专利名称：发酵乳酸杆菌的pcr快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵乳酸杆菌的PCR快速检测方法。
背景技术：
酸性罐头食品(pH 4.5以下)，在其中存活的微生物多为耐酸、抗热性极强的杆 菌、球菌等，它们的存在通常会引起罐头的腐败。由于酸性罐头食品提供的酸性环境，其中 通常是以喜欢酸性环境的乳酸菌为优势菌群，发酵乳酸杆菌(LactcAacillus fermentum) 是其中的一种。发酵乳酸杆菌目前常用的检测方法是厌氧平板培养法，待生长出菌落后用 肉眼观察挑选可疑菌落，然后进行革兰氏染色和生化鉴定。发酵乳酸杆菌营养要求复杂，培 养特性比较特殊，而且传统平板培养生长缓慢，分离培养鉴定周期约需7 9d，因此建立快 速检测和鉴定发酵乳酸杆菌的检验方法势在必行。PCR方法具有检测速度快、灵敏度高、成 本低的优点，已广泛应用于微生物的鉴定，然而，迄今国内还未见有利于PCR方法快速检测 发酵乳酸杆菌的报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的不足，提供一种检测速度快、成本低的快速 检测发酵乳酸杆菌的PCR方法。本发明的技术解决方案是一种快速检测发酵乳酸杆菌的方法，其特征在于有如 下步骤首先提取待测样品分离琼脂平板上可疑菌落纯培养的基因组DNA并稀释备用。然后进行PCR反应，每个PCR反应总体积为25 μ 1，包括提取的基因组DNA，2μ 1 ； 10XPCRBuffer, 2. 5 μ 1 ；Mg2+L 5mmol/L ；Tag 酶 Iu ；dNTP 0. lmmol/L ；发酵乳酸杆菌特异 性引物各10 pmol ；最后加ddH20至25μ 1 ；设置PCR仪的程序参数为95°C变性5min ； 950C 30s, 620C 30s，72°C 40s，该反应进行35个循环；72°C延伸5min，4°C保存。其中发酵乳 酸杆菌特异性引物为L. fermen-F :5，-TGATGGTCCTATGCCACAAA-3，；L. fermen-R 5’ -TCAACACCGGTAACAGTGGA-3 ’。最后进行电泳检测，PCR产物与10XPCR上样缓冲液混合，在加Gelred染色的 1. 5%琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记对照进行检测，如果在紫外灯下存在456bp的核 酸片段，则说明有发酵乳酸杆菌。本发明提供了一对扩增发酵乳酸杆菌的特异引物L. fermen-F, L. fermen-R,从而 提供一种快速检测发酵乳酸杆菌的方法，同现有技术相比具有如下优点1.检测速度快，直接利用分离琼脂平板上可疑菌落纯培养的基因组DNA进行检 测，省去了革兰氏染色和生化鉴定步骤，而生化鉴定一般需要M 72h。2.成本低，由于省略了革兰氏染色和生化鉴定步骤，节省了革兰氏染色和生化试 剂的费用，降低了检测成本。具体实施例方式首先无菌操作取25g待测样品，充分剪碎，加入盛有225ml灭菌生理盐水的灭菌容 器内，进行10倍系列稀释后，选择2个 3个适当稀释度，各以0. ImL涂布到MRS琼脂平板 上，36°C 士 1°C，兼性厌氧条件下培养48h。挑取3个或以上可疑菌落，接种于MRS琼脂平板 上进行纯培养，36°C 士 1 °C，兼性厌氧条件下培养48h，提取基因组DNA并稀释备用。然后进行PCR反应，每个PCR反应总体积为25 μ 1，包括提取的基因组DNA，2μ 1 ； 10 X PCRBuffer, 2. 5 μ 1 ；Mg2+L 5mmol/L ；Tag 酶 Iu ；dNTP 0. lmmol/L ；发酵乳酸杆菌特 异性引物各IOpmol ；最后加ddH20至25μ1 ；设置PCR仪的程序参数为:95°C变性5min; 95°C 30s, 62°C 30s, 72°C 40s，该反应进行35个循环；72°C延伸5min，4°C保存。其中发酵乳 酸杆菌特异性引物为L. fermen-F :5，-TGATGGTCCTATGCCACAAA-3，；L. fermen-R 5’ -TCAACACCGGTAACAGTGGA-3 ’。最后进行电泳检测，取9 μ 1 PCR产物与10XPCR上样缓冲液混合，在加入万分之 一的Gelred染色的1. 5%琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记(DL2000)对照进行检测，如 果在紫外灯下存在456bp的核酸片段，则说明有发酵乳酸杆菌。发酵乳酸杆菌PCR引物序列表<110>中粮屯河股份有限公司<120>发酵乳酸杆菌的PCR快速检测方法<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<222>(1). . . (20)<400>1TGATGGTCCTATGCCACAAA 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>prim_bimd<222>(1). . . (20)<400>2TCAACACCGGTAACAGTGGA 20
权利要求
1.一种快速检测发酵乳酸杆菌的PCR方法，其特征在于首先提取待测样品分离琼脂平 板上可疑菌落的基因组DNA并稀释备用；再利用发酵乳酸杆菌基因组保守性DNA序列设计 特异性引物；然后使用该引物对待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA进行PCR 扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，其中所述的发酵乳酸杆菌特异性引物为L. fermen-F :5’ -TGATGGTCCTATGCCACAAA-3’ ；L. fermen-R :5，-TCAACACCGGTAACAGTGGA-3，；用该引物时的退火温度为 62°C。
2.根据权利要求1所述的快速检测发酵乳酸杆菌的PCR方法，其加样参数为每个PCR 反应总体积为25 μ 1，包括待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA，2 μ 1 ； 10XPCR Buffer, 2. 5 μ 1 ；Mg2+L 5mmol/L ；Tag 酶 Iu ；dNTP 0. lmmol/L ；权利要求 1 中的特异性引物 各IOpmol ；最后加ddH20至25 μ 1 ；设置PCR仪的程序参数为95°C变性5min ；95 °C 30s, 62°C 30s, 72°C 40s，该反应进行；35个循环；72°C延伸5min，4°C保存。
全文摘要
一种快速检测发酵乳酸杆菌的PCR方法。首先提取待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA并稀释备用；再利用发酵乳酸杆菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物；然后使用该引物对待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。其加样参数为每个PCR反应总体积为25μl，包括待测样品分离琼脂平板上可疑菌落的基因组DNA，2μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP 0.1mmol/L；权利要求1中的特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；PCR反应程序为95℃变性5min；95℃30s，62℃30s，72℃40s，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。具有检测速度快、成本低的优点。
文档编号C12R1/225GK102041299SQ20091011347
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月9日 优先权日2009年10月9日
发明者丁生林, 刘云国, 宋佳, 徐榕蔓 申请人:中粮新疆屯河股份有限公司