一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺ⅰ型军团菌的三重pcr检测方法
【专利摘要】本发明一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺Ⅰ型军团菌的三重PCR检测方法，是一种军团菌属多重PCR检测方法，属于微生物分子检测领域。本发明利用分别针对军团菌属、嗜肺军团菌种和嗜肺军团菌Ⅰ型的16SrRNA、danJ和ORF9基因的引物，对dNTPs和引物浓度比例以及退火温度进行优化，建立快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺Ⅰ型军团菌的三重PCR方法。本发明方法简便、快捷、成本低、结果准确可靠，可以对分离培养到的可疑军团菌菌株进行快速有效的判定。
【专利说明】—种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR检测方法
【技术领域】
[0001]一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR检测方法，是一种军团菌属多重PCR检测方法，属于微生物分子检测领域。
【背景技术】
[0002]90%以上的军团菌病是由嗜肺军团菌(Leg1nella Pneumophila, LP)引起,其中85%为LPl型军团菌肺炎，所以嗜肺军团菌和LPl型嗜肺军团菌是我们监测的重点。依据WS394-2012《公共场所集中空调通风系统卫生规范》，所有公共场所集中空调通风系统冷却塔水和冷凝水中不得检出嗜肺军团菌，该规范的标准检测方法为培养法。然而，传统的培养法在对分离到的可疑军团菌菌落进行判定时存在盲区，生化检测的不确定性和血清学检测的多交叉反应性，导致一些可疑军团菌菌落不能被最终判别。本发明可以弥补生化和血清学鉴定检测的不足，快速准确的对分离培养到的可疑军团菌菌落进行判定，且简单、方便、成本低。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于快速准确的对分离培养到的可疑军团菌菌落进行判定，以克服传统培养法中生化和血清学鉴定检测的缺点。
[0004]本发明的技术方案:一种快速区分非嗜肺(非LP)、嗜肺(LP)与嗜肺I型(LPl)军团菌的三重PCR检测方法，步骤为:
1、制备PCR模板，挑取待检测可疑单个菌落于0.5mL灭菌无核酸酶的去离子水中，制备成菌悬液，100°C煮沸15min，冷却后备用。
[0005]2、引物序列:
16S rRNA 基因:上游引物 5’ -AAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’，下游引物 5’ -GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3’，预期扩增片段长度为654 bp ；
dan J 基因:上游引物 5 ’ -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G_3 ’，下游引物 5 ’ -TGAATTCTGACTTGCCCCAT G-3’，预期扩增片段长度为285 bp ；
0RF9 基因:上游引物 5 ’ -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ’，下游引物 5 ’ -GTAATTCCCAGCCATTTACC AGATC-3’，预期扩增片段长度为561 bp ；
3、PCR反应体系:1.6uL dNTP、三种上、下游引物(使用浓度均为2μΜ)均各2yL，模板DNA2yL、、rTaq酶0.08 μ LUOXbuffer缓冲液2 μ L，无核酸酶的去离子水补足至20μ L ；
4、扩增条件:95°C预变性 5 min ；95 V 30 S，52 V 30 S，72 V 40 s 进行 30 个循环；72 1:终末延伸5 min ；
5、凝胶电泳:在1.5%琼脂糖凝胶，0.5XTBE缓冲液中电泳，电泳后凝胶成像获取结果； 6、判定方法:获得3条目的条带为LPl，两条目的条带为LP，I条目的条带为非LP，O条目的条带为非军团菌。
[0006]本发明的有益效果:本方法简便、快捷、成本低、结果准确可靠，可以对分离培养到的可疑军团菌菌株进行快速有效的判定，快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1是29株军团菌PCR产物电泳图谱。M:100bp DNA marker (最亮的条带为500bp，向上、向下每条带依次增、减100 bp) ;1、18为阴性对照,2为非嗜肺军团菌Z.Jordanis(ATCC33623)，3 为 LP6 (ATCC33216)，4 为 LPl (ATCC33152), 5?17、19?34 为分离到的 29 株军团菌。
[0008]具体实例方式
实施例1 一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR检测方法，步骤为、
1、制备PCR模板，挑取待检测可疑单个菌落于0.5mL灭菌无核酸酶的去离子水中，制备成菌悬液，100°C煮沸15min，冷却后备用。
[0009]2、引物序列:
16S rRNA 基因:上游引物 5’ -AAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’，下游引物 5’ -GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3’，预期扩增片段长度为654 bp ；
dan J 基因:上游引物 5 ’ -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G-3 ’，下游引物 5 ’ -TGAATTCTGACTTGCCCCAT G-3’，预期扩增片段长度为285 bp ；
0RF9 基因:上游引物 5 ’ -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ’，下游引物 5 ’ -GTAATTCCCAGCCATTTACC AGATC-3’，预期扩增片段长度为561 bp。
[0010]3、PCR反应体系:1.6 yL dNTP、三种上、下游引物(使用浓度均为2μΜ)均各
2μ L，模板DNA 2 μ L、rTaq酶0.08 μ LUOXbuffer缓冲液2 μ L，无核酸酶的去离子水补足至20 μ L0
[0011]4、扩增条件:95°C预变性 5 min ；95°C 30 s，52V 30 s，72°C 40 s 进行 30 个循环；72°C终末延伸5 min。
[0012]5、凝胶电泳:在1.5%琼脂糖凝胶、0.5XTBE缓冲液中电泳，电泳后凝胶成像获取结果。
[0013]6、结果判定:获得3条目的条带为LPl，两条目的条带为LP，I条目的条带为非LP，O条目的条带为非军团菌。
【权利要求】
1.一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR检测方法，其特征在于步骤为: (1)制备PCR模板，挑取待检测可疑单个菌落于0.5mL灭菌无核酸酶的去离子水中，制备成菌悬液，100°C煮沸15min，冷却后备用； (2)引物序列: 16S rRNA 基因:上游引物 5’ -AAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’，下游引物 5’ -GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3’，预期扩增片段长度为654 bp ； dan J 基因:上游引物 5 ’ -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G_3 ’，下游引物 5 ’ -TGAATTCTGACTTGCCCCAT G-3’，预期扩增片段长度为285 bp ； 0RF9 基因:上游引物 5 ’ -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ’，下游引物 5 ’ -GTAATTCCCAGCCATTTACC AGATC-3’，预期扩增片段长度为561 bp ； (3)PCR反应体系:1.6μ L dNTP、浓度均为2 μ M的三种上、下游引物均各2 μ L，模板DNA.2 μ L、rTaq酶0.08 μ L、10 X buffer缓冲液2 μ L，无核酸酶的去离子水补足至20 μ L ； (4)扩增条件:95°C预变性5 min ；95°C 30 s，52°C 30 s，72°C 40 s 进行 30 个循环；.72 °C终末延伸5 min ；(5)凝胶电泳:在1.5%琼脂糖凝胶、0.5XTBE缓冲液中电泳，电泳后凝胶成像获取结果; (6)判定方法:获得3条目的条带为LP1，两条目的条带为LP，I条目的条带为非LP，O条目的条带为非军团菌。
【文档编号】C12Q1/04GK104313169SQ201410607389
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】张琦, 周伟杰, 范晓东, 严洁, 沈波 申请人:无锡市疾病预防控制中心, 无锡市人民医院