一种提高桑黄液体发酵产物中麦角甾醇含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高桑黄液体发酵产物中麦角甾醇含量的方法，包括步骤：(1)种子液制备：将活化后的桑黄菌种接种于添加青钱柳提取物的液体种子培养基中培养3天-7天，得种子液；(2)桑黄液体发酵培养：将步骤(1)中的种子液按占液体发酵培养基体积5％-20％的量接种于液体发酵培养基中，培养1天-4天后，加入泛素蛋白，然后继续培养2天-4天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。本发明根据药用真菌桑黄液体发酵产物麦角甾醇合成代谢途径的特点，通过添加青钱柳提取物并在特定的发酵阶段添加泛素蛋白，大幅度提高了桑黄麦角甾醇含量。
【专利说明】一种提高桑黄液体发酵产物中麦角留醇含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物发酵工程【技术领域】，具体涉及一种提高桑黄液体发酵产物中麦角 甾醇含量的方法。
【背景技术】
[0002] 桑黄（Phellinus igniarius)属担子菌亚门，层孔菌纲，锈革孔菌科，针层孔菌属。 桑黄菌提取物在抑制癌细胞转移和防止癌症手术后复发等的临床应用中具有显著效果，是 目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种药用真菌。
[0003] 由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，造成桑黄在自然界中形 成子实体稀少，特别是形成可用子实体需要多年。而且人工栽培极其困难，培养条件苛刻， 且生长周期长达3-4年，难以满足日益膨胀的市场需要。采用桑黄液体发酵的方法生产桑 黄药用活性成分因为具有生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一 种有效的方法。目前，国内外对桑黄菌丝体培养生产活性药用成分研究和工艺应用主要集 中在发酵条件及产物提取分离等层面上，整体发酵水平不高。
[0004] 麦角留醇又称麦角固醇，是脂溶性维生素 D2的前体，当受到紫外线照射时可转化 为维生素 D2。麦角留醇是真菌细胞膜的重要组分，它在确保膜结构的完整性、与膜结合酶的 活性、膜的流动性、细胞活力及物质运输等方面起着重要作用。麦角留醇是一种重要的医药 化工原料，可用于可的松、黄体酮等药物的生产，在食品、医药和饲料工业中应用广泛（曹 龙辉，李晓捃，赵文红等.麦角甾醇的研究进展[J].中国酿造，2014, 33(4) :9-11.)。
[0005] 泛素（Ubiquitin，Ub)，即泛素蛋白，是一种多肽，由76个氨基酸构成，其分子量约 8. 5kDa，1975年首次从小牛的胰脏中分离出来，随后在许多不同有机体和组织中被发现，泛 素的氨基酸序列具有高度保守性。近年来，随着对泛素研究的不断深入，发现泛素不仅仅是 蛋白质降解的标记，还是细胞维持对那些受组成型调节和环境刺激产生的蛋白质水平的基 本调节方式，细胞内蛋白质泛素化参与细胞的多种生理过程，在蛋白质降解的标记、DNA修 复、基因转录调控及信号转导等各个生命活动中发挥着重要的作用，与人类的各种疾病、植 物的生理生化过程存在着紧密联系（黄新敏，张艳霞，万小荣.泛素蛋白的研究进展[J]. 广东农业科学，2010,6:191-194.)。
[0006] 将泛素蛋白用于桑黄的液体发酵生产，提高其麦角留醇的含量，国内外尚未见报 道。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用泛素蛋白提高桑黄液体发酵产物中 麦角留醇含量的方法。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] -种提高桑黄液体发酵产物中麦角留醇含量的方法，包括步骤：
[0010] ⑴种子液制备：将活化后的桑黄菌种接种于添加青钱柳提取物的液体种子培养 基中培养3天-7天，得种子液；
[0011] ⑵桑黄液体发酵培养：将步骤（1)中的种子液按占液体发酵培养基体积 5 % -20 %的量接种于液体发酵培养基中，培养1天-4天后，加入泛素蛋白，然后继续培养2 天-4天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。
[0012] 本发明根据药用真菌桑黄液体发酵产物麦角留醇合成代谢途径的特点,通过添加 青钱柳提取物并在特定的发酵阶段添加泛素蛋白，大幅度提高了桑黄液体发酵产物中麦角 甾醇的含量。
[0013] 所述的桑黄菌种可采用任意一种桑黄菌种，可采用市售产品。例如桑黄 (Phellinus linteus)ACCC51181菌种，来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
[0014] 为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
[0015] 步骤（1)中，每升液体种子培养基中青钱柳提取物的添加量为lg-10g。
[0016] 所述的青钱柳提取物可以选用市售产品，例如西安赛奥生物技术有限公司生产的 青钱柳提取物等，也可以采用现有方法制备；优选以青钱柳叶为原料制备的青钱柳提取物； 进一步优选由青钱柳叶乙醇提取物和青钱柳叶水提取物组成的青钱柳提取物，可采用以下 制备方法制备的青钱柳提取物，包括：
[0017] 称取一定量的青钱柳叶，粉碎（优选过40目-100目），先加占青钱柳叶重量10倍 量-16倍量的质量百分浓度为60% -80%的乙醇水溶液在60°C _80°C浸提lh-2h，过滤后得 到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物I ;上述醇提后的青钱柳叶残渣加入占青 钱柳叶重量10倍量-20倍量的水在85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，过滤后得到上清液，上清液 浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积2倍量-5倍量的无水乙醇，离心收集沉淀物，沉淀物真 空冷冻干燥后得提取物II，合并上述提取物I和提取物II得青钱柳提取物。
[0018] 步骤（1)中，所述的活化后的桑黄菌种在添加青钱柳提取物的液体种子培养基中 培养的温度为自然环境温度，优选为20°C -30°C。一般IL添加青钱柳提取物的液体种子培 养基中接入2cm2-5cm2大小的活化后的桑黄菌种菌块。
[0019] 步骤（1)中，桑黄菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，包括：将斜面保 藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22°C -30°C，培养时间4 天-10天，得到活化后的桑黄菌种。
[0020] 所述的PDA平板培养基和液体种子培养基均采用本领域种子培养常用的培养基， 可采用市售产品。优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g， 用水定容至l〇〇〇mL。优选，所述的液体种子培养基：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、 KH2PO4Ig 和 MgSO4O. 5g，用水定容至 1000mL。
[0021] 步骤（2)中，所述的液体发酵培养基的组成为：以IL液体发酵培养基计，葡萄糖 20g、蛋白胨4g、麦麸5g、谷氨酸0. 5g-5g、KH2PO4L 5g、MgSO4O. 75g和余量的水。
[0022] 优选，每毫升液体发酵培养基中添加泛素蛋白0. 2mg_3. Omg ;进一步优选每毫升 液体发酵培养基中添加泛素蛋白〇. 8mg-2. 4mg ;最优选的，每毫升液体发酵培养基中添加 泛素蛋白I. 6mg。
[0023] 所述的泛素蛋白采用从大多数食药真菌或植物等原料中提取的泛素蛋白，可以 选用市售产品，也可以采用现有方法制备，如从灵芝原料中提取的泛素蛋白，可采用以下 制备方法制备，包括：向灵芝超微粉中加入占灵芝超微粉质量10倍量-30倍量的蒸馏 水，再加入占灵芝超微粉质量0.5 % -3 %的纤维素酶和占灵芝超微粉质量0.3 % -2% 的果胶酶，在35 °C -55 °C搅拌lh-2h，然后在70MPa-100MPa下匀浆；3 °C -5 °C条件下 10000rpm-30000rpm(rpm表示转/分钟）离心10min-15min，收集上清液得到粗蛋白液；将 粗蛋白液通过微滤膜（如〇. 22 μ m的微滤膜）收集滤过液，以除去其中的微粒和细菌；将 所述滤过液在3°C _5°C下用截留分子量为5000Da-10000Da的超滤膜进行浓缩，得到泛素蛋 白。
[0024] 所述的灵芝超微粉为灵芝经超微粉碎得到，其制备包括：将灵芝子实体清洗、烘干 后进行超微粉碎（如在超微粉碎机中进行超微粉碎），得到灵芝超微粉。所述的超微粉碎优 选温度为l〇°C -40°C，处理时间3min-20min。
[0025] 所述的果胶酶的酶活力优选为3. 0万U/g-5. 0万U/g、纤维素酶的酶活力优选为 2. 0 万 U/g-3. 0 万 U/g。
[0026] 所述的桑黄液体发酵培养的温度为自然环境温度，一般为20°C -30°C，优选为 25°C -30°C。
[0027] 本发明，所述的桑黄液体发酵产物经过后续的分离处理可以从桑黄菌丝体中提 取、测定麦角留醇含量。所述的分离处理为本领域常规的分离方法，例如过滤或离心；可 包括：将所述的桑黄发酵产物用纱布过滤，从过滤所得菌丝体中提取、测定麦角留醇含量。 具体的提取步骤包括：将菌丝体用水冲洗干净，在55°C -65°C干燥至恒重，按料液质量比 1:10-30加入CHCl3，超声波（优选功率250W-300W，频率40kHz-50kHz)浸提lh-1. 5h，离心 取上清液，残渣用CHCl3洗涤后离心取上清液，合并上清液得到含麦角留醇的提取液。
[0028] 本发明所用的培养基均需灭菌、冷却后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件， 例如可在 120°C _125°C下灭菌 20min-30min。
[0029] 青钱柳（Cyclocarya paliurus)又名青钱李、摇钱树等，系胡桃科青钱柳属植物， 是中国特有的单种属植物。青钱柳是一种高大速生乔木，奇数羽状复叶，广泛分布于江西、 浙江、江苏、安徽、福建、台湾、湖北、四川、贵州等地的海拔420m-2500m的山区、溪谷或石灰 岩山地。其树皮、树叶具有清热解毒，止痛功能。
[0030] 灵芝（Ganoderma Lucidum(Leyss. ex Fr. )Karst.)外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形 或近圆形，为多孔蓖科真菌灵芝的子实体。具有补气安神，止咳平喘的功效，用于眩晕不眠， 心悸气短，虚劳咳喘。
[0031] 本发明同现有技术相比有如下优点：
[0032] 1.本发明将泛素蛋白用于桑黄麦角留醇类成分的液体发酵生产，且优化了发酵方 法，大幅度提高了桑黄液体发酵产物中麦角甾醇的含量，可达到2. 15mg/g，提取的麦角甾醇 可用于食品、医药和饲料工业中。
[0033] 2.本发明所采用的桑黄菌丝体液体发酵方法简单，重复性好，发酵周期短，效率 高，同时利用天然产物作为生产原料，环保无毒，成本低。整个发酵过程可控，不受外部环境 条件限制，非常适合工业化生产和应用推广。本发明方法同样适用于发酵罐规模化生产，具 有很好的工业化应用前景。
[0034] 3.本发明采用的泛素蛋白可从大多数食药真菌及植物等原料中提取，来源广泛， 成本较低，制备方法也相对简单，可规模提取生产，对桑黄麦角留醇活性物质的发酵生产具 有很好的促进效果。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合部分具体实施例对本
【发明内容】
进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅 限于下面的实施例。
[0036] 桑黄（Phellinus linteus)ACCC51181菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中 心。
[0037] 实施例1
[0038] 一、材料准备
[0039] 果胶酶（酶活力为5. 0万U/g)，纤维素酶（酶活力为3. 0万U/g)，由广西庞博生 物工程有限公司提供。
[0040] PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下灭菌 20min。
[0041] 将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度25°C， 培养时间7天，得到活化后的桑黄菌种菌块。
[0042] 青钱柳提取物的制备方法，包括：称取一定量的青钱柳叶，粉碎过100目，先加占 青钱柳叶重量13倍量的质量百分浓度为70%的乙醇水溶液在60°C浸提I. 0h，过滤后得到 上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物I ;上述醇提后的青钱柳叶残渣加入占青钱 柳叶重量10倍量的蒸馏水在85°C下浸提lh，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后 加入浓缩物体积2倍量的无水乙醇，5000rpm离心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥 后得提取物II，合并上述提取物I和提取物II得青钱柳提取物。
[0043] 以灵芝为原料制备的泛素蛋白，制备方法包括：将灵芝子实体清洗、烘干后放入超 微粉碎机中进行超微低温粉碎，温度25°C，处理时间lOmin，得到灵芝超微粉。向灵芝超微 粉中加入占灵芝超微粉质量20倍量的蒸馏水，再加入占灵芝超微粉质量1 %的纤维素酶和 占灵芝超微粉质量〇. 5%的果胶酶，在40°C搅拌lh，然后放入匀浆机中在80MPa下匀浆3 次；4°C条件下IOOOOrpm离心15min，收集上清液得到粗蛋白液；将粗蛋白液通过0. 22 μ m 微滤膜收集滤过液，以除去其中的微粒和细菌；将所述滤过液在4°C下用截留分子量为 SOOODa的超滤膜进行浓缩，得到浓缩液，即为泛素蛋白。
[0044] 二、桑黄液体发酵产物的制备
[0045] (1)种子液制备：取2cm2大小活化后的桑黄菌种菌块接种于IL添加青钱柳提取物 的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中青钱柳提取物的添加量为8g，IL液体种子培 养基组成为：葡萄糖l〇g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH 2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L和余量的 水，pH自然；25°C培养4天，得到种子液。
[0046] (2)桑黄液体发酵培养：将种子液按占液体发酵培养基体积10%的量接种于液体 发酵培养基中，在28°C培养2天后，加入泛素蛋白，每毫升液体发酵培养基中添加泛素蛋白 I. 6mg，然后继续培养3天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。其中，液体发酵培养基的 组成为：葡萄糖 20g/L、蛋白胨 4g/L、麦麸 5g/L、谷氨酸 2. 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/ L和余量的水。
[0047] 三、测定
[0048] 1.菌丝生物量的测定：桑黄液体发酵产物经8层纱布过滤，过滤所得菌丝体用蒸 馏水冲洗3次，然后置60°C烘箱中烘干至恒重，即为样品，称重。
[0049] 2.麦角甾醇提取：精密称取Ig菌丝体样品，置于25mL容量瓶，加入20mL CHCl3 液，超声波浸提Ih (功率250W，频率40kHz)，然后4000r/min离心5min，取上清液，残渣用 5mLCHCl3洗涤后4000r/min离心5min，取上清液。合并两次上清液得到含麦角甾醇的提取 液。
[0050] 3.麦角甾醇含量测定：将含麦角甾醇的提取液用CHCl3定容至25mL得萃取液，取 2mL萃取液，氮气吹干后用5mL甲醇溶解，经0. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液供HPLC分析用。
[0051] 高效液相色谱条件：色谱柱：安捷伦C18色谱柱（200mm X 4. 6mm，5 μ m);流动相：甲 醇（色谱级），流速I. 2mL/min ;UV检测波长：检测波长282nm，柱温30°C，进样量10 μ L。
[0052] 检测结果见表1。
[0053] 实施例2
[0054] 一、材料准备
[0055] 果胶酶（酶活力为3. 0万U/g)，纤维素酶（酶活力为2. 0万U/g)，由广西庞博生 物工程有限公司提供。
[0056] PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下灭菌 20min。
[0057] 将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度28°C， 培养时间9天，得到活化后的桑黄菌种菌块。
[0058] 青钱柳提取物的制备方法，包括：称取一定量的青钱柳叶，粉碎过60目，先加占青 钱柳叶重量16倍量的质量百分浓度为80%的乙醇水溶液在80°C浸提2h，过滤后得到上清 液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物I ;上述醇提后的青钱柳叶残渣加入占青钱柳叶 重量20倍量的蒸馏水在95°C下浸提2. 5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加 入浓缩物体积5倍量的无水乙醇，5000rpm离心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后 得提取物II，合并上述提取物I和提取物II得青钱柳提取物。
[0059] 以灵芝为原料制备的泛素蛋白，制备方法包括：将灵芝子实体清洗、烘干后放入超 微粉碎机中进行超微低温粉碎，温度40°C，处理时间3min，得到灵芝超微粉。向灵芝超微粉 中加入占灵芝超微粉质量30倍量的蒸馏水，再加入占灵芝超微粉质量3%的纤维素酶和占 灵芝超微粉质量〇. 3%的果胶酶，在55°C搅拌I. 5h，然后放入匀浆机中在IOOMPa下匀浆3 次；5°C条件下30000rpm离心IOmin,收集上清液得到粗蛋白液；将粗蛋白液通过0. 22 μ m 微滤膜收集滤过液，以除去其中的微粒和细菌；将所述滤过液在5°C下用截留分子量为 IOOOODa的超滤膜进行浓缩，得到浓缩液，即为泛素蛋白。
[0060] 二、桑黄液体发酵产物的制备
[0061] (1)种子液制备：取5cm2大小活化后的桑黄菌种菌块接种于IL添加青钱柳提取物 的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中青钱柳提取物的添加量为l〇g，IL液体种子 培养基组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH 2P04lg/L、MgS040. 5g/L和余量的 水，pH自然；28°C培养5天，得到种子液。
[0062] (2)桑黄液体发酵培养：将种子液按占液体发酵培养基体积15%的量接种于液体 发酵培养基中，在28°C培养3天后，加入泛素蛋白，每毫升液体发酵培养基中添加泛素蛋白 〇. 8mg，然后继续培养4天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。其中，液体发酵培养基的 组成为：葡萄糖 20g/L、蛋白胨 4g/L、麦麸 5g/L、谷氨酸 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和余量的水。
[0063] 三、测定
[0064] 1.菌丝生物量的测定：桑黄液体发酵产物经8层纱布过滤，过滤所得菌丝体用蒸 馏水冲洗3次，然后置65°C烘箱中烘干至恒重，即为样品，称重。
[0065] 2.麦角留醇提取：精密称取Ig样品，置于25mL容量瓶，加入6.8mLCHCljf，超 声波浸提I. 5h(功率300W，频率50kHz)，然后4000r/min离心5min，取上清液，残渣用 5mLCHCl3洗涤后4000r/min离心5min，取上清液。合并两次上清液得到含麦角甾醇的提取 液。
[0066] 3.麦角甾醇含量测定：将含麦角甾醇的提取液用CHCl3定容至25mL得到萃取液， 取2mL萃取液，氮气吹干后用5mL甲醇溶解，经0. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液供HPLC分析用。
[0067] 高效液相色谱条件，同实施例1。
[0068] 检测结果见表1。
[0069] 实施例3
[0070] 一、材料准备
[0071] 果胶酶（酶活力为4. 0万U/g)，纤维素酶（酶活力为2. 0万U/g)，由广西庞博生 物工程有限公司提供。
[0072] PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下灭菌 20min。
[0073] 将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度30°C， 培养时间4天，得到活化后的桑黄菌种菌块。
[0074] 青钱柳提取物的制备方法，包括：称取一定量的青钱柳叶，粉碎过40目，先加占青 钱柳叶重量10倍量的质量百分浓度为60%的乙醇水溶液在70°C浸提I. 5h，过滤后得到上 清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物I ;上述醇提后的青钱柳叶残渣加入占青钱柳 叶重量15倍量的蒸馏水在90°C下浸提I. 5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后 加入浓缩物体积4倍量的无水乙醇，5000rpm离心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥 后得提取物II，合并上述提取物I和提取物II得青钱柳提取物。
[0075] 以灵芝为原料制备的泛素蛋白，制备方法包括：将灵芝子实体清洗、烘干后放入超 微粉碎机中进行超微低温粉碎，温度KTC，处理时间20min，得到灵芝超微粉。向灵芝超微 粉中加入占灵芝超微粉质量10倍量的蒸馏水，再加入占灵芝超微粉质量〇. 5%的纤维素酶 和占灵芝超微粉质量2%的果胶酶，在35°C搅拌2h，然后放入匀浆机中在70MPa下匀浆3 次；3°C条件下20000rpm离心IOmin,收集上清液得到粗蛋白液；将粗蛋白液通过0. 22 μ m 微滤膜收集滤过液，以除去其中的微粒和细菌；将所述滤过液在:TC下用截留分子量为 5000Da的超滤膜进行浓缩，得到浓缩液，即为泛素蛋白。
[0076] 二、桑黄液体发酵产物的制备
[0077] (1)种子液制备：取3cm2大小活化后的桑黄菌种菌块接种于IL添加青钱柳提取物 的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中青钱柳提取物的添加量为5g，IL液体种子培 养基组成为：葡萄糖20g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P04lg/L、MgSO 4O. 5g/L和余量的 水，pH自然；22°C培养6天，得到种子液。
[0078] (2)桑黄液体发酵培养：将种子液按占液体发酵培养基体积20%的量接种于液体 发酵培养基中，在30°C培养4天后，加入泛素蛋白，每毫升液体发酵培养基中添加泛素蛋白 2. 4mg，然后继续培养2天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。其中，液体发酵培养基的 组成为：葡萄糖 20g/L、蛋白胨 4g/L、麦麸 5g/L、谷氨酸 4g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和余量的水。
[0079] 三、测定同实施例1。检测结果见表1。
[0080] 实施例4
[0081] 一、材料准备
[0082] 果胶酶（酶活力为5. 0万U/g)，纤维素酶（酶活力为3. 0万U/g)，由广西庞博生 物工程有限公司提供。
[0083] PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下灭菌 20min。
[0084] 将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22°C， 培养时间10天，得到活化后的桑黄菌种菌块。
[0085] 青钱柳提取物和泛素蛋白同实施例1。
[0086] 二、桑黄液体发酵产物的制备
[0087] (1)种子液制备：取3cm2大小活化后的桑黄菌种菌块接种于IL添加青钱柳提取物 的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中青钱柳提取物的添加量为lg，IL液体种子培 养基组成为：葡萄糖8g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH 2P04lg/L、MgS040. 5g/L和余量的水， pH自然；30°C培养3天，得到种子液。
[0088] (2)桑黄液体发酵培养：将种子液按占液体发酵培养基体积8%的量接种于液体 发酵培养基中，在22°C培养1天后，加入泛素蛋白，每毫升液体发酵培养基中添加泛素蛋白 0. 2mg，然后继续培养2天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。其中，液体发酵培养基的 组成为：葡萄糖 20g/L、蛋白胨 4g/L、麦麸 5g/L、谷氨酸 I. 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/ L和余量的水。
[0089] 三、测定同实施例1。检测结果见表1。
[0090] 实施例5
[0091] 一、材料准备
[0092] 果胶酶（酶活力为5. 0万U/g)，纤维素酶（酶活力为3. 0万U/g)，由广西庞博生 物工程有限公司提供。
[0093] PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下灭菌 20min。
[0094] 将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22°C， 培养时间10天，得到活化后的桑黄菌种菌块。
[0095] 青钱柳提取物，购于西安赛奥生物技术有限公司。
[0096] 泛素蛋白，同实施例1。
[0097] 二、桑黄液体发酵产物的制备
[0098] (1)种子液制备：取3cm2大小活化后的桑黄菌种菌块接种于IL添加青钱柳提取物 的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中青钱柳提取物的添加量为6g，IL液体种子培 养基组成为：葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P04lg/L、MgS0 40. 5g/L和余量的水， pH自然；20°C培养7天，得到种子液。
[0099] (2)桑黄液体发酵培养：将种子液按占液体发酵培养基体积5%的量接种于液体 发酵培养基中，在20°C培养1天后，加入泛素蛋白，每毫升液体发酵培养基中添加泛素蛋白 3mg，然后继续培养2天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。其中，液体发酵培养基的组 成为：葡萄糖 20g/L、蛋白胨 4g/L、麦麸 5g/L、谷氨酸 0· 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和余量的水。
[0100] 三、测定同实施例1。检测结果见表1。
[0101] 对比例1
[0102] (1)摇瓶种子培养
[0103] IL液体种子培养基：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P04lg/L、 MgS04(X5g/L和余量的水。pH自然，在121°C下灭菌20min。
[0104] 培养方法：取2cm2大小实施例1中活化后的桑黄菌种菌块接入灭菌冷却后IL液 体种子培养基中，25°C，120r/min下摇床培养4天，得到培养好的种子液。
[0105] (2)摇瓶发酵培养
[0106] 液体发酵培养基同实施例1。pH自然，在121°C下灭菌20min。
[0107] 培养方法：将培养好的种子液按占液体发酵培养基体积10%的接种量接入液体 发酵培养基中，在25°C，120r/min摇床中培养12天。每个试验设3个平行。
[0108] 检测结果见表1。
[0109] 对比例2仅添加青钱柳提取物，不添加泛素蛋白
[0110] 除了"二、桑黄液体发酵产物的制备（1)种子液制备：取3cm2大小活化后的桑黄菌 种菌块接种于IL添加青钱柳提取物的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中青钱柳 提取物的添加量为6g，IL液体种子培养基组成为：葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L和余量的水，pH自然；20°C培养7天，得到种子液。⑵桑黄液体 发酵培养：将种子液按占液体发酵培养基体积5 %的量接种于液体发酵培养基中，在20°C 培养1天后,继续培养2天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。其中，液体发酵培养基的 组成为：葡萄糖 20g/L、蛋白胨 4g/L、麦麸 5g/L、谷氨酸 0. 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/ L和余量的水。"之外，其余操作同实施例5。检测结果见表1。
[0111] 对比例3仅添加泛素蛋白，不添加青钱柳提取物
[0112] 除了"二、桑黄液体发酵产物的制备（1)种子液制备：取3cm2大小活化后的桑黄菌 种菌块接种于液体种子培养基，IL液体种子培养基组成为葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白 胨3g/L、KH 2P04lg/L、MgS040. 5g/L和余量的水，pH自然；20°C培养7天，得到种子液。⑵桑 黄液体发酵培养：将种子液按占液体发酵培养基体积5 %的量接种于液体发酵培养基中， 在20°C培养1天后，加入泛素蛋白，每毫升液体发酵培养基中添加泛素蛋白3mg，然后继续 培养2天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。其中，液体发酵培养基的组成为：葡萄糖 20g/L、蛋白胨 4g/L、麦麸 5g/L、谷氨酸 0. 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和余量的水。" 之外，其余操作同实施例5。检测结果见表1。
[0113] 表1桑黄液体发酵代谢产物含量检测结果
[0114]
【权利要求】
1. 一种提高桑黄液体发酵产物中麦角留醇含量的方法，其特征在于，包括步骤： (1) 种子液制备：将活化后的桑黄菌种接种于添加青钱柳提取物的液体种子培养基中 培养3天-7天，得种子液； (2) 桑黄液体发酵培养：将步骤（1)中的种子液按占液体发酵培养基体积5% -20 %的 量接种于液体发酵培养基中，培养1天-4天后，加入泛素蛋白，然后继续培养2天-4天，终 止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，每升液体种子培养基中青钱 柳提取物的添加量为lg-l〇g。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的青钱柳提取物为以青钱柳叶为原 料制备的青钱柳提取物。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的青钱柳提取物由青钱柳叶醇提取 物和青钱柳叶水提取物组成。
5. 根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的青钱柳提取物的制备方法，包 括：称取一定量的青钱柳叶，粉碎，先加占青钱柳叶重量10倍量-16倍量的质量百分浓度为 60% -80%的乙醇水溶液在60°C -80°C浸提lh-2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空 冷冻干燥得提取物I ;上述醇提后的青钱柳叶残渣加入占青钱柳叶重量10倍量-20倍量的 水在85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物 体积2倍量-5倍量的无水乙醇，离心收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物II，合并 上述提取物I和提取物II得青钱柳提取物。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，所述的桑黄液体发酵培养的 温度为 20°C -30°C。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液体发酵培养基的组成为：以 1L液体发酵培养基计，葡萄糖20g、蛋白胨4g、麦麸5g、谷氨酸0. 5g-5g、KH2P041. 5g、 MgS040. 75g和余量的水。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每毫升液体发酵培养基中添加泛素蛋白 0. 2mg-3. 0mg〇
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的泛素蛋白的制备方法，包括： 向灵芝超微粉中加入占灵芝超微粉质量10倍量-30倍量的水，再加入占灵芝超微粉 质量0.5 % -3 %的纤维素酶和占灵芝超微粉质量0.3 % -2 %的果胶酶，在35 °C -55 °C 搅拌 lh-2h，然后在 70MPa-100MPa 下匀浆；3 °C -5 °C 条件下 10000rpm-30000rpm 离心 10min-15min，收集上清液得到粗蛋白液；将粗蛋白液通过微滤膜收集滤过液，以除去其中 的微粒和细菌；将所述滤过液在3°C _5°C下用截留分子量为5000Da-10000Da的超滤膜进行 浓缩，得到泛素蛋白。
【文档编号】C12R1/645GK104278070SQ201410565891
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】程俊文, 贺亮, 胡传久, 魏海龙, 付立忠, 李海波 申请人:浙江省林业科学研究院