用了一种全新的"转化法"，其原理如图1所示。
[0020] 如图所示，无3'_5'外切酶活性的DNA聚合酶可以末端匹配的模板/引物为底物， 进行聚合反应，生成M13双链DNA。M13双链DNA可被双链特异性的picogreen染料结合， 产生荧光。TdT酶可在引物的末端加上数量不等的dATP，从而使得引物末端与M13单链DNA 不匹配。这种末端不匹配的模板/引物不能作为无3' -5'外切酶活性的DNA聚合酶的底 物；picogreen染料不能结合单链DNA，从而不能产生突光。
[0021] TdT酶的活性在一定范围内同末端不匹配模板/引物的量成正比；而在DNA聚合 酶活性一定的情况下，末端不匹配模板/引物的量同荧光强度成反比。因此，本发明将TdT 的测活体系同DNA聚合酶测活体系偶联起来。
[0022] 在本发明测定方法的一个实例中，测定程序包括以下方面： I. M13单链DNA模板/引物的制备： M13 单链 DNA: M13mpl8 单链 DNA (NEB); 引物：M13 引物 5，-aagccatccgcaaaaatgacctct-3，； M13模板引物/复合物：将M13mpl8单链DNA同M13引物按摩尔比1:1混合，在退火缓 冲液（10 mM Tris-HCl pH8. 0，50 mM NaCl)中，70°C加热5分钟后，缓慢降至室温，使模板 引物退火。
[0023] 2. TdT 反应：
【权利要求】
1. 一种末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根据 单链模板合成引物，与单链模板退火，然后在四种脱氧核苷三磷酸中的一种的存在下进行 TdT酶催化的3'端加尾反应，反应完成后在足量没有3' -5'外切酶活性的DNA聚合酶存在 下进行聚合反应生成双链DNA，最后测定聚合反应完成后反应体系中双链DNA或单链DNA的 相对量，并通过该检测结果推导出Poly (A)聚合酶活性程度，其中所用单链模板上引物3' 方向上第一位的碱基与加尾反应中所用的那种脱氧核苷三磷酸不互补。
2. 如权利要求1所述的末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法，其特征在于，反应体系 中双链DNA或单链DNA的相对量是利用仅与双链DNA或仅与单链DNA结合的荧光染料，利 用荧光法检测得到的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。
3. 如权利要求2所述的末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法，其特征在于，所采用的 荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。
4. 如权利要求3所述的末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法，其特征在于，所述荧光 染料是pi cogreen染料。
5. 如权利要求1所述的末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法，其特征在于，所采用的 单链模板是单链环状DNA模板。
6. 如权利要求5所述的末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法，其特征在于，所采用的 单链模板是Ml3噬菌体单链DNA。
7. 如权利要求6所述的末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法，其特征在于，所用的引 物是 _aagccatccgcaaaaatgacctct_3,〇
8. 如权利要求1所述的末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法，其特征在于，所采用的 DNA聚合酶是Taq酶。
【文档编号】C12Q1/48GK104293883SQ201410502145
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】徐晓昱, 王静 申请人:南京诺唯赞生物科技有限公司