一种猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，以克服传统制备胃蛋白酶方法易使胃蛋白酶变性、有机溶剂对操作人员的身体危害，成本较高等缺陷为目的，该方法包括使用盐酸对猪胃基底部粘膜进行粗提，然后利用胃蛋白酶在弱酸性溶液中溶解度高、酶活稳定，而胃膜素遇弱酸即沉淀的性质，采用酸性水溶液代替丙酮提取分离胃蛋白酶和胃膜素，再通过离心、过滤、超滤、干燥等步骤制备得到胃蛋白酶和胃膜素，通过该方法制备猪胃蛋白酶和胃膜素，不仅保护了胃蛋白酶活性，同时因不使用有机溶剂，提高了操作的安全系数，对工人身体无任何伤害，而且降低了成本，扩大了产能，具有广阔的市场前景。
【专利说明】一种猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，特别涉及一种用猪胃粘膜制备胃蛋白酶和胃膜素的方法。
【背景技术】
[0002]胃蛋白酶是自猪胃粘膜中提取而得，是一种消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主细胞所分泌，功能是将食物中的蛋白质分解为小的肽片段，目前，药用胃蛋白酶一般是从猪胃粘膜中提取而得，用于消化不良。胃膜素是猪胃粘膜消化提取制得的粘蛋白，有抗胃蛋白酶分解和弱抗酸作用，能在胃内形成膜，覆盖溃疡面，减少胃酸的刺激，有利于溃疡面的愈合。胃蛋白酶的分离方法有分级盐析分离、有机溶剂分离和底物亲和分离等，而目前，国内外对猪胃蛋白酶的分离方法普遍是将酸法制备的粗提液通过有机溶剂，分离得到包括胃蛋白酶A、胃蛋白酶B、胃蛋白酶C、胃蛋白酶D、粘膜蛋白、胃膜素等的混合胃蛋白酶，有机溶剂法一般使用丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，有机溶剂沉淀蛋白质虽分辨力好，溶剂易除去，但缺点是容易使酶和具有活性的蛋白质变性，故操作时要求条件严格，同时，传统工艺干燥前物料性状决定了只能采用热风循环，所以产能也受到极大限制，此外，有机溶剂易燃易爆，使用量大，成本高，由于丙酮带一定毒性，对生产工人身体也会造成一定危害。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，以克服传统制备胃蛋白酶方法中的缺陷，使胃蛋白酶不易变性，同时提高操作的安全系数，减少有机溶剂对操作人员的身体危害，提高产量，节约成本。
[0004]本发明的技术方案是:
一种猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，包括以下步骤:
(1)粗提液的制备:取猪胃基底部粘膜，加入4%盐酸水溶液，用量按Ikg猪胃基底部粘膜计算为270ml，搅拌均匀，升温至44?46°C，30min后调节PH至2.2?2.4，恒温酸化3小时，用40目尼龙网过滤，将滤出的酸化胃浆液降温至O?:TC ；
(2)分离:向酸化胃浆液中加入PH2.0?5.0的酸性水溶液，搅拌均匀，静置5?6h后，上层清液过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，下层沉淀离心，取离心清液过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，离心后的滤渣，加入PH2.0?5.0酸性水溶液，搅拌均匀，静置20分钟后离心，取离心清液过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，滤渣备用；
(3)胃膜素的制备:滤渣经脱水、干燥得胃膜素；
(4)胃蛋白酶的制备:取收集的胃蛋白酶清液，浓缩、透析、干燥得胃蛋白酶。
[0005]其中:
步骤(2)所述的向酸化胃浆液中加入的酸性水溶液用量优选4?12倍酸化胃浆液体积，更优为8倍酸化胃浆液体积。
[0006]步骤(2)所述的向滤渣中加入的酸性水溶液用量按Ig滤渣计算优选I?4ml，更优为2ml。
[0007]步骤(2)所述的酸性水溶液的PH值优选为3.0。
[0008]步骤(2)所述的酸性水溶液的温度优选8?10°C，更优为9°C。
[0009]步骤(2)所述的酸性水溶液的酸优选:盐酸、硫酸、醋酸、磷酸中的一种。
[0010]步骤(4)所述的胃蛋白酶清液的浓缩、透析、干燥方法优选:将胃蛋白酶清液调节温度至10?15°C，选用5?1kd分子量膜超滤浓缩至胃蛋白酶浓度为15%，超滤浓缩的进液压力为0.2MPa,回流压力为0.1?0.16MPa，向浓缩液中分批加入等体积8?10°C纯化水进行透析，直至用硝酸银检测出液无氯离子，收集截留液，截留液用于喷雾干燥，喷干进风温度110?125 °C，尾风温度66?75°C。
[0011]本发明具有如下有益效果:
1、本工艺利用胃蛋白酶在弱酸性溶液中溶解度高、酶活稳定，而胃膜素遇弱酸即沉淀的性质，工艺采用酸性水溶液代替丙酮提取分离胃蛋白酶和胃膜素，减少了丙酮对酶活的影响，极大的保护了胃蛋白酶活性。
[0012]2、本工艺不使用有机溶剂，提高了操作的安全系数，对工人身体无任何伤害。
[0013]3、本工艺采用喷雾干燥技术代替传统的热风循环干燥技术，缩短了生产周期，实现了连续化生产，扩大了产能，此外，喷雾干燥技术避免使用传统有机溶剂法涉及的沉析、脱水、制粒等繁琐的工序，简化了生产工艺。
4、传统工艺使用大量丙酮，而丙酮价格又在急剧上升，造成生产成本大幅升高，本工艺弃用丙酮，较传统工艺成本显著下降。
【具体实施方式】
[0014]实施例1:
(1)粗提液的制备:取猪胃基底部粘膜1kg，加入4%盐酸水溶液270ml，搅拌均匀，于60?70°C水浴条件下升温至44?46°C，30min后调节PH至2.2?2.4，恒温酸化3小时，用40目尼龙网过滤，将滤出的酸化胃浆液在搅拌条件下降温至O?:TC，得到粗提的酸化胃浆液 1200ml ；
(2)分离:向1.2L酸化胃浆液中加入温度为8°C、PH2.0的磷酸水溶液4.8L，搅拌均匀，静置5?6h后，上层清液用621滤布过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，下层沉淀以1500r/min的转速离心，取离心清液用621滤布过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，离心后的滤渣34.6g，加入温度为8°C、PH2.0磷酸水溶液34.6ml，搅拌均匀，静置20分钟后离心，取离心清液用621滤布过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，滤渣备用；
(3)胃膜素的制备:滤渣经丙酮脱水、干燥得胃膜素20.Sg ；
(4)胃蛋白酶的制备:取收集的胃蛋白酶清液，将胃蛋白酶清液调节温度至10°C，选用5kd分子量膜超滤浓缩至胃蛋白酶浓度为15%，超滤浓缩的进液压力为0.2MPa，回流压力为0.1MPa,向浓缩液中分批加入等体积8°C纯化水进行透析，直至用硝酸银检测出液无氯离子，收集截留液，截留液用于喷雾干燥，喷干进风温度110°C，尾风温度66°C，得胃蛋白酶30.4g0
[0015]结论:每Ig中胃酶含胃蛋白酶活力为:10500U ；
胃膜素按干燥品计算，含总氨(N) 7.1% ； 还原糖为23.5%。
[0016]实施例2:
在本实施例中，粗提液的制备方法与实施例1相同，其余制备方法如下:
(1)分离:向1.2L酸化胃浆液中加入温度为10°C、PH5.0的醋酸水溶液14.4L，搅拌均匀，静置5?6h后，上层清液用621滤布过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，下层沉淀以1500r/min的转速离心，取离心清液用621滤布过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，离心后的滤渣22.5g，加入温度为10°C、PH5.0醋酸水溶液90ml，搅拌均匀，静置20分钟后离心，取离心清液用621滤布过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，滤渣备用；
(2)胃膜素的制备:滤渣经丙酮脱水、干燥得胃膜素13.5g ；
(3)胃蛋白酶的制备:将胃蛋白酶清液调节温度至15°C，选用1kd分子量膜超滤浓缩至胃蛋白酶浓度为15%，超滤浓缩的进液压力为0.2MPa,回流压力为0.16MPa，向浓缩液中分批加入等体积10°C纯化水进行透析，直至用硝酸银检测出液无氯离子，收集截留液，截留液用于喷雾干燥，喷干进风温度125°C,尾风温度75°C,得胃蛋白酶20.lg。
[0017]结论:每Ig中胃酶含胃蛋白酶活力为:8600U ;
胃膜素按干燥品计算，含总氨(N) 7.5% ；
还原糖为24%。
[0018]实施例3:
在本实施例中，粗提液的制备方法与实施例1相同，其余制备方法如下:
(1)分离:向1.2L酸化胃浆液中加入温度为9°C、PH3.0的盐酸水溶液9.6L，搅拌均匀，静置5?6h后，上层清液用621滤布过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，下层沉淀以1500r/min的转速离心，取离心清液用621滤布过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，离心后的滤渣50.5g，加入温度为9°C、PH3.0盐酸水溶液101ml，搅拌均匀，静置20分钟后离心，取离心清液用621滤布过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，滤渣备用；
(2)胃膜素的制备:滤渣经丙酮脱水、干燥得胃膜素30.3g ；
(3)胃蛋白酶的制备:取收集的胃蛋白酶清液，将胃蛋白酶清液调节温度至13°C，选用8kd分子量膜超滤浓缩至胃蛋白酶浓度为15%，超滤浓缩的进液压力为0.2MPa，回流压力为0.13MPa，向浓缩液中分批加入等体积9°C纯化水进行透析，直至用硝酸银检测出液无氯离子，收集截留液，截留液用于喷雾干燥，喷干进风温度120°C，尾风温度70°C，得胃蛋白酶55.8g0
[0019]结论:每Ig中胃酶含胃蛋白酶活力为:16000U ；
胃膜素按干燥品计算，含总氨(N) 6.8% ；
还原糖为23%。
[0020]实施例4:
在本实施例中，除分离方法中的酸性水溶液选择是PH3.0的硫酸水溶液，其余制备方法均与实施例3相同:
结论:胃蛋白酶35.6g，胃膜素22.4g ；
每Ig中胃酶含胃蛋白酶活力为:11000U ；
胃膜素按干燥品计算，含总氨(N) 7.3% ；
还原糖为23.2%。
【权利要求】
1.一种猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)粗提液的制备:取猪胃基底部粘膜，加入4%盐酸水溶液，用量按1kg猪胃基底部粘膜计算为270ml，搅拌均匀，升温至44?46°C，30min后调节PH至2.2?2.4，恒温酸化3小时，用40目尼龙网过滤，将滤出的酸化胃浆液降温至0?:TC ； (2)分离:向酸化胃浆液中加入PH2.0?5.0的酸性水溶液，搅拌均匀，静置5?6h后，上层清液过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，下层沉淀离心，取离心清液过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，离心后的滤渣，加入PH2.0?5.0酸性水溶液，搅拌均匀，静置20分钟后离心，取离心清液过滤至澄清得胃蛋白酶清液，收集备用，滤渣备用； (3)胃膜素的制备:滤渣经脱水、干燥得胃膜素； (4)胃蛋白酶的制备:取收集的胃蛋白酶清液，浓缩、透析、干燥得胃蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的向酸化胃浆液中加入的酸性水溶液用量为4?12倍酸化胃浆液体积。
3.根据权利要求2所述的猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的向酸化胃浆液中加入的酸性水溶液用量为8倍酸化胃浆液体积。
4.根据权利要求1所述的猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的向滤渣中加入的酸性水溶液用量为按lg滤渣计算为1?4ml。
5.根据权利要求4所述的猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的向滤渣中加入的酸性水溶液用量为用量为按lg滤渣计算为2ml。
6.根据权利要求1所述的猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的酸性水溶液的PH值为3.0。
7.根据权利要求1所述的猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的酸性水溶液的温度为8?10°C。
8.根据权利要求7所述的猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的酸性水溶液的温度为9°C。
9.根据权利要求1所述的猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的酸性水溶液的酸为:盐酸、硫酸、醋酸、磷酸中的一种。
10.根据权利要求1所述的猪胃蛋白酶和胃膜素的制备方法，其特征在于:步骤(4)所述的胃蛋白酶清液的浓缩、透析、干燥方法为:将胃蛋白酶清液调节温度至10?15°C，选用5?10kd分子量膜超滤浓缩至胃蛋白酶浓度为15%，超滤浓缩的进液压力为0.2MPa,回流压力为0.1?0.16MPa，向浓缩液中分批加入等体积8?10°C纯化水进行透析，直至用硝酸银检测出液无氯离子，收集截留液，截留液用于喷雾干燥，喷干进风温度110?125°C，尾风温度66?75°C。
【文档编号】C12N9/64GK104480090SQ201410701027
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】张革, 唐章勇, 余茂军, 周后杰, 陈红兵 申请人:四川德博尔制药有限公司