专利名称：一种发酵乳酸杆菌及利用其制备d-塔格糖的方法
技术领域：
本发明属于发酵工程和酶工程技术领域，具体涉及一种发酵乳酸杆菌及利用其制备 D-塔格糖的方法。
背景技术：
D-塔格糖(D-tagatose)是一种较为罕见的天然六碳酮糖，甜度为蔗糖的92%，而产 生的热量只是蔗糖的1/3,具有改善肠道菌群、不致龋齿并对治愈II型糖尿病患者有辅 助效果等生理功效，是一种很好的低能量食品甜味剂和填充剂。此外，因其具强抗氧化 性和保护细胞效应，可作为有应用价值的药物中间体来显著抑制可卡因等对肝细胞的毒 害和促进母体及胚胎健康，D-Tag将被广泛的应用于美容、食品和医药行业。
塔格糖的发展始于上世纪90年代中期，其早期的生产工艺由美国生物技术公司 Spherix发明，2001年4月塔格糖正式被美国FDA批准为GRAS产品。同年7月联合 国粮农组织和世界卫生组织联合食品添加剂委员会(JECFA)推荐塔格糖为一种新的低 热量甜味剂，可以作为食品添加剂使用。1997年，丹麦MD食品公司获得美国Spherix 公司的许可，生产和销售用作食品添加剂的塔格糖。2000年MD公司与Aria食品集团 合并，组成了欧洲量大、世界第二大乳制品生产商，该公司生产干酪产生的大量乳清成 为塔格糖原料的重要来源。几年来塔格糖的生产进展缓慢，产品迟迟不能上市，曾引起 美国Spherix公司对MD公司的法律诉讼。直到2003年，Arla乳制品集团和德国食糖生 产商Nordzucker达成协议，在德国的汉诺威建立了塔格糖的生产厂，年产塔格糖1250 吨，并以Gaio商品名投放市场，2003年夏季产品正式上市。该产品最早在美国获准上 市，2003年10月欧洲委员会正式批准Gaio塔格糖投入欧盟市场，获准塔格糖上市销售 的还有澳大利亚、新西兰、韩国等国家。
目前国内还未有塔格糖的工业化报道，国外主要以乳糖水解液为原料，通过化学和 生物法异构而成。Beadle等以乳糖为原料化学合成D-塔格糖，但化学法为高消耗、高 污染，副产物多、不利于后续分离纯化、产率低。近年来D-塔格糖的研究集中在利用 L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)酶法转化D-半乳糖生成D-塔格糖，菌株包括五化/^r/d2/fl co//、 77zer附otog" wefl/ o/i/fl"fl (陆地热泉高温神袍菌)、Geo6ac///ws Weara^zenncip/H'/Ms (嗜热月旨 肪地芽抱杆菌)、Geo&ofcz'//M1s Aer附offem7r(^c""51 (高、温院'JS芽抱杆菌)、r/ienni^ (栖 热菌，、温泉里可蹄选)、7Tienwoa"aero6"cfer Anaf/waw//(嗜热杆菌)、77 er附otoga附"n."附a (海栖热袍菌)、J"c>^/okK77/w flcWocaW"r/w5 (酸热脂环酸芽孢杆菌)、Ba"7/wsWeara决enrn^/w7ws US100 (嗜热脂肪芽孢杆菌)等。其中乳酸菌为益生菌，生长适宜的 pH和底物乳糖水解液pH —致，操作方便，故引人关注,有一些专利申请，如Zfl"o^a7/t / /朋tan/w(CN1948500A，2007)、 L/ eW(we(US6057135，2000)，但是生成的产物在转化后期 会被进一步代谢，从而转化率较低。因此，若能筛选获得一株性能良好、酶活高的D-塔格糖产生菌，对开发自主产权的D-塔格糖产业化具有重大的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株高产L-阿拉伯糖异构酶的发酵乳酸杆菌。 本发明还要解决的技术问题是提供利用上述发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法。 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下
本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株发酵乳酸杆菌aacto^c/W^/er/neWM/w) NXTag-l，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC)，地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。登记入册的编号 是CGMCCNo.2921，保藏日期是2009年02月25日，以此菌作为生产菌株。
CGMCCNo.2921菌株具有下述性质
1、 菌落形态学特征
在MRS培养基上，37"C培养48h出现边缘乳白色小菌落(『0.8 lmm)，菌落呈圆形， 表面光滑，中央凸起，透明。适当延长培养，菌落增大，细胞的尺寸和形状变化很小。
2、 生理与生化特性
a. 培养温度30~40'C，最适温度为37'C;
b. 在pH 6.0~ 8.0范围内生长；
c. 不产生色素；
d. 耐NaCl浓度在5%浓度可以生长。
3、 16SrDNA序列分析
测得16S rDNA大部分序列1408 bp，如SEQ ID No: 1所示。将所测序列从 GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16SrDNA全序列为基础的系统发育树。结 果表明菌株NXTag-l与发酵乳酸杆菌达到100y。同源。所以认定本发明使用的是发酵 乳酸杆菌，具体为发酵乳酸杆菌NXTag-l(CGMCC No.2921)。
4、 营养特征
发酵乳酸杆菌NXTag-l的培养基中不需要添加生长因子，可以利用多种化合物作为 碳源，这些物质既可以单独使用，也可以适当的比例复配充当碳源，有机氮或无机氮都 可以作为氮源使用。培养基营养物质组分为碳源用量l 50g/L，氮源用量的2~30g/L，无机盐用量为培养塞的0.001~10 g/L，其余为水。碳源为葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖 和可溶性淀粉中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉 籽饼粉、尿素和(NH4)2S04中的一种或多种；无机盐为钾盐、镁盐、锰盐、钠盐、磷酸 盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种盐类。
利用上述发酵乳酸杆菌NXTag-l(CGMCCNo.2921)制备D-塔格糖的方法将保藏 号为CGMCCNo.2921的菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，在合 适生长的条件下进行培养，经离心、絮凝或微滤获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，进而 采用游离的或者经固定化的含L-阿拉伯糖异构酶的细胞转化D-半乳糖生成D-塔格糖。
产酶条件
将发酵乳酸杆菌NXTag-l (CGMCC No.2921)斜面活化二天后(斜面培养基成分 除含有碳源、氮源、无机盐等之外，还含有2%的琼脂)，接种于含碳源、氮源、无机盐 和水的无菌培养基中。
其中，所述培养基中碳源用量l~50g/L，氮源用量的2~30g/L，无机盐用量为培 养塞的0.001~10 g/L，其余为水。其中，所述培养基中，碳源为葡萄糖、乳糖、蔗糖、 麦芽糖和可溶性淀粉中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼 粉、棉籽饼粉、尿素和(NH4)2S04中的一种或多种；无机盐为钾盐、镁盐、锰盐、钠盐、 磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。
其中，所述的合适生长的条件是初始pH为6.0-8.0，培养温度为30 4(TC，培养 时间为8 20小时，细胞湿重达15~30g/L，发酵液酶活达1 10U/mL。
其中，若采用离心方法获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，则离心条件为室温条件 下，5000 10000 r/min， 10 30min;若采用微滤的方法获得含L-阿拉伯糖异构酶细胞， 所用的微滤膜孔径为0.1 0.45nm，操作压力0.01 3.0MPa。
L-阿拉伯糖异构酶酶活测定用0.2M的磷酸钾缓冲液(pH7.0)配制含0.5MD-半 乳糖(内含0.01mMMnCl2)加入细胞破碎离心后上清液，该混合物于60"C的水浴内反 应60min后，置于IOO'C的沸水中2min以终止酶反应，然后用自来水冷却至室温。反 应混合物适当稀释后经过离心和过滤后用HPLC法测定D-塔格糖生成量。 一个单位的 L-阿拉伯糖异构酶酶活定义为在6(TC下，pH为7.0的条件下每分钟生成l昭的D-塔格 糖的酶量。
酶法转化
采用游离的或者经固定化的含L-阿拉伯糖异构酶的细胞转化D-半乳糖生成D-塔格 糖是将游离细胞或者固定化后的细胞填充至反应容器中，加入1 100g/L的D-半乳糖 (含0.01mMMn2。溶液进行酶转化反应，反应温度40 70'C，转化时间8 15h;或者，将固定化细胞装入填充床式柱反应器中，该反应器以0.5 5mL/min的流速单向流加或 循环连续流加1 100g/L的D-半乳糖(含0.01mMMn2。溶液，进行酶转化反应，反应 温度40~70°C ，每批转化时间8~15h。
上述固定化方法为配制1 5% (即1 5g/100mL)浓度的海藻酸钠，加入经10 25%的戊二醛处理后的细胞10 30% (即每100mL海藻酸钠溶^^中加入10 30克的细 胞)，再用浓度为1 4W的CaCl2溶液(g/100mL)将包埋材料海藻酸钠固定成型，以此作 为酶源进行反应。除了海藻酸钠作为固定化载体包埋外，还可以卡拉胶、明胶或果胶铐 等载体包埋细胞。
有益效果本发明筛选得到一种能够高效转化D-半乳糖生成D-塔格糖的菌株，该 菌是益生菌，能利用多种碳源和氮源发酵生产D-塔格糖，且发酵周期短，转化时间少， 操作方便简单，D-塔格糖对底物的转化率可达50%，转化液中D-塔格糖浓度可达45g/L， 且无副产物形成，另外随着反应进行也不会将产物D-塔格糖转化为其他成分。此外用 固定化含L-阿拉伯糖异构酶的细胞转化可以反应20批次以上，平均转化率在50%以上， 适用于工业化生产。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明，但对本发明没有限制。 实施例1:
斜面培养基葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L， CaCO310g/L，琼脂20 g/L， pH6.2~6.4。
种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙 酸钠5g/L， K2HP042g/L， MgS04 0.58 g/L， MnS04 0.25 g/L， pH6.2~6.4。
发酵培养基葡萄糖20g/L， L-阿拉伯糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，乙酸 钠10g/L， K3P04 0.2 g/L， NaCl 0.01 g/L， MgS04 0.2 g/L ， MnS04 0.1 g/L， CaCO310g/L， pH6.8~7.0， 12rC灭菌15分钟。
将保藏号为CGMCCNo.2921的发酵乳酸杆菌(Za"o6ac///i /mMeWM/n) NXTag-l 接两环于种子培养基中，37'C培养15h得种子液，将种子液按发酵液体积3%的接种量 接入冷却后发酵培养基中，37。C好气培养14h，得到发酵液中菌体含量为16g/L，酶活 达2.45U/mL，离心获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，称取10g的湿菌体加入50mL 90g/L 的D-半乳糖(含O.OlmM Mn2+)溶液，6(TC转化13 h，终止反应，检测生成D-塔格糖 45g/L，转化率达50%。实施例2:
培养基配方同实施例1，将种子液按发酵液体积3%的接种量接入发酵培养基发酵 液(厌氧装置)中，37'C静置培养14h，得到发酵液中菌体含量为10g/L，酶活达1.45U/mL， 经微滤获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，加入50mL 90g/L的D-半乳糖(含O.OlmM Mn2+)溶液，60'C转化13h，检测转化液中D-塔格糖30.34 g/L，转化率为37.9%。
实施例3:
以15g/LD-葡萄糖为碳源，5g/LL-阿拉伯糖为诱导物，10g/L蛋白胨和5g/L酵母膏 为氮源，培养基配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积3%的接种量接入 发酵培养基中，37'C好气培养14h，得到发酵液中菌体含量为20g/L，酶活达3.56U/mL， 超滤获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞加入lg/L的D-半乳糖(含O.OlmM Mn2+)溶液， 60'C转化15h，检测转化液中D-塔格糖浓度为5.6g/L，转化率56%。
实施例4:
以20g/L乳糖为碳源，10g/L蛋白胨为氮源，培养基配方与培养方法同实施例1，将 种子液按发酵液体积3%的接种量接入发酵培养基中，37'C好气培养3 4h,加入诱导剂 10g/LL-阿拉伯糖，继续培养12h，得到发酵液中菌体含量为22g/L，酶活达3.12U/mL， 离心获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞5g，加入10mL 100g/L的D-半乳糖(含O.OlmM Mr^+)溶液，6(TC转化13h和24h，检测转化液中D-塔格糖浓度为51.34 g/L和50.12g/L。
实施例5:
以20g/L麦牙糊精为碳源，15g/L豆粕粉为氮源，培养基配方与培养方法同实施例l， 配制4%的海藻酸钠胶体溶液，与生理盐水调制的菌悬液混合均匀后，加入25%戊二醛 处理10min,用注射器滴入1%的CaCl2溶液中固化，制成直径约为3 4mm的球状固定 化细胞，于4'C冰箱中静置数小时。然后用pH7.0 0.2M磷酸钾缓冲溶液洗涤2次后，将 5g湿细胞以海藻酸钠包埋得到10g固定化细胞(5g湿细胞/25mL4y。的海藻酸钠溶液) 加入50mL100g/L的D-半乳糖(含O.OlmM Mn2+)溶液，6(TC条件下在摇瓶中转化，每 批转化时间13h，反应结束后，固定化颗粒取出，重复上述反应，转化20批次。D-塔 格糖平均转化率均在50%以上。
实施例6:
以20g/L可溶性淀粉为碳源，15g/L玉米浆为氮源，培养基配方与培养方法同实施例1，称取50 g湿菌体，加50mLpH7.5 50mM的Tris/HCl缓冲液中，混悬液中加入0.5% (v/v) TritonX-lOO，在55 。C水浴保温15min;称取10g卡拉胶，加无菌水200mL，充 分浸泡，加热溶解。将两者迅速混合，铺平板，于4'C冰箱放置静置数小时，凝固后切 成2*2*2 (mm3)左右大小的颗粒，再于1.5mol/LKC1溶液中浸泡lh，使其充分凝固。 滤出颗粒分别用去离子水和50mLpH7.5 50mM的Tris/HCl缓冲液洗涤，4'C保存备用。 所得菌体形成固定化细胞200g，装入cp4x45cm的填充床式柱反应器中，(三根串联的夹 套式固定化柱)，固定化细胞的装柱量为70%(v/v)，以lmL/min的流速单向流加100g/L 的D-半乳糖(含0.01mMMn")溶液，60。C的条件下进行酶转化，13h为一个批次。该 装置连续运行7天，生产率4,2g/(L，h)，转化D-半乳糖溶液12L，得到D-塔格糖的平均 转化率为53.25%。SEQUENCE LISTING
〈110〉南京工业大学
〈120〉 一种发酵乳酸杆菌及利用其制备D-塔格糖的方法 〈130〉 njut090222 〈160〉 1
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1 〈211〉 1408 〈212〉 DNA
〈213〉 发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum) 〈400〉 1
tcctaaaagg ttaccccacc gactttgggt gttacaaact ctcatggtgt gacgggcggt 60
gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc 120
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ccccgcttct gggcaggtta cctacgtgtt actcacccgt ccgccactcg ttggcgacca 1380
aaatcaatca ggtgcaagca ccatcaat 1408
权利要求
1、一种发酵乳酸杆菌，其分类命名为发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.2921。
2、 利用权利要求1所述的发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，其特征在于将保藏 号为CGMCCNo.2921的菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，在合 适生长的条件下进行培养，经离心、絮凝或微滤获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，进而 采用游离的或者经固定化的含L-阿拉伯糖异构酶的细胞转化D-半乳糖生成D-塔格糖。
3、 根据权利要求2所述的利用发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，其特征在于所 述培养基中，培养基营养物质组分为碳源用量l~50g/L,氮源用量的2~30g/L，无机 盐用量为培养基的0.001 10g/L，其余为水。
4、 根据权利要求2或3所述的利用发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，其特征在 于所述培养基中，碳源为葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素和(NH4)2S04中的一种或多种；无机盐为钾盐、镇盐、锰盐、钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一 种或多种。
5、 根据权利要求2所述的利用发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，其特征在于所 述的合适生长的条件是初始pH为6.0 8.0，培养温度为30~40°C，培养时间为8~20 小时。
6、 根据权利要求2所述的利用发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，其特征在于采 用离心、絮凝或微滤的方法获得含L-阿拉伯糖异构酶细胞，所用的微滤膜孔径为 0.1~0.45pm，操作压力0.01~3.0MPa。
7、 根据权利要求2所述的利用发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，其特征在于采 用游离的或者经固定化的含L-阿拉伯糖异构酶的细胞转化D-半乳糖生成D-塔格糖是将 游离细胞或者固定化后的细胞填充至反应容器中，加入l 100g/L的D-半乳糖溶液进行 酶转化反应，反应温度4(K7(TC，转化时间8 15h;或者，将固定化细胞装入填充床式 柱反应器中，该反应器以0.5 5mL/min的流速单向流加或循环连续流加1 100g/L的 D-半乳糖溶液，进行酶转化反应，反应温度40 70'C，每批转化时间8 15h。
8、 根据权利要求7所述的利用发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，其特征在于固 定化细胞是采用海藻酸钙、卡拉胶、明胶或果胶钙作为固定化载体。
全文摘要
本发明公开了一种发酵乳酸杆菌，其分类命名为发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.2921。本发明还公开了利用上述发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，即将上述菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，经培养获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，进而采用游离的或者经固定化的细胞转化D-半乳糖生成D-塔格糖。本发明筛选得到的发酵乳酸杆菌能够高效转化D-半乳糖生成D-塔格糖，转化液中D-塔格糖浓度可达45g/L，D-塔格糖对底物的转化率可达50％以上，且无副产物形成。
文档编号C12P19/00GK101531975SQ20091002598
公开日2009年9月16日 申请日期2009年3月16日 优先权日2009年3月16日
发明者虹 徐, 莎 李, 欧阳平凯, 汪芙蓉 申请人:南京工业大学