一种植物乳酸杆菌atcc 8014与芦荟共发酵饮料的制备方法
【专利摘要】一种植物乳酸杆菌ATCC 8014与芦荟共发酵饮料的制备方法，其特征是利用库拉索芦荟原汁与植物乳酸杆菌ATCC 8014共发酵，通过设定不同的温度梯度和PH梯度，经活菌计数后，确定其最佳发酵条件。用芦荟发酵液对致病菌进行抑菌实验，确定其抗菌能力；并通过对其抗氧化性指标的测定，如DPPH自由基清除能力的测定、铁离子螯合能力的测定和总还原力的测定等，初步确定了该芦荟益生菌发酵液的抗氧化能力，并进行评价，以实现芦荟洗液和芦荟饮品的研制。
【专利说明】一种植物乳酸杆菌ATCC 8014与芦荟共发酵饮料的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及植物乳酸杆菌ATCC 8014与芦荟原汁共发酵条件的摸索及其抗氧化性和抑菌效果的研究，将发酵液进行抑菌试验，测定其并抑菌效果；并对发酵液的抗氧化能力进行了测定和评价，主要用于今后相关芦荟洗液和芦荟饮品的研制，具体涉及一种植物乳酸杆菌ATCC 8014与芦荟共发酵饮料的制备方法。
【背景技术】
[0002]芦荟属百合科草本植物，芦荟凝胶中含有丰富的多糖、蛋白质、氨基酸、维生素、活性酶及对人体十分有益的微量元素。它具有多重功效，美白、保湿、控油、除痘等作用。并且芦荟提取液常添加在食品、药品、牙膏及化妆品中，不仅具有抗细菌、防止皮肤干裂或油脂分泌多、对治疗雀斑、青春痘和防止脱发、去头屑、消炎、愈合伤口、免疫、抗肿瘤都有极好的疗效。
[0003]益生菌是指一类对人和动物有益的细菌，指投入后通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，提高宿主健康水平和使宿主健康达到最佳状态的活菌制剂及其代谢产物，各种食品中更是添加多种益生菌，增强食品营养价值。
[0004]植物性乳酸菌是从泡菜、腌菜、豆瓣酱等传统的植物性发酵食品中分离筛选出来的一类乳酸菌，包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌等。
[0005]目前人们所食用的酸奶等乳酸菌制品多是动物性乳酸菌发酵而来的；然而植物性乳酸菌与动物性乳酸菌相比，耐酸和耐胆盐能力更强，且能在营养不均的恶劣环境下生存，所以进入人体肠道存活率更高，定植能力更强。故植物性乳酸菌制品在改善肠道环境、提高人体免疫力方面更有优势。
[0006]本发明，采用植物乳酸杆菌ATCC 8014与芦荟原汁进行共发酵，研究了发酵液的抗氧化能力和发酵液的抑菌能力，并进行了评价。
【发明内容】
[0007]本发明主要用于芦荟洗液和芦荟饮品的研制，对研制前期的芦荟发酵液最佳条件进行探索，并进行抗氧化性的测定，评价芦荟发酵液产品研制过程中具有的优势，本发明提供一种植物乳酸杆菌ATCC 8014与芦荟共发酵饮料的制备方法。
[0008]本发明所述制备方法包括下列步骤:
1、芦荟的选择和制备:采选新鲜、饱满、肉质肥厚的芦荟叶片，剔除带有病斑、软腐的叶片，叶片均重30(T400 g;叶片采用75%酒精进行表面消毒，去除芦荟叶表面皮层，采用榨汁机榨汁，分装后，6000 rpm/min离心10 min，再次分装，制成芦荟原汁，所述芦荟为库拉索
Sifc
尸衣ο
[0009]2、采用巴氏消毒法将芦荟原汁灭菌，55 °C处理30 min,4 °C保存备用。
[0010]3、植物乳酸杆菌ATCC 8014的活化 A从-80 1:冰箱取出植物乳酸杆菌ATCC 8014，按培养基体积的5%接种于5 mL MRS培养基中，于37 °C恒温培养箱中培养过夜。
[0011]B取过夜培养的植物乳酸杆菌ATCC 8014，按培养基体积的5%接种5 mL培养基中，
二次活化。
[0012]4、发酵条件的设定
A、设定发酵温度梯度分别为25°C、30 °C、37 °C、42 °C，在上述不同的发酵温度条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸杆菌ATCC8014接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，得到不同温度条件下的芦荟发酵液；
B、取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀进行活菌计数，确定最佳发酵温度。
[0013]C、在最佳发酵温度的条件下，设定芦荟原汁PH梯度为3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸杆菌ATCC 8014接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20h，采用PH计调节PH。
[0014]D、取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀释，取50 μ L涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵ΡΗ。
[0015]5、最佳条件发酵及发酵后处理:在步骤4确定最佳PH和最佳温度后，取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，接种芦荟原汁5%的植物乳酸杆菌ATCC8014，发酵48 h，10000 rpm/min离心10 min,重新分装，获得植物乳酸杆菌ATCC 8014芦荟发酵液，4 °C保存备用。
[0016]6、芦荟发酵液抗氧化性指标的测定和后期评价
A、DPPH自由基清除能力的测定
取2ml芦荟发酵液，加入2ml DPPH乙醇溶液，黑暗下室温反应30min，然后用等体积的三氯甲烷抽提，取上清517nm测0D，对照为去离子水加DPPH溶液。
[0017]B、羟基自由基清除能力的测定
取2 mmol/L的硫酸亚铁溶液I mL, 6 mmol/L过氧化氢I mL, 6 mmol/L水杨酸I mL,并加入芦荟发酵液I mL，静置30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm处测定吸光度，计算羟自由基的清除率。
[0018]C、3，5- 二硝基水杨酸法测定还原糖
a、标准曲线的制作:取8支15 mmX 180 mm试管,分别编号为O至7,向其中依次加入
0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、2.0 mL的I mg/mL的葡萄糖标准溶液,然后用蒸懼水定容到2 mL再依次加入1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度。
[0019]b、样品中还原糖含量的测定:以标准曲线制作中O号为对照，向15 mmX 180 mm试管中加入I mL样品溶液，I mL蒸馏水和1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度。
[0020]D、对Fe2+的螯合能力的测定
取0.5 mL芦荟发酵液中加入0.4%的FeS04溶液0.1 mL混合均匀后，再加入0.1 mL1%的抗坏血酸溶液和0.2 mol/L氢氧化钠溶液I mL，37°C下反应20 min，然后用10%的三氯乙酸去除蛋白6000 rpm, 10 min,4°C,取0.4 mL上清并加入4 mL 0.1%邻二氮菲，室温反应10 min，测定536 nm处吸光度。
[0021]E、总还原力的测定
取I mL的样品，加入I mL的磷酸缓冲液P H=6.6和1%铁氰化钾溶液I mL，混匀，在50 °C下保温20 min,加入10 %的三氯乙酸溶液I mL，振荡混匀后取I mL的混合液，加入4 mL去离子水和0.1 %的三氯化铁溶液0.4 mL，静置10 min，用去离子水为空白，在700 nm下进行比色，吸光度的值越大，说明还原力越强。
[0022]7、抑菌试验
A.活化鼠伤寒、肠炎沙门、志贺301、福氏志贺、单增ATCC、金黄色葡萄球菌大肠0157、痤疮丙酸杆菌，过夜培养。
[0023]B.将8株致病菌的菌体浓度调至18 CFU/mL左右，分别取100 μ L菌液涂布于LB平板。
[0024]C.待菌液吹干后，在平板中小心放入无菌的牛津杯；将发酵液上清10000 rpm/min离心10 min,向牛津杯中加入发酵液上清。
[0025]D.37°C培养6-8 h，每隔2?3 h观察。
[0026]E.测量平板中的抑菌圈直径，并照相。
[0027]8、芦荟发酵液后期评价
针对步骤6中的抗氧化性指标测定结果，对该芦荟发酵液上清进行抗氧化能力的评价。
[0028]本发明的有益效果:本发明所制备的发酵饮料，安全无毒，将芦荟本身原有的保健功能和植物乳酸杆菌ATCC 8014的益生效果完美结合在一起，具有美容、调节肠道菌群平衡、促进肠道蠕动等功效，有益于人体健康。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1不同温度活菌计数结果；
图2不同PH活菌计数结果；
图3植物乳酸杆菌ATCC 8014发酵液抗氧化参数测定；
图4还源糖测定标准曲线；
图5ATCC 8014芦荟发酵液抑菌结果；
图6ATCC 8014芦荟发酵液抑菌图片。
【具体实施方式】
[0030]实施例1:
一种植物乳酸杆菌ATCC 8014与芦荟共发酵饮料的制备方法:
1、芦荟的选择和制备:采选新鲜、饱满、肉质肥厚的芦荟叶片，剔除带有病斑、软腐的叶片，叶片均重30(T400 g;叶片采用75%酒精进行表面消毒，去除芦荟叶表面皮层，采用榨汁机榨汁，分装后，6000 rpm/min离心10 min，再次分装，制成芦荟原汁，所述芦荟为库拉索尸衣ο
[0031]2、采用巴氏消毒法将芦荟原汁灭菌，55 °C处理30 min,4 °C保存备用。
[0032]3、植物乳酸杆菌ATCC 8014的活化 A从-80 1:冰箱取出植物乳酸杆菌ATCC 8014，按培养基体积的5%接种于5 mL MRS培养基中，于37 °C恒温培养箱中培养过夜。
[0033]B取过夜培养的植物乳酸杆菌ATCC 8014，按培养基体积的5%接种5 mL培养基中，
二次活化。
[0034]4、发酵条件的设定
A、设定发酵温度梯度分别为25°C、30 °C、37 °C、42 °C，在上述不同的发酵温度条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸杆菌ATCC8014接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，得到不同温度条件下的芦荟发酵液；
B、取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀进行活菌计数，确定最佳发酵温度。
[0035]C、在最佳发酵温度的条件下，设定芦荟原汁PH梯度为3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸杆菌ATCC 8014接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20h，采用PH计调节PH。
[0036]D、取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀释，取50 μ L涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵ΡΗ。
[0037]5、最佳条件发酵及发酵后处理:在步骤4确定最佳PH和最佳温度后，取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，接种芦荟原汁5%的植物乳酸杆菌ATCC8014，发酵48 h，10000 rpm/min离心10 min,重新分装，获得植物乳酸杆菌ATCC 8014芦荟发酵液，4 °C保存备用。
[0038]实施例2:抗氧化指标的测定及评价
1、相关试剂配制:0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液:0.007886 g DPPH溶于100 mL乙醇，避光配制，现配现用；150 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl:2.364 g Tris-HCl 溶于 100 mL 蒸馏水中；1.2 mmol/L邻苯三酚:0.01513 g邻苯三酚10 mM HCl，加蒸馏水定容至100 mL，避光保存；0.4% FeS04: FeS04*7H20:0.7315 g溶于100 mL蒸馏水中，避光保存；1%抗坏血酸:抗坏血酸I g溶解于100 mL蒸馏水中，避光保存；0.2 mol/L氢氧化钠:NaOH 0.8 g溶解于100 mL蒸馏水中；10%三氯乙酸:三氯乙酸10 g溶于100 mL蒸馏水中；0.1%邻二氮菲:邻二氮菲0.1 g溶解于100 mL蒸馏水中；磷酸缓冲液P H=6.6:1M磷酸盐缓冲液配制；
0.1%三氯化铁:FeC13 0.1 g溶解于100 mL蒸馏水中。
[0039]2、确定最佳PH和温度后，发酵48 h, 10000 rpm/min离心10 min,重新分装,获的植物乳酸杆菌ATCC 8014芦荟发酵液，4 °C保存备用。
[0040]3、抗氧化指标的测定
A、DPPH自由基清除能力的测定
取2ml芦荟发酵液，加入2ml DPPH乙醇溶液，黑暗下室温反应30min，然后用等体积的三氯甲烷抽提，取上清517nm测0D，对照为去离子水加DPPH溶液。
[0041]B、羟基自由基清除能力的测定
取2 mmol/L的硫酸亚铁溶液I mL, 6 mmol/L过氧化氢I mL, 6 mmol/L水杨酸I mL,并加入芦荟发酵液I mL，静置30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm处测定吸光度，计算羟自由基的清除率。
[0042]C、3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖 a、标准曲线的制作:取8支15 mmX 180 mm试管,分别编号为O至7,向其中依次加入
0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、2.0 mL的I mg/mL的葡萄糖标准溶液,然后用蒸懼水定容到2 mL再依次加入1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度。
[0043]b、样品中还原糖含量的测定:以标准曲线制作中O号为对照，向15 mmX 180 mm试管中加入I mL样品溶液，I mL蒸馏水和1.5 mL水杨酸，水浴5 min，取出立即冷却到室温，加21.5 mL蒸馏水，摇匀，在540 nm处测定吸光度。
[0044]D、对Fe2+的螯合能力的测定
取0.5 mL芦荟发酵液中加入0.4%的FeS04溶液0.1 mL混合均匀后，再加入0.1 mL1%的抗坏血酸溶液和0.2 mol/L氢氧化钠溶液I mL，37°C下反应20 min，然后用10%的三氯乙酸去除蛋白6000 rpm, 10 min,4°C,取0.4 mL上清并加入4 mL 0.1%邻二氮菲，室温反应10 min，测定536 nm处吸光度。
[0045]E、总还原力的测定
取I mL的样品,加入I mL的磷酸缓冲液p H=6.6和1%铁氰化钾溶液I mL,混勻，在50°C下保温20 min,加入10 %的三氯乙酸溶液I mL，振荡混匀后取I mL的混合液，加入4 mL去离子水和0.1 %的三氯化铁溶液0.4 mL，静置10 min，用去离子水为空白，在700 nm下进行比色，吸光度的值越大，说明还原力越强。
[0046]实施例3:抑菌试验
实验材料:植物乳酸杆菌ATCC 8014、鼠伤寒、肠炎沙门、志贺301、福氏志贺、单增JΤ?Γ、金黄色葡萄球菌com/77、大肠0157、痤疮丙酸杆菌、库拉索芦荟、MRS培养基、LB培养基、SLB培养基、牛津杯。
[0047]实验步骤
一.活化植物乳酸杆菌ATCC 8014、鼠伤寒、肠炎沙门、志贺301、福氏志贺、单增J/tT、金黄色葡萄球菌ccwanl、大肠0157、痤疮丙酸杆菌，过夜培养。
[0048]二.将8株致病菌的菌体浓度调至18 CFU/mL左右，分别取100 μ L菌液涂布于LB平板。
[0049]三.待菌液吹干后，在平板中小心放入无菌的牛津杯；将发酵液上清10000 rpm/min离心10 min,向牛津杯中加入发酵液上清。
[0050]四.37°C培养6-8 h，每隔2?3 h观察。
[0051]五.测量平板中的抑菌圈直径，并照相。
[0052]为评价植物乳酸杆菌ATCC 8014能否在芦荟原汁中大量生长及评价其最适发酵温度和pH，我们对不同温度和pH芦荟原液中的嗜热链球菌ATCC 14485进行了计数，如图
1、2，结果表明，植物乳酸杆菌ATCC8014芦荟发酵液在发酵20 h后，当温度为37 °C，PH=7时，活菌计数结果细菌数量最多，基本达到18数量级。因此，我们将植物乳酸杆菌ATCC8014芦荟发酵液发酵最佳条件设定为37 °C，PH=7。
[0053]为确保我们制备的芦荟发酵液具有良好的抗氧化性，我们对常见的几个抗氧化性指标进行了评价。如图3、4结果表明，在37 °C, PH=7的条件下发酵48 h, 10000 rpm/min10离心后，发酵液澄清透亮。DPPH自由基清除能力实验中，清除率达到29.92%，说明植物乳酸杆菌ATCC 8014芦荟发酵液对自由基清除能力较弱；羟基自由基清除能力的测定实验，清除率为50.60%，说明植物乳酸杆菌ATCC 8014芦荟发酵液对羟基自由基清除能力较强J^Fe2+的螯合能力的测定中，螯合率为81.48%，说明植物乳酸杆菌ATCC 8014芦荟发酵液对铁离子的螯合能力较强；总还原力的测定实验，数值为0.164，说明植物乳酸杆菌ATCC8014芦荟发酵液具有一定还原力，但还原力较弱；在还原糖测定实验中，根据标准曲线计算得出还原糖含量为28.35 mg/mL。
[0054]同时，我评价芦荟发酵液对致病菌的拮抗能力，我们评价了芦荟发酵液对几种常见食源性致病菌的抑制效果。图5、图6结果表明，针对我们选用的八种致病菌:鼠伤寒、肠炎沙门、福氏志贺、大肠0157、单增ATCC、志贺301、金黄色葡萄球菌cowan 1、痤疮丙酸杆菌，通过抑菌实验我们发现植物乳酸杆菌ATCC 8014芦荟发酵液对志贺301、金黄色葡萄球菌cowanl、痤疮丙酸杆菌抑制效果最好；对鼠伤寒、福氏志贺、单曾ATCC效果次之；对肠炎沙门、大肠0157效果最差。
【权利要求】
1.一种植物乳酸杆菌ATCC 8014与芦荟共发酵饮料的制备方法，其特征是: (1)芦荟的选择和制备:采选新鲜、饱满、肉质肥厚的芦荟叶片，剔除带有病斑、软腐的叶片，叶片均重30(T400 g;叶片采用75%酒精进行表面消毒，去除芦荟叶表面皮层，采用榨汁机榨汁，分装后，6000 rpm/min离心10 min,再次分装,制成芦荟原汁； (2)采用巴氏消毒法将芦荟原汁灭菌，55°C处理30 min, 4 1:保存备用； (3)植物乳酸杆菌ATCC8014的活化 A从-80 1:冰箱取出植物乳酸杆菌ATCC 8014，按培养基体积的5%接种于5 mL MRS培养基中，于37 温培养箱中培养过夜； B取过夜培养的植物乳酸杆菌ATCC 8014，按培养基体积的5%接种5 mL培养基中，二次活化； (4)发酵条件的设定 A、设定发酵温度梯度分别为25°C、30 °C、37 °C、42 °C，在上述不同的发酵温度条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸杆菌ATCC8014接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20 h，得到不同温度条件下的芦荟发酵液； B、取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀进行活菌计数，确定最佳发酵温度; C、在最佳发酵温度的条件下，设定芦荟原汁PH梯度为3、4、5、6、7、8、9，在上述不同的PH条件下取5 mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，植物乳酸杆菌ATCC 8014接种量为芦荟原汁体积的5%，发酵20h，采用PH计调节PH ； D、取上述各芦荟发酵液，加生理盐水按11?16比例稀释，取50μ L涂板，过夜培养，进行活菌计数，确定最佳发酵PH ； (5)最佳条件发酵及发酵后处理:在步骤4确定最佳PH和最佳温度后，取5mL芦荟原汁，加入芦荟原汁体积的10%脱脂乳和2%葡萄糖，接种芦荟原汁5%的植物乳酸杆菌ATCC8014，发酵48 h，10000 rpm/min离心10 min,重新分装，获得植物乳酸杆菌ATCC 8014芦荟发酵液，4 °C保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种植物乳酸杆菌ATCC8014与芦荟共发酵饮料的制备方法，其特征是:所述芦荟为库拉索芦荟。
【文档编号】A23L2/38GK104382160SQ201410607551
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】辛洪波, 王鑫, 陈廷涛 申请人:南昌大学