用于饲喂黄粉虫的益生联菌固态发酵剂及其制备方法

用于饲喂黄粉虫的益生联菌固态发酵剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了用于饲喂黄粉虫的益生联菌固态发酵剂及其制备方法，本发明提供了一种用于饲喂黄粉虫的菌剂，其活性成分为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricu)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)。本发明采用四联益生菌饲喂黄粉虫，通过分析死亡率、体长、头宽和百虫重等指标，判断益生菌剂对黄粉虫生长的促进作用，发现四联益生菌可以提高存活率，促进黄粉虫生长。
【专利说明】用于饲喂黄粉虫的益生联菌固态发酵剂及其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及用于饲喂黄粉虫的益生联菌固态发酵剂及其 制备方法。

【背景技术】
[0002] 近年来抗生素滥用引起了社会广发关注，研发抗生素替代品刻不容缓（ChenY andSchwackW, 2014)。益生菌被认为是抗生素理想的替代品。所谓益生菌，是定植于人 体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性 有益微生物的总称（SylviaHetal.，2013.)。双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)是定 植于人和动物肠道内的一类重要生理细菌，对人和动物机体发挥着生物屏障、营养、免疫、 抗肿瘤、改善代谢等多种生理作用；丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum)可抑制肠道有害 菌，促进有益菌生长，减少肠内氨、胺含量，产生如维生素K等多种维生素；地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis)和枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)，能产生几丁质酶、葡聚 糖酶、抗菌肽等蛋白以及一些次级代谢产物。益生菌发酵物的优劣与发酵所使用的微生物 菌种及发酵工艺息息相关。相对于纯培养，联菌培养更有利于提高活菌数及达到益生效果。
[0003] 黄粉虫（Tenebriomolitor)又叫面包虫，在昆虫分类学上隶属于鞘翅目，拟步行 虫科，粉甲虫属（拟步行虫属），属于农业仓储害虫。随着仓储条件的改善，自然发生的黄粉 虫害已经消失。由于黄粉虫蛋白质含量高,并且富含多种生物活性物质，近年来多家企业启 动开发黄粉虫在饲料、食品和医药保健品等方面的用途。黄粉虫高密度饲养过程中，易发生 软腐病，该病为消化道感染细菌所致，表现为虫体发黑，传染性强，死亡率高，无有效治疗方 法。在饲料中添加抗生素可以降低发病率。但长期添加抗生素，不仅使耐药菌株越来越多， 而且影响黄粉虫体内正常菌群，导致免疫功能下降；此外，抗生素残留也降低黄粉虫产品质 量。益生菌发酵物可以作为饲料添加剂替代抗生素，是解决上述问题的理想方案。


【发明内容】

[0004] 本发明的一个目的是提供一种用于饲喂黄粉虫的菌剂。
[0005] 本发明提供的菌剂，其活性成分为两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)、丁酸 梭菌（Clostridiumbutyricu)、地衣芽抱杆菌（Bacilluslicheniformis)和枯草芽抱杆菌 枯草亚种（Bacillussubtilissubsp.subtilis)。
[0006] 上述菌剂的有效总活菌数大于等于108CFU/mL;其中，所述两歧双歧杆菌、所述丁 酸梭菌、所述地衣芽孢杆菌和所述枯草芽孢杆菌枯草亚种的有效活菌数的比例为1 :1. 25 : 1. 25 ： 1. 5〇
[0007]上述菌剂的有效总活菌数为 10lclCFU/mL、10nCFU/mL、1014CFU/mL或 1015CFU/mL;
[0008]所述两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)为两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)CGMCCNO. 1. 5091、所述丁 酸梭菌（Clostridiumbutyricu)为丁 酸梭菌 (Clostridiumbutyricu)CGMCCNO. 1.336、所述地衣芽抱杆菌（Bacilluslicheniformis) 为地衣芽抱杆菌（Bacilluslicheniformis)CGMCCNO. 1.813、所述枯草芽抱杆菌枯草亚 种（Bacillussubtilissubsp.subtilis)为枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillussubtilis subsp.subtilis)CGMCCNO. 1. 1731。
[0009] 本发明的另一个目的是提供一种制备菌剂的方法。
[0010] 本发明提供的方法，为如下1)或2):
[0011] 1)包括如下步骤：将两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)、丁酸梭菌 (Clostridiumbutyricu)、地衣芽抱杆菌（Bacilluslicheniformis)和枯草芽抱杆菌枯草 亚种（Bacillussubtilissubsp.subtilis)种子液混勻，接种到固态发酵培养基中，发酵 培养，收集发酵产物，即得到菌剂；
[0012] 所述固态发酵培养基由固态基质和含有生长因子的MRS液体培养基按照lg: 0. 5mL的比例混合，得到的固态发酵培养基；
[0013] 所述固态基质为玉米糠、豆柏、豆渣（榨豆浆后的残渣）或麦麸；所述固态基质具 体为麦麸；
[0014] 所述生长因子为西红柿汁或低聚果糖；所述生长因子具体为西红柿汁；
[0015]2)包括如下步骤：将两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)、丁酸梭菌 (Clostridiumbutyricu)、地衣芽抱杆菌（Bacilluslicheniformis)和枯草芽抱杆菌枯草 亚种（Bacillussubtilissubsp.subtilis)种子液混勻，接种到液态发酵培养基中，发酵 培养，收集发酵产物，即得到菌剂；
[0016] 所述液态发酵培养基为含有生长因子的MRS液体培养基。
[0017] 上述方法中，所述菌剂的有效总活菌数大于等于108CFU/mL;其中，所述两歧双歧 杆菌、所述丁酸梭菌、所述地衣芽孢杆菌和所述枯草芽孢杆菌枯草亚种的有效活菌数的比 例为 1 :1. 25 :1. 25 :1. 5。
[0018] 上述方法中，所述菌剂的有效总活菌数为KTCFU/mUlOUCFU/mUK^CFU/mL或 1015CFU/mL；
[0019] 所述固态发酵培养基为麦麸和含有西红柿汁的MRS液体培养基按照lg:0. 5mL的 比例混合，得到的固态发酵培养基；
[0020] 所述含有西红柿汁的MRS液体培养基由MRS液体培养基和西红柿汁组成，所述西 红柿汁在所述液态发酵培养基中的终浓度为50-100ml/l;所述西红柿汁在所述液态发酵 培养基中的终浓度具体为50mL/L。
[0021] 上述方法中，所述两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)种子液中菌体含量为 107CFU/mL；
[0022] 所述丁酸梭菌（Clostridiumbutyricu)种子液中菌体含量为107CFU/mL;
[0023] 所述地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis)种子液中菌体含量为107CFU/mL;
[0024] 所述枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillussubtilissubsp.subtilis)种子液中菌 体含量为107CFU/mL;
[0025] 所述各种子液混匀均为等体积混匀；
[0026] 所述两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)种子液具体为将所述两歧双歧杆菌 (Bifidobacteriumbifidum)在MRS液体培养基中培养，收集培养液，得到种子液；
[0027] 所述丁酸梭菌（Clostridiumbutyricu)种子液具体为将所述丁酸梭菌 (Clostridiumbutyricu)在MRS液体培养基中培养，收集培养液，得到种子液；
[0028] 所述地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis)种子液具体为将所述地衣芽孢杆 菌（Bacilluslicheniformis)在MRS液体培养基中培养，收集培养液，得到种子液；
[0029] 所述枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillussubtilissubsp.subtilis)种子液具体 为将所述枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillussubtilissubsp.subtilis)在MRS液体培养 基中培养，收集培养液，得到种子液。
[0030] 上述方法中，所述发酵培养的温度为30-38°C，时间为18-36小时；
[0031]所述两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)为两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)CGMCCNO. 1. 5091、所述丁 酸梭菌（Clostridiumbutyricu)为丁 酸梭菌 (Clostridiumbutyricu)CGMCCNO. 1.336、所述地衣芽抱杆菌（Bacilluslicheniformis) 为地衣芽抱杆菌（Bacilluslicheniformis)CGMCCNO. 1.813、所述枯草芽抱杆菌枯草亚 种（Bacillussubtilissubsp.subtilis)为枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillussubtilis subsp.subtilis)CGMCCNO. 1. 1731。
[0032] 由上述方法制备的菌剂也是本发明保护的范围。
[0033] 上述菌剂或上述的菌剂在提高黄粉虫生物量中和/或降低黄粉虫死亡率的应用 也是本发明保护的范围。
[0034] 所述提高黄粉虫生物量具体体现在提高百虫重。
[0035] 本发明采用四联益生菌饲喂黄粉虫，通过分析死亡率、体长、头宽和百虫重等指 标，判断益生菌剂对黄粉虫生长的促进作用，发现四联益生菌可以提高黄粉虫存活率，促进 其生长。

【专利附图】

【附图说明】
[0036] 图1为利用MRS培养基纯培养和混合培养在24小时获得活菌数对比
[0037](均值土标准差，单因素方差分析，n= 3, ****P〈0. 0001)
[0038] 图2为四联菌混合培养在PTYG和MRS上生长曲线的对比（三次独立重复，取中值 作图）
[0039] 图3为外加生长因子对四联菌生长的作用（A:西红柿汁；B:低聚果糖）（均值土 标准误差；单因素方差分析；n= 3 ;*P〈0. 05, #P〈0. 01，*#P〈0. 001，##P〈0. 0001)
[0040] 图4为固态基质对四联菌生长的影响（三次独立重复，取中值作图）
[0041](中值 土标准误差；单因素方差分析；n=3 ;*P〈0. 05, **P〈0. 01，***P〈0. 001，** **P〈0. 0001)
[0042] 图5为不同温度对四联菌存活率的影响（三次独立重复，取中值作图）
[0043] 图6为模拟消化液对四联菌存活率的影响（均值土标准差；n= 3)
[0044] 图7为混合益生菌对黄粉虫存活率和百虫重的影响（实验室研究规模）（均值土 标准误差；n= 6 ;非配对t, **p〈0. 01，***p〈0. 001)
[0045] 图8为混合益生菌对黄粉虫存活率和百虫重的影响（工业化生产规模）（均值土 标准误差；单因素方差分析；n= 3 ;*p〈0. 05)

【具体实施方式】
[0046] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，部分如 下：
[0048] 1、菌种
[0049]两歧双歧杆菌CGMCCNO. 1. 5091(Bifidobacteriumbifidum)(购自广东凯威 生物科技有限公司）；丁酸梭菌CGMCCNO. 1.336(Clostridiumbutyricu)、地衣芽孢 杆菌CGMCCNO. 1. 813(Bacilluslicheniformis)和枯草芽抱杆菌枯草亚种CGMCC NO. 1. 1731(Bacillussubtilissubsp.subtilis)均购自CGMCC。
[0050] 2、培养基
[0051] MRS培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，肉浸膏5g，酵母提取物10g，K2HP042g，柠檬酸 二胺 2g，乙酸钠 5g，吐温-801mL，MgS04 ? 7H20 0? 58g，MnS04 ? 4H20 0? 25g，pH6. 2 ?6. 4,水 1000mL。121°C湿热灭菌 15min。。
[0052]PTYG培养基：葡萄糖10g，酵母提取物10g，大豆蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，0. 1%刃 天青lmL，吐温-801mL，盐溶液40mL，L-半胱氨酸盐酸0? 5g，PH值6. 8?7. 0,水1000mL。 113°C湿热灭菌30min。
[0053]无机盐溶液：无水CaCl20. 2g，K2HP041. 0g，MgS04. 7H20 0? 48g，KH2P041. 0g， NaHC0310. 0g，NaCl2. 0g，水 1000mL。
[0054] 3、模拟动物消化道液
[0055] 模拟胃液：浓盐酸16. 4mL，胃蛋白酶10g，加水搅匀后定容至1000mL，PH值1. 2,过 滤除菌。
[0056] 模拟肠液：磷酸二氢钾6. 8g，加水500mL溶解；另取胰酶10g加水溶解，将两液混 合，加水定容至lOOOmL，PH值6. 8,过滤除菌。
[0057] 模拟胆汁溶液：7号胆盐溶于蒸馏水中，浓度为1% (g/mL)，过滤除菌。
[0058] 实施例1、四联菌固态发酵物的制备
[0059] -、培养基成分及培养条件优化
[0060] 1、混合培养和纯培养
[0061] 大多数微生物发酵采用采用纯培养技术，但这不一定是获得高活菌数最佳的方 法。本研究采用MRS液体培养基，通过测量活菌数（NLB)对比了四联菌混合培养和纯培养 得到的活菌数。
[0062] 活化：两歧双歧杆菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭菌CGMCCNO. 1. 336、地衣芽孢杆菌 CGMCCNO. 1. 813和枯草芽孢杆菌枯草亚种CGMCCNO. 1. 1731分别按接种量1% (v/v)接种 于10mL无菌MRS液体培养基中，37°C厌氧培养36h，分别得到各菌种子液（107CFU/mL)。
[0063] 混合培养：将上述单菌种活化两代后种子液各取lmL混合，按接种量1 % (v/v)接 种于30mLMRS液体培养基中，37 °C厌氧培养24h，收集四联菌培养液。
[0064] 纯培养：将上述单菌种活化两代后各自按照接种量1 % (v/v)接种于30mL无菌 PTYG培养基中，37°C厌氧培养24h，分别收集各种菌的培养液。
[0065] 采用倾注法结合双层平板计数法检测四联菌培养液和各种菌单独培养培养液中 活菌数（NLB)，结果如图1所示，纯培养获得活菌数均约为107CFU/mL，联菌混合培养获得总 活菌数为l〇8CFU/mL。
[0066] 因此，与纯培养相比，混合培养可以获得更高的活菌数。.
[0067] 2、培养基优化
[0068]PTYG和MRS是两种常用的益生菌培养基，接下来本研究对比了两种培养基在四联 菌混合发酵中的效果，选择获得高活菌数的培养基用于后继优化研究。
[0069] 活化：两歧双歧杆菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭菌CGMCCNO. 1. 336、地衣芽孢杆菌 CGMCCNO. 1. 813和枯草芽孢杆菌枯草亚种CGMCCNO. 1. 1731分别按接种量1% (v/v)接 种于10mL无菌PTYG(或MRS)液体培养基中，37°C厌氧培养36h，得到各菌种子液（107CFU/ mL)。
[0070] 混合培养：将上述单菌种活化两代后种子液各取lmL混合，按接种量1 % (v/v)分 别接种于30mL无菌PTYG(或MRS)液体培养基中，37 °C厌氧培养，分别收集四联菌培养液 (PTYG)和四联菌培养液（MRS)。
[0071] 绘制72小时生长曲线，结果如图2所示，四联菌在MRS培养基上取得了活菌数 3. 32*109CFU/mL，相当于在PTYG培养基上的活菌数的两倍。不仅如此，四联菌在MRS培养 基上的延迟期仅为4小时，稳定期达到10小时；而在PTYG培养基延迟期为8小时，而稳定 期仅为6小时，这些数据说明MRS培养基更适合于四联菌混合培养。
[0072]3、液体发酵培养基优化
[0073] 西红柿汁：熟透的西红柿（普通西红柿）洗净后用榨汁机打成西红柿汁，液体用双 层纱布过滤。
[0074] 含有西红柿汁的发酵培养基：在MRS液体培养基中加入西红柿汁，得到含有西红 柿汁的发酵培养基，且西红柿汁在含有西红柿汁的发酵培养基中的终浓度分别为0、20、30、 50、70、100mL/L;
[0075] 含有低聚果糖的发酵培养基：在MRS液体培养基中加入低聚果糖（郑州诚旺化工 责任有限公司EINECS号：200-333-3)到含有低聚果糖的发酵培养基，且低聚果糖在含有低 聚果糖的发酵培养基中的终浓度分别为〇、2. 5、5、7. 5、10、15g/L;
[0076] 将两歧双歧杆菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭菌CGMCCNO. 1. 336、地衣芽孢杆菌 CGMCCNO. 1. 813和枯草芽孢杆菌枯草亚种CGMCCNO. 1. 1731种子液（107CFU/mL)各取lmL 混合，按接种量1 % (v/v)分别接种于30mL含有西红柿汁的发酵培养基和含有低聚果糖的 发酵培养基中，37°C厌氧培养，分别收集四联菌培养液（西红柿）和四联菌培养液（MRS)，即 为四联益生菌剂。
[0077] 其中，四联菌培养液（西红柿）和四联菌培养液（MRS)中两歧双歧杆菌 (Bifidobacteriumbifidum)CGMCCN0. 1.5091、丁 酸梭菌（Clostridiumbutyricu)CGMCC NO. 1. 336、地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis)CGMCCNO. 1.813 和枯草芽孢杆菌枯 草亚种（Bacillussubtilissubsp.subtilis)CGMCCNO. 1. 1731 的有效活菌数配比为 1 : 1. 25:1. 25:1. 5。
[0078] 检测四联菌培养液中活菌数（NLB)，结果如图3所示，可以看出，与不添加西红柿 和低聚果糖的MRS培养基相比，添加这些物质均可促进益生菌生长，添加后，四联菌活菌数 达到101(lCFU/mL，比对照组增加了 10倍（109CFU/mL)，认为西红柿和低聚果糖可作为益生菌 生长的生长因子。
[0079] 进一步分析能获得最高活菌数的最低的添加量，当西红柿汁添加量为70mL/L，获 得最高活菌数5. 31*101(lCFU/mL;低聚果糖添加量10g/L，取得最高活菌数1. 02*101(lCFU/mL。 所以西红柿汁效果优于低聚果糖。
[0080] 另外，还将西红柿汁和低聚果糖混合添加在MRS液体培养基中，使其终浓度分别 为70mL/L和10g/L，接种四联菌，培养，获得的活菌数结果与单独西红柿汁添加量为70mL/L 无显著差异。
[0081] 因此，选择西红柿汁用作促生长因子，用于四联菌培养。
[0082] 西红柿汁添加量50、70和100mL/L，活菌数差异不显著，所以为了节省工业化生产 成本，50mL/L西红柿汁添加到MRS培养基用于四联菌混合发酵为最优的添加量。
[0083] 因此，最佳的液体发酵培养基为含有50mL/l西红柿汁的发酵培养基。
[0084]4、固态发酵培养基优化
[0085] 含有玉米糠的固态发酵培养基：将玉米糠为固态基质，按照lg固态基质/0. 5mL液 体培养基的比例向固态基质上浇注含有50mL/L西红柿汁的MRS液体培养基，使固态基质湿 润但无液体流出，得到含有玉米糠的固态发酵培养基。
[0086] 含有麦麸的固态发酵培养基：将麦麸为固态基质，按照lg固态基质/〇. 5mL液体培 养基的比例向固态基质上浇注含有50mL/L西红柿汁的MRS液体培养基，使固态基质湿润但 无液体流出，得到含有麦麸的固态发酵培养基。
[0087] 含有豆柏的固态发酵培养基：将豆柏为固态基质，按照lg固态基质/0. 5mL液体培 养基的比例向固态基质上浇注含有50mL/L西红柿汁的MRS液体培养基，使固态基质湿润但 无液体流出，得到含有豆柏的固态发酵培养基。
[0088] 含有豆渣的固态发酵培养基：将豆渣为固态基质，按照lg固态基质/0. 5mL液体培 养基的比例向固态基质上浇注含有50mL/L西红柿汁的MRS液体培养基，使固态基质湿润但 无液体流出，得到含有豆渣的固态发酵培养基。
[0089] 各取2mL两歧双歧杆菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭菌CGMCCNO. 1. 336、地衣芽孢杆 菌CGMCCNO. 1. 813和枯草芽孢杆菌枯草亚种CGMCCNO. 1. 1731种子液（菌的含量107CFU/ mL)混合后均匀，按照0. 5% (v/w)接种在20g上述各种固态发酵培养基上，37°C厌氧培养 24h。以含有50mL/L西红柿汁的MRS液体培养基液态发酵为对照。
[0090] 结果如图4所示，所有的固态发酵均取得了优于液态发酵的结果，对照得到的 活菌数为3. 63*101(1 ;四种基质分别取得了活菌数如下：含有玉米糠基质获得的活菌数 为2. 31*1014CFU/g(g是基质，即每g基质获得多少活菌）、含有豆柏基质获得的活菌数为 1. 28*10nCFU/g、含有豆渣基质获得的活菌数为1. 64*1015CFU/g、含有麦麸基质获得的活菌 数为3.93*1014CFU/g。四种固态基质取得了活菌数差异显著，说明不同的基质对四联菌发酵 效果不同。豆渣取得了最高活菌数，但由于很难购买，所以不适合作为工业化生产的原料。 玉米糠和麦麸取得了类似结果，但麦麸价格低于玉米糠。所以麦麸被选用作为固态发酵基 质。
[0091] 因此，最佳的固态发酵培养基为含有麦麸的固态发酵培养基。
[0092] 二、四联菌固态发酵物的制备
[0093] 通过上述一的实验，采用最佳的固态发酵培养基进行发酵四联菌，具体如下：
[0094] 各取3mL两歧双歧杆菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭菌CGMCCNO. 1. 336、地衣芽孢 杆菌CGMCCNO. 1. 813和枯草芽孢杆菌枯草亚种CGMCCNO. 1. 1731的种子液（含活菌数约 107CFU/mL，等体积混合）混合后，取lOmL均匀接种在200g含有麦麸的固态发酵培养基上 (即接种量〇. 5%v/w)，37°C厌氧培养24h，收集培养产物（培养皿中的全部物质），即为四 联菌固态发酵物，即为四联益生菌剂。
[0095] 检测四联菌固态发酵物的总活菌数，为6.12*1013CFU/g。
[0096] 四联菌固态发酵物中两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)CGMCCNO. 1. 5091、 丁 酸梭菌（Clostridiumbutyricu)CGMCCNO. 1.336、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)CGMCCNO. 1.813 和枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillussubtilissubsp. subtilis)CGMCCNO. 1. 1731 的有效活菌数配比为 1:1. 25:1. 25:1. 5。
[0097] 三、四联菌固态发酵物性质的检测
[0098] 1、四联菌固态发酵物的热稳定性及储藏稳定性
[0099] 将200g上述二制备的活菌数为6. 12*1013CFU/g四联菌固态发酵物装入真空塑料 袋。分别放入4°C，25°C和30°C，每个温度放入三袋，放置30天。每六天取样测量活菌数。 活菌数的三个重复值的中间值用于分析作图。
[0100] 结果如图5所示，第30天的活菌数如下：保存于4°C1.75*10nCFU/g，保存于 25°C4. 53*109CFU/g，保存于30°C9. 26*106CFU/g。虽然经过30天的保存，三个温度下活菌 数都有所下降，但4°C下活菌数仅降低了两个数量级，说明四联菌固态发酵物可以在4°C下 长时间保存。
[0101] 益生菌制剂标准为活菌数高于l〇6CFU/g，所以获得的四联菌固态发酵物在25°C下 保存30天，还高于上述标准。而四联菌固态发酵物在30°C下，活菌数迅速下降至106。
[0102] 基于以上数据，四联菌固态发酵物可以在低于25°C条件下运输和储存30天，与 4 °C相比，这极大的降低了运输和储存成本。
[0103] 2、四联菌固态发酵物在模拟动物胃肠环境中性质检测
[0104] 将上述二制备的70g活菌数为1. 45*1014CFU/g四联菌固态发酵物置于200mL无 菌水中，容器为三角瓶（内含玻璃珠），180r/min摇床处理，30min，37°C，制备成四联菌菌悬 液，分别按①、②、③、④处理后，14000g离心5min，弃上清，分别对菌体进行活菌计数：
[0105] ①10mL菌悬液注入40mL模拟胃液，180r/min摇床处理，lh，37°C。
[0106] ②10mL菌悬液注入40mL模拟胆汁溶液，180r/min摇床处理，30min，37°C。
[0107] ③10mL菌悬液注入40mL模拟肠液，180r/min摇床处理，45min，37°C。
[0108] ④10mL菌悬液注入40mL模拟胃液，180r/min摇床处理比，，371：，1400(^离心 5min，弃上清；沉淀溶于10mL无菌水，注入40mL模拟胆汁溶液，180r/min摇床处理30min， 同上离心；沉淀溶于10mL无菌水，注入40mL模拟肠液中，180r/min摇床处理45min，同上离 心。
[0109] 结果如图6所示，采用不同的模拟消化液处理四联菌后，存活率差别很大；当采 用模拟胃液处理1小时后，四联菌活菌数降至4. 3*109CFU/g;模拟胆汁溶液处理30min 后，活菌数下降到3. 15X10nCFU/g;模拟肠液处理45min后，活菌数有所上升，达到 2. 29X1014CFU/g;经过消化道模拟实验，即先后经过模拟胃液处理1小时、模拟胆汁溶液处 理30分钟，最后模拟肠液处理45分钟，活菌数为9. 17*1012CFU/g，高于菌剂要求106CFU/g。
[0110] 以上数据说明，四联益生菌剂在达到动物肠道后，仍然保持活性，可以发挥作用。
[0111] 实施例2、四联益生菌剂在提高黄粉虫（Tenebriomolitoris)生物量中的应用
[0112] 1、实验室规模研究方法
[0113] 黄粉虫为河北科技师范保存，本研究使用2400条五龄幼虫（孵出后约25天），分 成12组，每组200头，每组总重量基本一致，约7g。培养于15cm培养皿中。温度25°C，相 对湿度55-65%。
[0114] 12组随机编号为1-12:
[0115] 四联菌组：1_6组饲喂四联菌液态发酵产物，将四联菌液态发酵产物重悬于10mL 无菌水中，均匀喷洒于饲养黄粉虫的培养皿内，每四天一次。
[0116] 对照组：7_12组饲喂等剂量无菌水作为对照。
[0117] 四联菌液体发酵产物制备：将2mL两歧双歧杆菌CGMCCNO. 1. 5091、丁酸梭 菌CGMCCN0. 1.336、地衣芽孢杆菌CGMCCN0. 1.813和枯草芽孢杆菌枯草亚种CGMCC NO. 1. 1731的种子液（接种量1% (v/v))混合后，接种在100mL含有50mL/L西红柿汁的MRS 液体培养基中，发酵24小时，收集发酵产物，离心，收集沉淀，得到四联菌液态发酵产物。用 10mL无菌水悬起沉淀，均勻喷洒黄粉虫，每四天一次。
[0118] 发现病虫或死虫，捡出。20天后，测量死亡率、虫体长、头宽和百虫重指标。计算方 法如下
[0119] 发现病虫或死虫，捡出。20天后，测量死亡率、虫体长、头宽和百虫重指标。
[0120] 死亡率=(200-皿中剩余虫头数）/200*100% ;
[0121] 虫体长和头宽，将水域预热至65°C，黄粉虫迅速放入水中杀死，使用游标卡尺测量 虫体长和头宽，每组随机选取十头黄粉虫，测量后均值用于分析。
[0122] 百虫重：由于黄粉虫个体体重较轻，所以称取100头黄粉虫总质量来反应其生长 情况，随机选取100头，使用天平进行称重，每组重复三次取平均值用于分析。
[0123] 实验重复3次，结果取平均值。
[0124] 结果如表1和图7所示，经过20天的饲喂后，黄粉虫死亡率从4. 75% (对照组） 降低至1. 17% (四联菌组），体长和头宽没有显著变化，但百虫重增加了 0. 5g(四联菌组为 9. 02g)。不仅如此，干物质（指除去全部水分后物质的重量）增加了近0.83%。以上数据 表明，饲喂四联益生菌可以提高黄粉虫生物量。
[0125] 表1为黄粉虫作为动物饲料原料的关键营养成分分析
[0126]

【权利要求】
1. 一种用于饲喂黄粉虫的菌剂，其活性成分为两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)、丁酸梭菌（Clostridium butyricu)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)和 枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis)。
2. 根据权利要求1中所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂的有效总活菌数大于等于 108CFU/mL;其中，所述两歧双歧杆菌、所述丁酸梭菌、所述地衣芽孢杆菌和所述枯草芽孢杆 菌枯草亚种的有效活菌数的比例为1 :1. 25 :1. 25 :1. 5。
3. 根据权利要求1或2中所述的菌剂，其特征在于：所述两歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bifidum)为两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)CGMCC NO. 1.5091、 所述丁 酸梭菌（Clostridium butyricu)为丁 酸梭菌（Clostridium butyricu)CGMCC NO. 1.336、所述地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)为地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)CGMCC NO. 1.813、所述枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis)为枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis)CGMCC NO. 1. 1731。
4. 一种制备权利要求1-3中任一所述的菌剂的方法，为如下1)或2): 1) 将两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)、丁酸梭菌（Clostridium butyricu)、 地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)和枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis)种子液混匀，接种到固态发酵培养基中，发酵培养，收集发酵产物，即得到 菌剂； 所述固态发酵培养基由固态基质和含有生长因子的MRS液体培养基按照lg :0. 5mL的 比例混合，得到的固态发酵培养基； 所述固态基质为玉米糠、豆柏、豆渣或麦麸；所述固态基质具体为麦麸； 所述生长因子为西红柿汁或低聚果糖；所述生长因子具体为西红柿汁； 2) 将两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)、丁酸梭菌（Clostridium butyricu)、 地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)和枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis)种子液混匀，接种到液态发酵培养基中，发酵培养，收集发酵产物，即得到 菌剂； 所述液态发酵培养基为含有生长因子的MRS液体培养基。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于： 所述菌剂的有效总活菌数大于等于108CFU/mL;其中，所述两歧双歧杆菌、所述丁酸 梭菌、所述地衣芽孢杆菌和所述枯草芽孢杆菌枯草亚种的有效活菌数的比例为1 :1. 25 :1. 25 ： 1. 5〇
6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于： 所述固态发酵培养基为麦麸和含有西红柿汁的MRS液体培养基按照lg :0. 5mL的比例 混合，得到的固态发酵培养基； 所述含有西红柿汁的MRS液体培养基由MRS液体培养基和西红柿汁组成，所述西红柿 汁在所述液态发酵培养基中的终浓度为50-100mL/L ;所述西红柿汁在所述液态发酵培养 基中的终浓度具体为50mL/L。
7. 根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于： 所述两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)种子液中菌体含量为107CFU/mL ; 所述丁酸梭菌（Clostridium butyricu)种子液中菌体含量为107CFU/mL ; 所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)种子液中菌体含量为107CFU/mL; 所述枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis)种子液中菌体含 量为 107CFU/mL ; 所述各种子液混匀均为等体积混匀； 所述两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)种子液具体为将所述两歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bifidum)在MRS液体培养基中培养，收集培养液，得到种子液； 所述丁酸梭菌（Clostridium butyricu)种子液具体为将所述丁酸梭菌（Clostridium butyricu)在MRS液体培养基中培养，收集培养液，得到种子液； 所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)种子液具体为将所述地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)在MRS液体培养基中培养，收集培养液，得到种子液； 所述枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis)种子液具体为将 所述枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis)在MRS液体培养基中 培养，收集培养液，得到种子液。
8. 根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于： 所述发酵培养的温度为30-38°C，时间为18-36小时； 所述两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)为两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum) CGMCC NO. 1. 5091、所述丁 酸梭菌（Clostridium butyricu)为丁 酸梭菌 (Clostridium butyricu)CGMCC NO. 1.336、所述地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis) 为地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)CGMCC NO. 1.813、所述枯草芽抱杆菌枯草亚 种（Bacillus subtilis subsp. subtilis)为枯草芽抱杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp.subtilis)CGMCC NO. 1. 1731。
9. 由权利要求4-8中任一所述方法制备的菌剂。
10. 权利要求1-3中任一所述菌剂或权利要求9所述的菌剂在提高黄粉虫生物量中和 /或降低黄粉虫死亡率的应用。 所述提商黄粉虫生物量具体体现在提商百虫重。
【文档编号】C12N1/20GK104342391SQ201410586164
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】张瑾, 张帆, 李红强, 胡铁锋 申请人:河北科技师范学院