专利名称：一种乳酸杆菌及其发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种乳酸杆菌及其发酵方法，属于生物技术领域。
背景技术：
抗生素在饲料中的应用创造了养殖业和饲料工业的革命，规模养殖在全世界得到了迅速发展，畜禽饲料中添加抗生素对于提高畜禽抗病力、改善生产性能有良好的效果，但饲料中抗生素的长期使用、滥用存在着严重的负面效应。主要表现为病原菌耐药性的产生及畜产品中抗生素的残留。病原菌耐药性的产生对人类及畜禽疾病治疗与防控带来极大困难，而畜产品中抗生素的残留通过食物链进入人体后对人的健康产生严重危害。许多国家都制定了相应的法规来限制使用或取消饲用抗生素。在抗生素的替代品研究中，新的绿色饲料添加剂的应用是一种必然趋势，益生素则是新一代产品的典型代表，它们在动物体内主要是通过调节肠道微生态平衡、抑制肠道内的病原微生物、帮助动物建立有利于宿主的微生态区系、提高机体免疫机能、改善饲料利用效率等，达到促进动物生长、预防疾病的作用。由于微生态制剂安全无毒、无残留、不产生抗药性，克服了抗生素使用存在的弊端，因此，它的研究及应用受到了极大的关注。随着人们对食品安全的重视和健康的关注，微生态制剂的研究及应用将会越来越为深入、广泛。乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸细菌的总称。目前已发现的这类菌在在细菌分类学上至少包括18个属，其中，乳酸杆菌属和双歧杆菌属是动物肠道中的优势菌群，这些菌属的益生素制剂应用历史更早，制剂种类更多，其中包括乳酸菌发酵饲料、乳酸菌粉及乳酸菌提取物。能够作为饲料添加剂的乳酸杆菌有嗜酸乳酸杆菌、乳酪乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌和植物乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌、短小乳酸杆菌等。双歧杆菌是许多益生素产品标签中注明含有的一种益生菌株。由于双歧杆菌是人体和动物肠道中的优势菌， 其数量常作为肠道微生态平衡的一个重要指标，益生素产品中经常使用的双岐杆菌菌株有婴儿双岐杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌等。尽管乳酸菌可以提高动物的免疫力和生产性能，但是由于乳酸菌抗逆性较差，阻碍了这类细菌在生产实践中的应用，例如对温度敏感，氧气对其杀伤力很强等。尽管随着机械加工工艺的不断发展，利用造粒，包被及低温干燥技术已经使乳酸杆菌在饲料工业上的应用已成为可能，但是从菌种出发解决乳酸菌制剂的抗逆性问题，是生产这类微生态制剂的根本方法。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种乳酸杆菌，该乳酸杆菌能够耐受较高的温度和空气中的氧气，同时具有耐胃酸和胆盐，并产生乳酸，可以对大肠杆菌的生长和繁殖产生抑制作用。本发明的第二个目的是提供一种含有上述乳酸杆菌的发酵方法。本发明的第三个目的是提供一种含有上述乳酸杆菌微生态制剂，该制剂对调节动物肠胃微生物群落，维持肠道菌群平衡，提高生产性能等方面具有良好的促进作用。为实现本发明的第一个目的提供一种乳酸杆菌，该乳酸菌2010年1月27日保臧在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的乳酸杆菌Lactobacillus sp.，保藏中心登记入册编号CGMCC No. 3614。所述的乳酸杆菌(LactcAacillus sp. )CGMCC No. 3614，是一种分离于仔猪粪便，为革兰氏阳性、厌氧杆菌，其DNA中G+C含量37m0l%，形态成细长杆状、两端圆、为 0. 6 μ mX 1. 5 μ m，以单个、成双或成链出现，不运动，无鞭毛，无芽孢，菌落粗糙，培养基中加入吐温80，则菌落光滑；深层菌落呈分枝的不规则形状，无色素；发酵碳水化合物产生大量乳酸；过氧化氢酶阴性，不产生细胞色素，不液化明胶，不分解酪蛋白，不产生吲哚和硫化 Μ,ο本发明提供的乳酸杆菌(LactcAacillus sp. )CGMCC No. 3614除具有上述生物学特征之外，还具有耐高温和耐氧能力强，同时具有耐胃酸和胆盐，并抑制大肠杆菌生长等性能稳定的菌种1)该乳酸杆菌在温度80摄氏度的环境中，在2分钟以内存活率达到95%以上。一般地，乳酸杆菌在65-75摄氏度会死亡，而本发明的乳酸杆菌在这种温度下，存活率很高。2)该乳酸杆菌在非厌氧条件下可以正常生长和繁殖，有氧和厌氧条件下，菌体发酵密度相同。由于乳酸菌是厌氧菌或兼性厌氧菌，氧对细菌有强杀伤力，因此，大多数乳酸菌必须在厌氧条件下才能生长繁殖。3)该乳酸杆菌在PH= 2的环境中，在3小时以内存活率达到93%以上。一般地， 动物胃液的PH在2 5，这种酸性环境条件对微生物的致死率有很强的杀伤作用，而本发明的乳酸杆菌在这种酸性条件下，存活率很高。4)该乳酸杆菌在猪胆盐含量为0. 5%的环境中，处理3小时，存活率在97%以上。 胆盐具有杀菌和抑菌作用，在食糜中的含量一般在0. 2-0. 6%左右，因此，本发明的菌种可以耐受胆盐。5)大肠杆菌和沙门氏菌菌是导致动物发生消化道疾病的主要微生物，所以抑制大肠杆菌和沙门氏菌菌的生长可以控制消化道疾病的发生，本发明所述的菌种可以对大肠杆菌和沙门氏菌菌的生长和繁殖产生抑制作用，其抑菌半径分别为1. 3厘米和1. 5厘米左右。本发明的第二个目的是提供一种含有上述乳酸杆菌的发酵方法。所述的乳酸杆菌发酵方法包括如下步骤1)种子培养物制备乳酸杆菌(LactcAacillus sp. ) CGMCC No. 3614保存于种子培养基，并利用该培养基进行接种。所述的种子培养基配方为蛋白胨，IOg;牛肉浸膏，IOg;酵母浸粉，5g;磷酸氢二钾，2g ；枸椽酸二铵，2g ；葡萄糖，20g ；醋酸钠，5g ；吐温80，Ig ；蒸馏水，1000ml，用冰醋酸调节pH至5. 4。将乳酸杆菌接种于种子培养基于厌氧管进行培养，得到的种子培养物。所述的培养过程为微生物培养、发酵常用的方法。其优选，所述的培养是在温度为35 38°C的条件下，培养10_30小时。其优选，乳酸杆菌接种于厌氧管，在温度为37°C恒温箱中培养M小时，作为种子培养物。2)摇瓶培养物制备所述的摇瓶培养基配方为奶粉，2g ；蛋白胨，Ig ；牛肉膏，0. 5g ；乳糖，1. 5g ；酵母膏，0. 5g ；蒸馏水，1000ml，用冰醋酸调节pH至5. 4。将厌氧管中的种子培养物，接种于摇瓶培养基中，接种比例为1. 0-20%。所述的接种方法为微生物培养、发酵常用的方法。所述的培养过程为微生物培养、发酵常用的方法。其优选，所述的培养是在温度为35 38°C的条件下，培养10-30小时。其优选，乳酸杆菌接种于摇瓶，接种比例为10%，在温度为37°C恒温箱中培养12 小时，作为摇瓶培养物。3)发酵罐培养物的制备所述的发酵培养基配方为奶粉，0.2% ；蛋白胨，0. ；牛肉膏，0.05% ；蔗糖， 0. 15% ；酵母膏，0. 05%，用冰醋酸调节pH至5. 4。将摇瓶中的培养物，接种于发酵罐培养基中，接种比例为1. 0-20%。所述的接种方法为微生物培养、发酵常用的方法。所述的培养过程为微生物培养、发酵常用的方法。其优选，所述的培养是在温度为35 37°C的条件下，培养10_30小时。其优选，乳酸杆菌接种于发酵罐，接种比例为10%，在温度为37°C发酵罐中培养 20小时，作为大罐培养物。保藏说明菌株酸杆菌 Lactobacillus sp.保藏日期2010年1月27日保藏单位中国微生物菌种保减管理委员会普通微生物中心保藏编号CGMCCNo. 361具体实施方式
下面结合实施例详细介绍本发明，所述的实施例用来理解而并非限制本发明。实施例1本实施例为保藏号为CGMCC No. 3614的乳酸杆菌的筛选过程，具体步骤如下(1)、菌种的初筛利用Rogosa SL完全选择性培养基对仔猪胃粘膜不同位置的微生物进行选择行筛选，以获得乳酸杆菌。其中Rogosa SL完全选择性培养基配方为现有技术，具体为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸椽酸铵2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0. 58g，四水硫酸锰0. 25g，硫酸亚铁0. 03g，吐温80 lg，琼脂13g，蒸馏水IOOOmL,用醋酸调节PH至5.0。(2)、乳酸杆菌的耐胃酸复筛 利用Rogosa SL培养基对初筛出的乳酸杆菌进行厌氧发酵，用醋酸调节PH为2，发酵3小时，进行复筛；
(3)、乳酸杆菌的耐胆盐复筛利用Rogosa SL培养基对初筛出的乳酸杆菌进行厌氧发酵，猪胆盐浓度为0. 5%, 发酵3小时，进行复筛；(4)、乳酸杆菌的耐温特性复筛利用Rogosa SL培养基对初筛出的乳酸杆菌进行厌氧发酵，用醋酸调节pH为2，发酵12小时，然后放入80摄氏度恒温箱中，观察微生物的耐受情况，进行耐温复筛；(5)、乳酸杆菌的耐氧特性复筛利用Rogosa SL培养基对初筛出的乳酸杆菌进行发酵，用醋酸调节pH为2，在非厌氧条件下，发酵12小时，然后观察微生物的生长情况，进行耐氧复筛；(6)、乳酸杆菌的的抑菌特性利用麦康凯培养基对致病性大肠杆菌抑制性能的筛选，对治病性大肠杆菌和沙门氏菌抑制性能的筛选的标准为乳酸杆菌对致病性大肠杆菌的抑菌直径要达到1. 2cm左右， 对沙门氏菌的抑菌直径要达到1. 3cm左右。经过筛选，得到一株乳酸杆菌Lactobacillus sp.，2010年1月27日保藏于 《中国微生物菌种保臧管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCC No. 3614。该菌特性为为革兰氏阳性、厌氧杆菌，其DNA中G+C含量37m0l%，形态成细长杆状、两端圆、为 0. 6 μ mX 1. 5 μ m，以单个、成双或成链出现，不运动，无鞭毛，无芽孢，菌落粗糙，培养基中加入吐温80，则菌落光滑；深层菌落呈分枝的不规则形状，无色素；发酵碳水化合物产生大量乳酸；过氧化氢酶阴性，不产生细胞色素，不液化明胶，不分解酪蛋白，不产生吲哚和硫化 Μ,ο实施例2将实施例1得到的乳酸杆菌(LactcAacillus sp.)保藏号CGMCC No. 3614接种于厌氧管中，所用种子培养基配方为蛋白胨，IOg;牛肉浸膏，IOg;酵母浸粉，5g;磷酸氢二钾，2g ；枸椽酸二铵，2g ；葡萄糖，20g ；醋酸钠，5g ；吐温80，Ig ；蒸馏水，IOOOmL,用冰醋酸调节PH至5. 4。在恒温箱中温度为37°C的温度下培养M小时，得到种子培养物。该培养物可以冷冻保存，也可以直接接种。实施例3将实施例2得到的种子培养物接种于摇瓶培养基中，所用摇瓶培养基配方为奶粉，2g ；蛋白胨，Ig ；牛肉膏，0. 5g ；乳糖，1. 5g ；酵母膏，0. 5g ；蒸馏水，lOOOmL，用冰醋酸调节 PH至5. 4。接种比例为10%，在温度为37°C恒温箱中培养12小时，作为摇瓶培养物。实验例4将实施例3得到的摇瓶培养物接种于发酵罐培养基中，所用发酵罐培养基配方为奶粉，0. 2% ；蛋白胨，0. 1% ；牛肉膏，0. 05% ；蔗糖，0. 15% ；酵母膏，0. 05%，用冰醋酸调节？!1至5.4。接种于发酵罐，接种比例为10%，在温度为37°C恒温箱中培养20小时，作为大罐培养物。发酵结束时大罐培养物的菌体密度每毫升可达6. 2X 101°以上个活菌。该培养物干燥后可作为微生态制剂使用。
权利要求
1.一种乳酸杆菌，其特征在于，该乳酸杆菌为于2010年1月27日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的乳酸杆菌Lactobacillus sp.，保藏中心登记入册编号CGMCC No. 3614。
2.根据权利要求1所述的乳酸杆菌，其特征在于，所述的乳酸杆菌的生物学特性如下1)是一种分离于仔猪粪便，为革兰氏阳性、厌氧杆菌，其DNA中G+C含量37mol%，形态成细长杆状、两端圆、为0. 6 μ mX 1. 5 μ m，以单个、成双或成链出现，不运动，无鞭毛，无芽孢，菌落粗糙，培养基中加入吐温80，则菌落光滑；深层菌落呈分枝的不规则形状，无色素； 发酵碳水化合物产生大量乳酸；过氧化氢酶阴性，不产生细胞色素，不液化明胶，不分解酪蛋白，不产生吲哚和硫化氢；2)在温度80摄氏度的环境中，在2分钟以内存活率达到95%以上；3)在非厌氧条件下可以正常生长和繁殖，有氧和厌氧条件下，菌体发酵密度相同；4)在pH= 2的环境中，在3小时以内存活率达到93%以上；5)在猪胆盐含量为0.5%的环境中，处理3小时，存活率在97%以上；6)对大肠杆菌和沙门氏菌菌的生长和繁殖产生抑制作用，其抑菌半径分别为1.3厘米和1. 5厘米左右。
3.权利要求2所述的乳酸杆菌采用以下步骤得到1)对仔猪粪便粘膜不同位置的微生物进行选择行筛选；幻耐胃酸复筛；幻耐胆盐复筛；4)耐温特性复力)耐氧特性复筛；6) 抑菌特性复筛。
4.一种含有权利要求1或2所述乳酸杆菌的发酵方法，其特征在于分为以下步骤1)乳酸杆菌在种子培养基中经过充分培养、发酵后得到种子培养物；2)制成摇瓶培养物；3)制成发酵罐培养物。
5.根据权利要求4所述的摇瓶培养物，其特征在于，所述的培养、发酵过程得到的摇瓶培养物再接种于发酵生产培养基培养获得终培养物，该培养物干燥后可作为微生态制剂使用。
全文摘要
本发明提供了一种乳酸杆菌及其发酵方法，属于生物技术领域。所述的乳酸杆菌为于2010年1月27日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的乳酸杆菌Lactobacillus sp.，保臧中心登记入册编号CGMCC No.3614，是一种分离于仔猪粪便，该菌种突出特性为耐高温和耐氧能力较高，同时具有耐胃酸和胆盐，产生乳酸并抑制大肠杆菌生长等性能稳定的菌种，该菌种经过奶粉肉汤培养基发酵后每毫升菌种数可达到6.2×1010以上个活菌。
文档编号C12R1/225GK102399728SQ20111039472
公开日2012年4月4日 申请日期2011年12月2日 优先权日2011年12月2日
发明者吴连福, 江生, 胥学新, 边桂萍 申请人:北京中科景明生物技术有限公司