一种具有抗氧化性的肉糜的制备方法与流程

本发明涉及一种具有抗氧化性的肉糜的制备方法，属于食品制备技术领域。

背景技术：

肉制品是人类日常生活中必不可少的一类食物，是人类摄取蛋白和脂肪的重要来源。肉制品在冻藏过程中会发生风味、颜色和食用品质的劣变，导致其营养价值下降。引起这些变化主要是由脂肪和蛋白质的氧化造成的。脂肪的酸败不仅影响肉制品独有的风味，它的氧化产物如丙二醛、4-羟基壬烯醛等具有致癌致畸作用，对人体健康有着潜在危害。许多研究表明蛋白氧化对蛋白质溶解度，乳化性和表面疏水性有着不同程度的影响，引起肉制品风味、嫩度等食用指标的下降。蛋白氧化过程中各类氨基酸也会被修饰，其结构发生改变，使肉制品营养价值降低。在肉制品贮藏过程中为了避免由氧化引起的肉制品的品质下降，目前经常在产品中添加人工合成的抗氧化剂，合成抗氧化剂的过度使用会对人体身体健康有害。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决肉制品在贮藏过程中容易氧化变质，添加人工合成抗氧化剂不利于人身体健康的问题，提供了一种方法简单，步骤易于操作的具有抗氧化性的肉糜的制备方法，在肉糜中添加0.25～1％的胶原蛋白酶解物，能够保留肉糜的原始风味且延长保存时间。

本发明采用如下技术方案：一种具有抗氧化性的肉糜的制备方法，包括如下步骤：

(1)原料处理：取新鲜或冷冻甲鱼裙边为原料，切碎后除杂，去除脂肪，蒸馏水反复洗涤若干次，充分沥干后备用；

(2)胶原蛋白的超声提取：向原料中加入原料质量15～25倍的0.35～0.5mol/L的酸溶液，将溶液置于超声装置中进行超声提取，超声频率为20-24kHz，超声功率为50～100W，超声时间为5～10min，超声温度为20～30℃；

(3)胶原蛋白的分离：超声结束后将溶液离心分离，取上清，采用5-10kD纤维膜进行超滤处理，将超滤液分别置于酸溶液和蒸馏水中透析2～4天；

(4)胶原蛋白酶解物：采用碱性溶液调节透析后的溶液至碱性，加入溶液质量0.8～1.6％的碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的酶活性为200U/mg，水浴50-55℃下酶解90～150min；

(5)胶原蛋白酶解物的分离：将酶解后的溶液离心取上清，缓慢滴加酸性溶液至上清液为中性，用3-5kD的纤维膜进行超滤处理，滤液在蒸馏水中透析2～4天，最后于-70～-80℃下预冻后进行冷冻干燥得到胶原蛋白酶解物；

(6)肉糜的处理：采用冷鲜猪肉，按肥痩比3:7-4:6，用绞肉机搅成肉糜，加入肉糜质量0.25～1％的胶原蛋白酶解物，在0-4℃下，1000～3000rmp均质15～30s，然后将肉糜放于保鲜盒中透氧PE保鲜膜封盖，置于0-4℃下放置保存，保存期可达7-10天。

进一步的，所述步骤(2)中超声装置每工作2-3s停歇时间为3～5s。

进一步的，所述步骤(5)中冷冻干燥的条件为：大气压力为10～100Pa、温度为-55～-70℃、冷冻干燥时间为24～72h。

进一步的，所述酸溶液为乙酸溶液、盐酸溶液或柠檬酸溶液。

进一步的，所述步骤(3)中离心条件为：转速为8000～12000rmp，离心时间为5～15min。

进一步的，所述步骤(5)中离心条件为：转速为5000～10000rmp，离心时间为3～6min。

本发明制备方法简单，步骤易于操作，采用超声辅助酶解的方法得到的胶原蛋白酶解物的抗氧化活性好，随着胶原蛋白水解物浓度的增加而增强，在肉糜中添加一定量的胶原蛋白酶解物后，能够抑制肉品中蛋白质和脂肪的过氧化，延长肉糜的保质期。

附图说明

图1为本发明胶原蛋白酶解物的还原力测定结果示意图。

图2为本发明胶原蛋白酶解物的二价铁螯合能力测定结果示意图。

图3为本发明中随时间的变化肉糜中pH值变化示意图。

图4为本发明中随时间的变化肉糜中酸价的变化示意图。

图5为本发明中随时间的变化肉糜中油脂过氧化值的变化示意图。

图6为本发明中随时间的变化肉糜中TBA值的变化示意图。

图7为本发明中随时间的变化肉糜中巯基含量的变化示意图。

图8为本发明中随时间的变化肉糜中羰基含量的变化示意图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步的描述。

本发明中的碱性蛋白酶外购于上海源叶生物技术有限公司。

实施例一：

一种具有抗氧化性的肉糜的制备方法，包括如下步骤：

(1)原料处理：取新鲜或冷冻甲鱼裙边为原料，切碎后除杂，去除脂肪，蒸馏水反复洗涤若干次，充分沥干后备用；

(2)胶原蛋白的超声提取：向原料中加入原料质量15倍的0.5mol/L的酸溶液，将溶液置于超声装置中进行超声提取，超声频率为20kHz，超声功率为100W，超声时间为5min，超声温度为20℃，超声装置每工作3s停歇时间为5s；

(3)胶原蛋白的分离：超声结束后将溶液离心分离，取上清，离心条件为：转速为8000rmp，离心时间为15min，采用5kD纤维膜进行超滤处理，将超滤液分别置于酸溶液和蒸馏水中透析4天；

(4)胶原蛋白酶解物：采用碱性溶液调节透析后的溶液至碱性，加入溶液质量0.8％的碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的酶活性为200U/mg，水浴55℃下酶解90min；

(5)胶原蛋白酶解物的分离：将酶解后的溶液离心取上清，离心条件为：转速为5000rmp，离心时间为3min，缓慢滴加酸性溶液至上清液为中性，用3kD的纤维膜进行超滤处理，滤液在蒸馏水中透析2天，最后于-70℃下预冻后进行冷冻干燥得到胶原蛋白酶解物，冷冻干燥的条件为：大气压力为100Pa、温度为-55℃、冷冻干燥时间为24h；

(6)肉糜的处理：采用冷鲜猪肉，按肥痩比3:7，用绞肉机搅成肉糜，加入肉糜质量0.25％的胶原蛋白酶解物，在4℃下，1000rmp均质30s，然后将肉糜放于保鲜盒中透氧PE保鲜膜封盖，置于4℃下放置保存，保存期可达7-10天。

实施例二：

一种具有抗氧化性的肉糜的制备方法，包括如下步骤：

(1)原料处理：取新鲜或冷冻甲鱼裙边为原料，切碎后除杂，去除脂肪，蒸馏水反复洗涤若干次，充分沥干后备用；

(2)胶原蛋白的超声提取：向原料中加入原料质量20倍的0.4mol/L的酸溶液，将溶液置于超声装置中进行超声提取，超声频率为22kHz，超声功率为60W，超声时间为8min，超声温度为25℃，超声装置每工作2s停歇时间为4s；

(3)胶原蛋白的分离：超声结束后将溶液离心分离，取上清，离心条件为：转速为10000rmp，离心时间为10min，采用10kD纤维膜进行超滤处理，将超滤液分别置于酸溶液和蒸馏水中透析3天；

(4)胶原蛋白酶解物：采用碱性溶液调节透析后的溶液至碱性，加入溶液质量1.0％的碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的酶活性为200U/mg，水浴52℃下酶解100min；

(5)胶原蛋白酶解物的分离：将酶解后的溶液离心取上清，离心条件为：转速为8000rmp，离心时间为5min，缓慢滴加酸性溶液至上清液为中性，用3kD的纤维膜进行超滤处理，滤液在蒸馏水中透析3天，最后于-80℃下预冻后进行冷冻干燥得到胶原蛋白酶解物，冷冻干燥的条件为：大气压力为100Pa、温度为-70℃、冷冻干燥时间为36h；

(6)肉糜的处理：采用冷鲜猪肉，按肥痩比3:7，用绞肉机搅成肉糜，加入肉糜质量0.5％的胶原蛋白酶解物，在4℃下，2000rmp均质20s，然后将肉糜放于保鲜盒中透氧PE保鲜膜封盖，置于4℃下放置保存，保存期可达7-10天。

实施例三：

一种具有抗氧化性的肉糜的制备方法，包括如下步骤：

(1)原料处理：取新鲜或冷冻甲鱼裙边为原料，切碎后除杂，去除脂肪，蒸馏水反复洗涤若干次，充分沥干后备用；

(2)胶原蛋白的超声提取：向原料中加入原料质量25倍的0.35mol/L的酸溶液，将溶液置于超声装置中进行超声提取，超声频率为24kHz，超声功率为50W，超声时间为10min，超声温度为30℃，超声装置每工作2s停歇时间为3s；

(3)胶原蛋白的分离：超声结束后将溶液离心分离，取上清，离心条件为：转速为12000rmp，离心时间为5min，采用10kD纤维膜进行超滤处理，将超滤液分别置于酸溶液和蒸馏水中透析4天；

(4)胶原蛋白酶解物：采用碱性溶液调节透析后的溶液至碱性，加入溶液质量1.6％的碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的酶活性为200U/mg，水浴50℃下酶解150min；

(5)胶原蛋白酶解物的分离：将酶解后的溶液离心取上清，离心条件为：转速为10000rmp，离心时间为6min，缓慢滴加酸性溶液至上清液为中性，用5kD的纤维膜进行超滤处理，滤液在蒸馏水中透析4天，最后于-80℃下预冻后进行冷冻干燥得到胶原蛋白酶解物，冷冻干燥的条件为：大气压力为10Pa、温度为-70℃、冷冻干燥时间为72h；

(6)肉糜的处理：采用冷鲜猪肉，按肥痩比4:6，用绞肉机搅成肉糜，加入肉糜质量1％的胶原蛋白酶解物，在4℃下，3000rmp均质15s，然后将肉糜放于保鲜盒中透氧PE保鲜膜封盖，置于4℃下放置保存，保存期可达7-10天。

取实施例二中制备得到的胶原蛋白酶解物进行还原力的测定和二价铁螯合能力的测定。

(1)还原力的测定：

将制备得到的胶原蛋白酶解物制成7份不同浓度样品，浓度分别为1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL，然后依次加入1.0mL磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L，pH6.6)和2mL质量分数1％铁氰化钾溶液，置于50℃水浴中反应20min，然后加入2mL体积分数10％的三氯乙酸，摇匀，室温下反应10min，吸取上1.5mL清液加入1.0mL蒸馏水和0.2mL0.1％的三氯化铁溶液，混合均匀，室温下反应10min后在波长700nm处测定光密度值(光密度值越大表明还原力越强)；同时用Vc做阳性对照。

结果如图1所示，还原力是通过物质的还原作用，给出电子清除自由基，还原力越强，表明抗氧化性越强。胶原蛋白酶解物的还原力随着浓度的增大而增大。浓度为6mg/mL时，胶原蛋白酶解物的还原力为0.815，表明胶原蛋白酶解物具有一定的还原力。

(2)二价铁螯合能力的测定：

在油脂的自动氧化过程中，过渡金属离子起着非常重要的作用，微量的金属离子可使油脂氧化的诱导速率提高，因此对金属离子的螯合能力是反应抗氧化作用的一个重要指标。

将制备得到的胶原蛋白酶解物制成6份0.5mL不同浓度的样品溶液，浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、分别加入925μL的去离子水，25μL氯化亚铁(FeCl₂；2mM)，再加入50μL啡啰嗪(5mM)彻底混合，室温下反应10min，在波长562nm下测定吸光度。去离子水代替样品溶液作空白对照。0-15μM的EDTA(钠盐)作为阳性对照。螯合效果的百分比(％)由下式计算：

chelating activity(％)＝[1-(A/B)]×100

A为样品溶液的吸光度，B为空白溶液的吸光度。

结果如图2所示，胶原蛋白酶解物的还原力随着浓度的增大而增大，在1.0mg/mL时，螯合铁的能力已达60％，表明胶原蛋白酶解物具有较好的螯合铁能力。

将添加有胶原蛋白酶解物的肉糜分别进行pH值测定、油脂过氧化值测定、TBA值测定、巯基含量测定和羰基含量测定。

(1)pH值测定：

参照GB/T9695.5-2008测定，取五份实施例二制得的肉糜10g，其中三份分别加入肉糜质量0.25％，0.50％，1.0％的胶原蛋白酶解物，一份加入肉糜质量0.02％的VC，另一份作为对照组无任何添加，向五份肉糜中加入90mL蒸馏水，搅拌混匀后过滤，在4℃条件下储存7天，取滤液用pH计测定保存不同时间时肉糜中的pH值。

结果如图3所示。在4℃冷藏7d的过程中，肉糜的pH值均呈上升趋势，这是由于随着贮藏时间的延长，蛋白质变性分解产生碱性物质增多导致pH值升高。在第1d到第7d，加入胶原蛋白酶解物的各组pH值较对照组低，说明胶原蛋白酶解物对肉糜pH值的升高能够起到减缓作用。当添加胶原蛋白酶解物为1.0％时，效果最佳，能够明显抑制肉糜的pH的上升。

(2)酸价的测定

酸价是评价油脂酸败的一个重要指标，能够反映出油脂品质的好坏。在储存过程中，油脂在微生物、酶、热等作用下，分解产生游离脂肪酸，游离脂肪酸含量越高，酸价也越高。

参照GB/T5530-2005测定。分别准确称取五份5g肉糜样品，其中三份分别加入肉糜质量0.25％，0.50％，1.0％的胶原蛋白酶解物，一份加入肉糜质量0.02％的VC，另一份作为对照组无任何添加，将样品置于锥形瓶中，分别加50mL中性乙醚-乙醇混合液(1:1)，振摇使油溶解，使油脂完全溶解。冷却至室温，加入百里酚酞指示液2-3滴，以氢氧化钾标准液进行滴定，至溶液颜色发生变化，并且保持15s不褪色，即为滴定终点。同时做空白。酸价按下式计算：

其中，V₁为用于样品消耗的氢氧化钾标准溶液的体积；(mL)

V₀为用于空白消耗的氢氧化钾标准溶液的体积；(mL)

C为氢氧化钾标准溶液的浓度，(mol/L)

M为样品的质量；(g)

56.1为氢氧化钾的摩尔质量(g/mol)。

结果如图4所示，肉糜在4℃储藏过程中，酸价随着时间的延长而逐渐升高，对照组的酸价上升比较快，加入胶原蛋白酶解物的实验组的酸价变化较平缓，其酸价随胶原蛋白酶解物添加量的增加而减小，说明胶原蛋白酶解物在一定程度上能够抑制肉糜的酸败，添加量为1％的胶原蛋白酶解物对肉糜酸败的抑制作用效果最好。

(3)油脂过氧化值测定

取五份2.00～3.00g实施例二制备得到的肉糜，其中三份分别加入肉糜质量0.25％，0.50％，1.0％的胶原蛋白酶解物，一份加入肉糜质量0.02％的VC，另一份作为对照组无任何添加，置于锥形瓶中，加入30mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，振摇使油脂溶解，加入1.00mL饱和的碘化钾溶液，盖好瓶盖，挣摇0.5min后放暗处3min。取出加100mL水，立即用硫代硫酸钠标准溶液(0.0020mol/L)滴定，至暗黄色时，加入1mL淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失为终点，本实验需作试剂空白。

结果计算：试样的过氧化值按照下列公式计算

式中，x₁为试样的过氧化值，单位是g/100g。

V₁试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积；单位(mL)

V2空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积；单位(mL)

C是硫代硫酸钠标准溶液的实际浓度；单位(mol/L)

M是试样的质量单位；单位(g)

0.1269是与1mL硫代硫酸钠标准溶液相当的碘的质量；单位(g)。

结果如图5所示，肉糜中油脂在储藏过程中POV值随着时间的延长而逐渐升高，且对照组的POV值上升比较快，而加入了胶原蛋白酶解物的各组POV值变化较平缓。这是因为新鲜猪油初始过氧化值较低，在自由基链式反应前期就加入适量抗氧化剂，有效地抑制了自由基的生成减轻了脂类氧化延长了油脂的储存时间。结果能够说明胶原蛋白酶解物对肉糜中油脂的氧化具有一定的抑制作用且随着添加量的增加其抗氧化效果也逐渐增强，添加1％胶原蛋白酶解物的效果最好。

(4)TBA值的测定

取五份肉糜试样10g，其中三份分别加入肉糜质量0.25％，0.50％，1.0％的胶原蛋白酶解物，一份加入肉糜质量0.02％的VC，另一份作为对照组无任何添加，加7.5％的三氯乙酸(含0.1％EDTA)50mL，振摇30min，双层滤纸过滤，取5mL上清液，加入0.02mol/L2-硫代巴比妥酸溶液5mL，沸水浴中保温40min，取出冷却l h后，加5mL氯仿摇匀，静置分层后取上清液分别在532nm和600nm处比色。TBA值的计算公式为：

式中，A532—532nm处的吸光度；

A₆₀₀—600nm处的吸光度。

结果如图6可知，在4℃冷藏过程中，随贮藏时间的延长各组肉糜的TBA值呈上升趋势。在第0d到第3d，各组的差异不显著；而从第3d开始，对照组的TBA值升高加快，并显著高于加入胶原蛋白酶解物的各组。说明胶原蛋白酶解物对肉糜的TBA值升高具有一定的抑制作用，且随着添加量的增加，其抗氧化效果也逐渐增强，添加1％的胶原蛋白酶解物效果最好。

(5)巯基含量的测定

取五份1g肉糜样品，其中三份分别加入肉糜质量0.25％，0.50％，1.0％的胶原蛋白酶解物，一份加入肉糜质量0.02％的VC，另一份作为对照组无任何添加，加入10mL 0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)在6000r/min下匀浆60s。取1mL匀浆上清液，加入9mL 0.09mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.09mol/L Gly、4mmol/L EDTA、8mol/L尿素pH8.0)，混合物在10000g离心15min，取5mL上清液加入50μL 0.01mol/L DTNB，在37℃水浴20min，稀释数倍，在412nm处测定吸光值。用双缩脲法测定上清液中蛋白质含量。空白对照中的样品溶液用缓冲液代替并测定其吸光值，按照以下公式计算巯基含量：

A₄₁₂为412nm；

S为摩尔吸光系数13600L/moL·cm；

N为稀释倍数；

P为上清液中蛋白质的质量浓度，mg/mL。

结果如图7所示，随着储存时间的延长各组肉糜中巯基含量逐渐降低，这是因为巯基被氧化成多肽分子间或多肽分子内的二硫键，或者是进一步被氧化成硫磺酸类物质，肉蛋白氧化加深，最终表现为肉蛋白结构表面的总巯基含量的下降。与对照组相比，加入了胶原蛋白酶解物的各组在第3天能显著抑制巯基值的降低。说明胶原蛋白酶解物对肉糜的氧化具有一定的抑制作用且随着添加量的增加其抗氧化效果也逐渐增强，添加1％胶原蛋白酶解物的处理组效果最好。

(6)羰基含量的测定

取五份1g肉糜，其中三份分别加入肉糜质量0.25％，0.50％，1.0％的胶原蛋白酶解物，一份加入肉糜质量0.02％的VC，另一份作为对照组无任何添加，加入10mL Tris-HCl(0.05mol/L Tris、1mmol/L EDTA、pH7.4)缓冲液匀浆，取1mL匀浆液加入1mL 15％三氯乙酸使其沉淀。混合液离心取沉淀并加入1mL 10mmol/L DNPH，室温反应60min后，加入三氯乙酸进行二次沉淀。用1:1的无水乙醇和乙酸乙酯洗涤没反应完的DNPH。蛋白沉淀用6mol/L盐酸胍溶解(用20mmol/L磷酸盐配制，pH3.0)，放置过夜测定其在370nm处的吸光值。用双缩脲法测定蛋白质含量。按照以下公式计算羰基含量：

式中，A₃₇₀为370nm波长处的吸光度；

S为摩尔吸光系数22000L/moL·cm；

P为上清液中蛋白质的质量浓度，mg/mL。

结果如图8所示，随着存储天数的增加，添加胶原蛋白酶解物的各组中羰基含量维持在较低水平。胶原蛋白酶解物具有较强的清除自由基能力，能够与脂肪氧化引起的游离基发生反应形成不活泼的物质的同时能减少丙二醛的产生，从而弱化羟自由基，超氧离子自由基和丙二醛对蛋白质结构如NH、NH2的破坏，抑制它们被转化成羰基基团，从而减少羰基含量。且有图可知，添加胶原蛋白1％的羰基含量最低。