一种植物原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定方法
【专利摘要】本发明提供了一种植物原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定方法，包括以下步骤：（1）植物细胞原生质体的提取；（2）植物细胞原生质体中液泡的提取；（3）原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定：在光镜下检测上述液泡中叶绿素的含量和细胞色素c氧化酶的活性，以确定提取液泡的纯度，并且测定提取液泡中硝态氮的含量，最后分别测定原生质体和液泡中酸性磷酸酶的活性，并将原生质体和液泡中硝态氮的含量用酸性磷酸酶的活性标准化，经计算得到原生质体中液泡内、外硝态氮的含量。本方法可以准确测定出原生质体中液泡内、外硝态氮的含量；提取完好原生质体的效率在90%以上；完好液泡的提取效率在95%以上。
【专利说明】一种植物原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物局部成分含量的测定方法，尤其涉及一种植物原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定方法。
【背景技术】
[0002]我国是氮肥的消费大国，年氮肥消耗量位居世界第一，但是氮肥利用率却较低，平均只有35%，远远低于发达国家的40%-60%。随着氮肥的大量施用，许多地方出现随氮肥施用量增加作物产量反而减少的现象。过低的氮肥利用率不仅造成资源浪费和环境污染，还严重的威胁到了人类的身体健康。2013年联合国环境规划署全球养分管理合作伙伴(GPNM,UNEP)组织编写的“Our Nutrient World”就系统分析了养分在粮食安全和环境保护中的作用，明确提出了 20-20计划，即在20年内提高养分利用效率20%。因此，提高氮肥利用率，充分挖掘作物高效利用氮素的遗传潜力具有重要的生态和实际生产意义。
[0003]植物体内硝态氮(N03_)的累积与利用是作物氮素营养研宄的重要组成部分，关系到植物体内NOf含量和氮素利用效率(nitrogen use efficiency, NUE)高低的问题。NO3-短途运输调控着NO 3_的利用效率。液泡对NO 3_起到分隔作用，储存在液泡中的NO 3-不能及时高效利用；只有分配在液泡外原生质体中的N03_才能被代谢酶及时代谢并形成植株体的一部分。因此，液泡N03_在原生质体和液泡中的分配不仅影响了 NO 3_的利用效率，而且直接影响了植株的氮素利用效率，尽管N03_在液泡内外的短途分配机理已取得了较好的研宄进展，但对于如何测定液泡内外NOf的浓度并没有一个很好的方法。
目前国内外测定原生质体和液泡中硝态氮的方法主要为微电极测定法，从而研宄液泡中实际的硝酸盐外流与内流过程。比如采用原位法监测液泡内外的电化学梯度，从而测定细胞质和液泡中硝酸盐的浓度是研宄硝酸盐在细胞器间转运的原始方法。以往的研宄采用硝酸盐选择性微电极分别测定了液泡膜内、外的二个组分或组群中的硝酸盐浓度，同时用酶法测定整个单细胞的硝酸盐浓度，证实了用硝酸盐选择性微电极测定液泡膜内外的硝酸盐浓度方法的可行性，这曾经为研宄硝酸盐在作物液泡膜上的运输提供了可行的方法与途径。目前用于测定植株细胞硝酸盐浓度的方法中，硝酸盐选择性微电极法受到普遍采用。国内外有关对不同作物细胞和液泡中硝酸盐浓度的变化及利用研宄的材料也不断扩大，迄今所能查到的有大麦、玉米、大豆、菠菜和水稻等一些作物，逐步形成了一套完善和成熟的细胞质和液泡NO3-含量的测定方法，为液泡NO 3-利用的研宄创造了良好的条件。但利用双电极法测定原生质体和液泡中的硝态氮含量毕竟是通过电流的变化来反应硝态氮含量的变化，并不是对亚细胞器中硝态氮含量的直接测定；此外，双阻微电极法分别测定原生质体和液泡中的硝态氮含量难度较大，很难确定微电极的扎针部位是否确定在亚细胞的某个部位，因此测定结果也并不一定能反映真实值。除此之外，国内外现在也有一些对细胞原生质体和液泡进行分离测定的报道，但都仅限于重金属含量的测定，并没有一种成熟的技术可以分别测定细胞原生质体和液泡中的硝态氮含量。
[0004]可见，国内外对液泡NOf在液泡内外的分配机理已有一定研宄，但到目前为止还没有一种普遍、有效的方法可以直接测定液泡内外的N03_含量，也即原生质体和液泡中的硝态氮含量。因此，抓住提高植物N03_利用效率的关键，进一步方便植株体NO 3_利用效率的研宄，本申请根据以往的研宄结果对植株细胞进行原生质体和液泡的分离，提出了一套切实可行的测定植物细胞原生质体和液泡中no3_含量的方法。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，克服以上【背景技术】中提到的不足和缺陷，提供一种可以将植物细胞的原生质体和液泡进行分离，从而分别测定原生质体中液泡内外硝态氮含量的一种有效方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种植物原生质体中液泡内、夕卜硝态氮含量的测定方法，包括以下步骤；
(1)植物细胞原生质体的提取:取幼苗叶片，加入预冷的研磨缓冲液研磨，研磨液经过滤、离心，得到的沉淀即为原生质体，用悬浮缓冲液悬浮后得原生质体悬浮液，分为两等分，其中一份用于硝态氮含量的检测，另一份用于提取液泡；
(2)植物细胞原生质体中液泡的提取:取上述用于提取液泡的原生质体悬浮液，加入到蔗糖溶液中，采用蔗糖密度梯度离心法离心，用移液枪吸取离心液中从上往下数的第二层溶液，即得到植物液泡；(离心后，离心液分为5层，用移液枪吸取从上往下数的第二层，即为植物液泡)
(3)原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定:在光镜下检测上述液泡中叶绿素的含量和细胞色素c氧化酶的活性，以确定提取液泡的纯度，并且测定提取液泡中硝态氮的含量，最后分别测定原生质体和液泡中酸性磷酸酶的活性，并将原生质体和液泡中硝态氮的含量用酸性磷酸酶的活性标准化，经计算得到原生质体中液泡内、外硝态氮的含量。
[0007]方法原理:(I)在原生质体中能检测到叶绿素和细胞色素c氧化酶，而液泡中不含有这些成分因而检测不到，采用此方法可以鉴定提取液泡纯度的高低；(2)其次，由于植物酸性磷酸酶(ACP)既存在于原生质体中，也存在于液泡中(即原生质体中液泡内、外均含有ACP),因此我们可以以ACP酶的酶活作为NO3-含量标准化的指标。
[0008]上述的测定方法中，优选的，所述步骤(I) ~ (3)的整个过程在0~40C下进行。
[0009]上述的测定方法中，优选的，所述研磨缓冲液pH为7.6，包括23~27 mmol.Γ14-羟乙基哌嗪乙磺酸-缓血酸胺，200~300mmol.L—1甘露醇，4~7 mmol 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，3~6 mmol.Γ1乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，8~15mmol.厂1KCl，l~3mmol.L—1苯甲基磺酰氟，5~20mg.L ―1聚乙稀P比略烧酮，3~7mg.厂1牛血清白蛋白，
3?6 μ g.Γ1 2，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚，4~7mmol.[1K2S2O5，0.8-1.2mmol.Γ1 二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇在所述研磨缓冲液使用前加入。(因为二硫苏糖醇容易变性和降解，因此在溶液使用前加入效果最佳，加入时间久了以后会使缓冲液失效。)
上述的测定方法中，优选的，所述过滤是用两层纱布过滤。
[0010]上述的测定方法中，优选的，所述步骤(I)中离心的具体操作为:经560Xg (离心力)离心12 min，然后将上清液经1000Xg离心15 min，取上清液，经60000 X g离心30min，弃上清液。
[0011]上述的测定方法中，优选的，所述悬浮缓冲液pH为7.6，包括2.3-2.8 mmol.Γ14-羟乙基哌嗪乙磺酸-缓血酸胺,200-300 mmol.171甘露醇,0.8-1.2 mmol.L—1乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，0.9-1.1 mmol吨―1 二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇在所述悬浮缓冲液使用前加入。
[0012]上述的测定方法中，优选的，所述蔗糖密度梯度离心法的步骤包括:将悬浮液置于不连续蔗糖梯度:45%、36%、22%的蔗糖溶液中，经70000 Xg离心2 h，取22%和36%区带，再加入悬浮液，经80000 Xg离心40 min。
[0013]与现有技术相比，本发明的优点在于:
本发明能够有效分离植物细胞的原生质体和液泡，从而准确测定植物细胞的原生质体中液泡内、外的硝态氮含量，为监测植物硝态氮的利用情况提供切实、可行的检测手段。具体表现:
(I)目前还没有一种方法能准确分别测定原生质体中液泡内、外的硝态氮含量，本方法采用原生质体和液泡分离、ACP酶标准化硝态氮含量的方法可以准确测定出原生质体中液泡内、外硝态氮的含量；(2)现有技术能够从植物组织中提取到30%左右的完好原生质体，本方法提取完好原生质体的效率在90%以上；(3)现有技术对液泡和原生质体的提取是完全独立的两个技术过程，本方法将提取的原生质体分成两等分的技术改进减少了液泡提取的工作量，同时保证了原生质体中液泡内、外硝态氮含量的可比性；(4)现有技术能够从植物组织中提取到10%左右的完好液泡，本方法完好液泡的提取效率在95%以上；(5)现有技术对原生质体中液泡内、外的硝态氮含量的计算没有标准参照，本方法利用植物酸性磷酸酶(ACP)既存在于原生质体中，也存在于液泡中的原理，以ACP酶的酶活作为N03_含量标准化的指标；计算出来的硝态氮含量可以进行准确的比较含量高低。
【具体实施方式】
[0014]为了便于理解本发明，下文将结合说明书较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
[0015]除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0016]除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0017]实施例1:
一种本发明的植物原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定方法，包括以下步骤；
(O植株材料的培养
油菜幼苗的培养:将Xiangyoul5号油菜品种籽粒浸种于20%(v/v)的次氯酸钠进行表面消毒30min，采用砂培试验，选用30 cmX 30 cm棕色圆塑料钵，生长基质为无营养液成分(用水和稀盐酸清洗干净)的珍珠岩砂粒；试验设I个氮水平:正常供氮(15 mmol.L — 1N03_)，正常供氮处理所用营养液成分为贺格兰德(Hoagland)营养液(5 mmol.Γ1 KNO3,1mmol.L 1 KH2PO4, 7 mmol.L 1 MgSO4, 5 mmol.L 1 Ca (NO3)2.4H20，3 mmol.L 1 Fe-EDTA，46.25 μ mo I.L 1 B，6.722 μ mo I.L 1 Mn，0.765 μ mo I.L 1 Zn，0.316 μ mo I.L 1 Cu 和
0.5 μπιο?.Γ1 Mo) o每5天浇一次营养液，保持ρΗ5.5，每钵一株，全生育期精心管理。
[0018]烟草幼苗的培养:将萌发后的烟草品种K326在恒温培养箱中育苗，水培液采用贺格兰德(Hoagland)营养液(I mmol.L 1 KNO3, 0.2 mmol.L 1 KH2PO4, 1.4 mmol.L 1MgSO4, I mmol.L-1 Ca (NO3)2.4H20, 0.6 mmol.L-1 Fe-EDTA, 9.25 μ mo I.L-1 B, 1.2μ mo I.L 1 Mn, 0.13 μ mo I.L 1 Zn, 0.06 μ mol.L 1 Cu 和 0.1 μ mol.L 1 Mo)，培养箱中的生长条件为:温度29°C、相对湿度86%，光照10h。
[0019]油菜和烟草原生质体的提取及液泡分离的条件摸索:
在前人研宄的基础上，我们根据油菜和烟草的生长特性和生长时期进行了植株样品采集时间和米集部位的优化，发现上午10点左右的样品提取的液泡相对饱满和活性尚，两种作物都需采集生长旺盛和成熟的植株部位作为液泡提取的材料。
[0020]此外，原生质体中的液泡处于半包裹状态时的提取效果最好；如果处于全包裹状态，表明原生质体没有被破坏，液泡很难从原生质体中分离出来；如果此时液泡已完全从原生质体中分离出来，则将会立刻破裂，同样得不到完整可用的液泡。因此在进行原生质体和液泡分离前，观察到原生质体中的液泡应该是处于半包裹状态，此时控制分离缓冲液中的渗透势和释放时间，就可以很好的将液泡从原生质体中分离出来。比如，液泡处于半包裹状态时，分离缓冲液中的甘露醇浓度应该处于较低(0.2 mol.1/1)水平，这有利于液泡往内吸收缓冲液而不断胀大，最终从半包裹体中“释放”出来；而释放出来后的液泡必须立即处于较高甘露醇浓度(0.8 mol.L—1)的分离缓冲液中，以免因过度吸收溶液而破裂。归纳起来就是要特别注意液泡从原生质体中分离的时间，以及严格控制分离缓冲液的渗透势。以保证液泡即可以从原生质体中分离出来，又不至于过度吸收水分而破裂。
[0021]油菜和烟草细胞原生质体的提取:所有操作过程均在O?4°C下进行，分别取约1g油菜和烟草的幼苗叶片，加入叶片质量2倍体积的预冷的研磨缓冲液(研磨缓冲液的体积为叶片质量的2倍)，其中研磨缓冲液的pH为7.6，包括25 mmol -Γ1 4-羟乙基哌嗪乙磺酸-缓血酸胺(ifepes-Tris)，250 mmol.171甘露醇，5 mmol吨-1乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，5 mmol.L—1 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，10 mmol.L KC1，2 mmol.Γ1 苯甲基磺酰氟(PMSF)，15mg.L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP )，5mg.L ―1牛血清白蛋白(BSA)，5 μ g.L ―12，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，5 mmol.[1K2S2O5, I mmol.Γ1 二硫苏糖醇(DTT)(为了保持二硫苏糖醇的使用效果，在使用缓冲液前加入到缓冲液中混合使用)，研磨。研磨液经2层纱布过滤，560Xg离心12 min，上清液在1000Xg离心15 min后，再60000Xg离心30 min，弃上清液，得到的沉淀即为原生质体，悬浮于I ml悬浮缓冲液(pH 7.6，包括2.5mmol.L 1Hepes-Tris，250 mmol.L 1 甘露醇，I mmol.L 1EDTA，I mmol.L 1DTT )中，得到原生质体悬浮液，分为两等分，其一用于硝态氮含量的检测，另一份用于提取液泡。
[0022](2)油菜和烟草细胞原生质体中液泡的提取:所有操作过程均在O?4°C下进行，取上述用于提取液泡的原生质体悬浮液，置于不连续蔗糖梯度[含45%、36%和22%(W/V)蔗糖溶液]，经70000 Xg离心2 ho取22%和36%区带，再加入悬浮液，经80000 Xg离心40min，离心液分为5层，用移液枪吸取从上往下数的第二层，即得到油菜和烟草植株的液泡。
[0023](3)原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定:所有操作过程均在O?4°C下进行，在光镜下和采用分光光度比色法检测上述液泡中叶绿素的含量和细胞色素c氧化酶的活性，分光光度计的OD值均为零，在液泡中检测不到叶绿素含量和细胞色素c氧化酶的活性，表明提取到的液泡纯度为100%，不含有任何原生质体的其它杂质；将提取到的液泡用超声波震碎，采用连续流动分析仪测定液泡中硝态氮的含量，最后采用分光光度法分别测定原生质体和液泡中酸性磷酸酶的活性，并将原生质体和液泡中硝态氮的含量用酸性磷酸酶的活性标准化，经计算得到原生质体中液泡内、外硝态氮的含量，结果表明液泡中的硝态氮含量占到原生质体硝态氮含量的95.4%，表明植物体内绝大部分硝态氮均储藏在原生质体的液泡中。
[0024]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【权利要求】
1.一种植物原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)植物细胞原生质体的提取:取幼苗叶片，加入预冷的研磨缓冲液研磨，研磨液经过滤、离心，得到的沉淀即为原生质体，用悬浮缓冲液悬浮后得原生质体悬浮液，分为两等分，其中一份用于硝态氮含量的检测，另一份用于提取液泡； (2)植物细胞原生质体中液泡的提取:取上述用于提取液泡的原生质体悬浮液，加入至蔗糖溶液中，采用蔗糖密度梯度离心法离心，用移液枪吸取离心液中从上往下数的第二层溶液，即得到植物液泡； (3)原生质体中液泡内、外硝态氮含量的测定:在光镜下检测上述液泡中叶绿素的含量和细胞色素c氧化酶的活性，以确定提取液泡的纯度，并且测定提取液泡中硝态氮的含量，最后分别测定原生质体和液泡中酸性磷酸酶的活性，并将原生质体和液泡中硝态氮的含量用酸性磷酸酶的活性标准化，经计算得到原生质体中液泡内、外硝态氮的含量。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)~(3)的整个过程在0~4°C下进行。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述研磨缓冲液pH为7.6，包括23~27mmol.L 1 4_轻乙基呢嘆乙横酸-缓血酸胺，200~300mmol.L 1甘露醇，4~7 mmol.L 1乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，3~6 mmol.L—1乙二胺四乙酸二钠，8~15mmol.L ―1 KC1，l~3mmol.L—1苯甲基磺酰氟，5_20mg.L ―1聚乙稀P比略烧酮，3~7mg.厂1牛血清白蛋白，3—6 μ g.L 1 2, 6- 二叔丁基 ~4~ 甲基苯酸，4~7mmol.L 1 K2S205，0.8—1.2mmol.L 1 二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇在所述研磨缓冲液使用前加入。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述过滤是用两层纱布过滤。
5.如权利要求1~4任一项所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中离心的具体操作为:经560Xg离心12 min，然后将上清液经lOOOOXg离心15 min，取上清液，经60000 Xg离心30 min，弃上清液。
6.如权利要求1~4任一项所述的测定方法，其特征在于，所述悬浮缓冲液pH为7.6，包括2.3-2.8 mmol.Γ1 4-羟乙基哌嗪乙磺酸-缓血酸胺，200~300 mmol.Γ1甘露醇，0.8-1.2 mmol.L—1乙二胺四乙酸二钠，0.9-1.1 mmol.L ―1 二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇在所述悬浮缓冲液使用前加入。
7.如权利要求1~4任一项所述的测定方法，其特征在于，所述鹿糖密度梯度离心法的步骤包括:将悬浮液置于不连续蔗糖梯度:45%、36%、22%的蔗糖溶液中，经70000Xg离心2h，取22%和36%区带，再加入悬浮液，经80000Xg离心40 min。
【文档编号】C12Q1/26GK104498585SQ201410700868
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】张振华, 宋海星, 向鹏华, 单雪华, 韩永亮, 刘强, 荣湘民, 彭建伟, 郭维 申请人:湖南农业大学, 湖南省烟草公司衡阳市公司