一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4及其基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4及其基因和应用。本发明提供了一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，以及编码上述木聚糖酶的基因组编码基因 xynSL4 ，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株。该木聚糖酶XynSL4最适pH7.0,在pH9.0和11.0的时候分别剩余95%和60%的酶活。该酶最适反应温度70℃，在0.25–3.0MNaCl存在的情况下剩余55%以上的酶活，且在3M和4MNaCl的浓度下非常稳定。本发明的木聚糖酶具有高温碱性耐盐的特点，可应用于造纸、生物能源以及食品等工业领域。
【专利说明】-种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4及其基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温碱性耐盐木聚糖酶 XynSL4及其基因和应用。
【背景技术】
[0002] 木聚糖是半纤维素的主要组成成分，是排在纤维素之后的第二丰富的碳水化合 物，约占地球上可再利用有机碳的H分之一。木聚糖的降解需要多种酶的协同作用，包括， 包括内切-1,4-目-D-木聚糖酶（endo-1,4-目-D-X}danase)、a-L-阿拉伯巧喃糖巧酶 (a-L-ar油inofuranosidase)、a-D-葡糖酵酸糖巧酶（a-D-glucuronidase)、目-D-木 糖巧酶（目-D-x}dosidase)和己醜醋酶（acetylx}dan esterases)等。其中最主要也是最重 要的是内切-1，4-目-D-木聚糖酶，它能够从木聚糖的内部随机切割目-1，4-木糖连接键。 基于催化结构的序列相似性，木聚糖酶被归类到糖巧水解酶第5, 7,8,10,11和43家族。现 在所获得的木聚糖酶大多数都属于第10和第11两个家族。
[0003] 木聚糖酶分布较为广泛，在细菌、藻类、原生动物、植物等生物中都有存在。微生物 来源的木聚糖酶由于其在食品、饲料、造纸、能源、纺织等领域中具有巨大的应用。如在饲料 行业中可W消除或减少抗营养作用从而提高饲料的利用率；在食品行业中可W增加面包的 体积及改善口感和用于果汁的澄清；在造纸和纸浆工业中可W促进木质素的释放从而减少 漂白剂的利用；在纺织上可W辅助脱胶等。
[0004] 其中碱性木聚糖酶在造纸和纸浆上的应用可W增加纸张白度和强度W及降低环 境污染而备受关注。由于工业制浆通常是在高温和碱性条件下进行的，因此，具有高温碱性 性质的木聚糖酶在该个过程中才会有效果。此外，高温碱性木聚糖酶在生物转化和洗涂剂 中也有应用。因此，寻找新的高温碱性木聚糖酶来满足工业需求变得越来越重要。
[0005] 目前所获得的木聚糖酶大多数来源于常规环境，最适温度在5(TC左右，最适抑为 中性，在很多工业中没法应用。因此需要开发一种性质优良的、适合于在造纸、生物质能源 和食品工业中应用新的木聚糖酶。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种高温碱性耐盐的木聚糖酶。
[0007] 本发明的再一目的是提供编码上述高温碱性耐盐木聚糖酶的基因。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0009] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0010] 本发明的另一目的是提供一种制备上述高温碱性耐盐木聚糖酶的基因工程方法。
[0011] 本发明的另一目的提供上述高温碱性耐盐木聚糖酶的应用。
[0012] 本发明首先获得一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4,在高温碱性及高盐条件下具 有很高的酶活。该些性质符合造纸工业中对木聚糖酶的高温碱性的要求，降低漂白剂的使 用，减少环境污染。
[0013] 本发明所述高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4,其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
[0014] MLKVL 服 PUTGMALA 化 LPA 化 NSSANA 邸化 GAUWAPI 沈 RYADSFAIGAAVEP 巧 LEGKSGEVLK HHYNSIVAENVMKPISIQP 邸 GKHFEEADKIVKFAKENDMEVR 即 mWHSQVPDWFFWKNGKPMVDETDVKQRE KNKKIVLKRVEKHVKEIVKRYKNDIDSWDW肥TVDDNGGLRESQWYQLTGTDY化VAFETARKFAGKDAKLYINDY NTEVEWRTALYNLVKDLLADGVPIDGVGHQOHQIGWP 化犯 TEDSINMFADLGU)NQ 口 EUHSLYGWPPRPAYP TYDAIP邸RFEAQAERYNDMFELY邸LDDKISSVTFWGIADNRTWLNDRAREFNDGVGVDAPFVFGLDYKVKPAYWA IMD 本发明的木聚糖酶XynSL4总共含380个氨基酸，N端29个氨基酸为预测的信号肤，理 论分子量为43.44 kDa，理论等电点为4.82。
[0015] 本发明的木聚糖酶XynSL4的最适抑为7.0，在抑9.0时剩余95%的酶活，在 P化1. 0时还剩余60%的酶活。该木聚糖酶在抑6. 0-11. 0之间均很稳定，在此抑范围 内处理60min后剩余酶活性在86% W上，该说明此酶具有较好的抑稳定性。
[0016] 本发明的木聚糖酶XynSL4的最适温度为7(TC，在50-75°C时剩余50% W上的酶 活。在不存在底物的情况下，该酶在70 °C不稳定，半衰期< 5 min。但是在存在底物的 情况下，该酶再此温度下的热稳定性很好，处理半小时还剩余76%的酶活。
[0017] 本发明的木聚糖酶XynSL4还具有很好的盐的耐受性和稳定性。在0.25-3.0 M 化Cl存在的情况下剩余55% W上的酶活。在3 M和4M化Cl的浓度下处理60 min,剩余 90% W上的酶活。
[0018] 本发明还提供了编码上述高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4的基因，该基因的碱基 序列如SEQ ID NO. 2所示： ATGCTGAAAGTTCTACGTAAACCACTAATCACCGGAATGGCGCTAGCACTCTTATTGCCTGCAGGCCTGAAC AGTTCCGCGAATGCGGAAGACTCACTGGGAGCGCTTGATGTTGCTCCAATTTCTGAACGTTACGCGGATTCCTTTGC AATCGGCGCTGCTGTTGAACCCTTTCAACTCGAAGGAAAAAGTGGAGAAGTTCTAAAGCACCATTACAACAGCATTG TGGCTGAAAACGTCATGAAACCGATTTCGATTCAGCCCGAAGAAGGCAAGTTCGATTTTGAAGAAGCGGATAAGATC GTCAAGTTTGCGAAAGAAAATGATATGGAAGTTCGCTTCCATACGCTCATCTGGCACAGCCAAGTGCCCGACTGGTT CTTCCTTGATAAAAACGGAAAGCCGATGGTTGATGAAACGGATGTAAAACAACGCGAAAAAAATAAGAAAATCGTTC TGAAGCGTGTAGAAAAGCATGTGAAGGAAATAGTCAAACGCTATAAAAATGATATCGATTCGTGGGATGTTGTCAAC GAAACGGTTGATGACAACGGAGGTCTTCGGGAATCGCAGTGGTAYCAACTCACTGGGACTGATTACATTAAAGTCGC GTTTGAGACTGCCAGAAAGTTTGCCGGCAAAGATGCAAAGCTTTATATCAACGATTACAATACCGAAGTAGAACCTA AGCGGACTGCTTTGTATAATCTGGTCAAAGACTTATTGGCTGACGGCGTTCCGATCGATGGGGTCGGCCACCAGGGA CATATCCAGATCGGCTGGCCTTCTCTGCAGGAAACTGAGGATTCCATCAACATGTTCGCTGATCTTGGATTGGACAA CCAAATCACTGAATTGGACATCAGCCTTTACGGTTGGCCGCCAAGACCGGCTTATCCGACTTACGACGCAATTCCGG AAGAACGCTTCGAAGCTCAGGCTGAGCGCTATAATGACATGTTTGAATTATATGAAAAGCTGGACGACAAAATCAGC AGTGTCACATTTTGGGGCATTGCCGACAACCGTACGTGGTTGAACGACCGCGCTAGAGAGTTCAATGACGGCGTCGG TGTGGACGCACCATTTGTCTTTGGGCTCGATTACAAAGTGAAACCTGCCTATTGGGCCATCATGGATTAA 本发明通过PCR的方法分离克隆了该一木聚糖酶基因巧征514，DNA全序列分析结果 表明，木聚糖酶XynSL4结构基因々全长1143bp,起始密码子为ATG，终止密码子为 TGA，GC含量47.0 %，编码380个氨基酸组成的多肤（Xyn化4 )，N端29个氨基酸预测 为信号肤序列，中间为一个第10家族的催化结构域。在GenBank中的比对结果表明它与做 过功能验证的来自于Geo知ciJ7化 (AEW07375)的高温碱性木聚糖酶的 最高一致性为65%，表明XynSL4是一个新的木聚糖酶。
[0019] 本发明还提供了包含上述高温碱性耐盐木聚糖酶基因巧征514的重组载体，优选 为伯T义放-巧征514。将本发明的木聚糖酶基因巧征514插入到表达载体合适的限制性酶切 位点之间，使其核巧酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的 实施方案，优选为将木聚糖酶基因《网插入到质粒祀T2化(+)上的公和限制 性酶切位点之间，得到重组表达质粒伯T义放-
[0020] 本发明还提供了包含上述高温碱性耐盐木聚糖酶基因巧征514的重组菌株，优选 所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽抱杆菌和丝状真菌，优选为重组菌株化21 0E3)/xynSL4。
[0021] 本发明还提供了一种制备高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4的方法，包括W下步骤： 1) 用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2) 培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶的表达； 3) 回收并纯化所表达的木聚糖酶XynSL4。
[0022] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大 肠杆菌细胞化21 0E3)，得到重组菌株公心7/ 乂网51杂
[0023] 本发明还提供了上述高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4的应用，所述高温碱性耐盐 木聚糖酶XynSL4具有耐热耐强碱的性质，可用于工业上纸浆的漂白和生物质能源的制备 过程中生物质的降解；具有耐盐的特性，可用于海产品的加工处理。
[0024] 本发明提供了一种性质优良的、适合于在造纸、生物能源和食品工业中应用的新 木聚糖酶XynSL4。造纸上的工业制浆通常是在高温和碱性条件下进行的。本发明所提供的 木聚糖酶XynSL4最适反应温度为7(TC，而且在底物存在的情况下在该温度下非常稳定，该 酶的最适抑为7. 0,在抑9. 0的时候剩余95%的酶活，在抑11. 0的时候剩余60%的酶活。 该木聚糖酶还具有很好的抑耐受性，在抑6. 0?11. 0非常稳定。此外，该酶在0. 25 - 3. 0 M化Cl存在的情况下剩余55% W上的酶活，且在3 M和4M化Cl的浓度下非常稳定。本 发明的木聚糖酶XynSL4具有高温碱性耐盐的特点，因此本发明的高温碱性耐盐木聚糖酶 XynSL4可在造纸制浆的过程中使用，可W减少漂白剂的使用，增加纸张亮度和强度，减少环 境污染。此外，该酶还可W应用于生物质能源制备过程中生物质降解W及海产品处理。
【专利附图】
【附图说明】
[00巧]图1 :在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶XynSL4的SDS-PAGE分析。其中，M:低 分子量蛋白质Marker ;1:未诱导的含有木聚糖酶基因载体祀的大肠杆菌培养上 清液；2:诱导的含有木聚糖酶基因载体祀的大肠杆菌培养上清液浓缩液；3:通 过媒柱纯化的达到电泳纯的XynSL4蛋白。
[0026] 图2 ;重组木聚糖酶XynSL4的最适抑。
[0027] 图3 ;重组木聚糖酶XynSL4的抑稳定性。
[0028] 图4 ;重组木聚糖酶XynSL4的最适温度。
[0029] 图5 ;重组木聚糖酶XynSL4的热稳定性。
[0030] 图6 ;重组木聚糖酶XynSL4的盐耐受性。
[0031] 图7 ;重组木聚糖酶XynSL4的盐稳定性。
【具体实施方式】
[0032] 试验材料和试剂 1、菌株及载体；大肠杆菌表达载体祀T2化(+)及菌株fccAericAia CO" BL21值E3) 购自于Novagen公司。
[003引 2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs和 PMD 18-T载体购于日本TaKaRa公司。基因组提取试剂盒购于北京Tiangen公司，纯化及质 粒提取试剂盒购于美国OMEGA公司。木聚糖（X^an化om beechwood)购于美国Sigma公 司；蛋白腺（hyptone)、酵母提取物（Yeast Extract)为英国OXOID公司产品，其余试剂为 国产分析纯。
[0034] 3、培养基： (I)LB培养基（g/1);酵母粉5.0,蛋白腺10.0，化Cl 10.0，抑7.0。
[00巧](2)平板筛选培养基（g/1);酵母粉5.0,蛋白腺10.0，NaCl 10.0，琼脂15.0， pH7. 0。
[0036] 说明：W下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第H版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0037] 实施例1 ;木聚糖酶基因々^514的克隆 动球菌基因组DNA的提取；利用木聚糖为唯一碳源的筛选培养基从吉林乾安大布苏 盐碱湖的底泥中分离得到一株产碱性木聚糖酶的微生物，经16S鉴定为动球菌属，命名为 户7<3/?(9C(9cc化? sp.化4。采用天根公司的细菌基因组提取试剂盒（DP302)提取该不动球菌的 基因组DNA，具体操作完全按照该试剂盒的说明书进行。
[003引根据第十家族木聚糖酶基因的保守（YDWDVVNE和DGIGMQSH)序列设计合成了简并 引物 XlO-F 和 XlO-R : XlO-F: 5'-CTACGACTGGGAYGTNIBSAAYGA-3'; XlO-R 5'-GTGACTCTGGAWRCCIABNCCRT-3' (Wangetal., 2010) W上述的动球菌基因组总DNA为模板进行PCR扩增。采用降落PCR方法进行基因片 段的扩增。反应参数为；94°C预变性5 min; 94°C变性30 sec，56-50°C退火30 sec，72°C 延伸30 36。，10个循环(每个循环降落0.5°0。然后941：变性30 36(3，501：退火30 36(3， 72°C延伸30 sec, 30个循环，72°C保温5 min。得到一约250bp片段，将该片段回收后与PMD 18-T载体相连送到英俊公司测序。
[0039] 根据测序得到的木聚糖酶基因的保守区的核甘酸序列，设计上游和下游各H条 TAIL-PCR特异性引物；设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在SPl的内 侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定(为方便电泳识别结果，sp2 和sp3 -般间距100 bp),引物长度一般22?30 nt，退火温度在62°C。并将它们分别命名 为化4-uSPl, SL4-USP2, SL4-USP3 (上游特异性引物）；化4-dSPl, SL4-dSP2, SL4-dSP3 (下游特异性引物）见表1。按照TAIL-PCR中的程序对两端侧翼序列进行扩增。
[0040] 表1木聚糖酶XynSL4 TA比-PCR扩增和全长扩增所需的引物
【权利要求】
1. 一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 /_J、i 〇
2. -种高温碱性耐盐木聚糖酶基因其特征在于，编码权利要求1所述的高温 碱性耐盐木聚糖酶XynSL4。
3. 根据权利要求2所述的高温碱性耐盐木聚糖酶基因其特征在于，其碱基序 列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 包含权利要求2或3所述高温碱性耐盐木聚糖酶基因的重组载体。
5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组载体 xynSL4〇
6. 包含权利要求2或3所述高温碱性耐盐木聚糖酶基因的重组菌株。
7. 根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、 芽孢杆菌或丝状真菌。
8. -种制备高温碱性耐盐木聚糖XynSL4的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2) 培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及 3) 回收并纯化所表达的木聚糖酶XynSL4。
9. 权利要求1所述高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4的应用，其特征在于：所述高温碱性 耐盐木聚糖酶XynSL4用于工业上纸浆的漂白，生物质能源制备过程中生物质的降解，以及 用于海产品的加工处理。
【文档编号】C12N9/42GK104357427SQ201410629920
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】王国增, 叶秀云, 林娟 申请人:福州大学