本发明具体涉及一种神秘果酵素原液、酵素冻干翻及各自的制备方法与用途。
背景技术
神秘果(synsepalumdulcificum)，又称奇迹果(miraclefruit)、梦幻果或蜜拉圣果，系山榄科神秘果属，常绿灌木植物，原产于西非热带地区，自然分布在西非至刚果一带，印度尼西亚的丛林中也有发现。20世纪60年代引入我国海南、云南、广西和福建等热带亚热带地区，属于国宝级的珍稀植物。神秘果中含有奇特的神秘果素(miraculin)，是一种变味糖蛋白，可以改变人的味觉，产生增甜作用，使柠檬，酸橙，葡萄柚等酸度极高的食物转化成琼浆玉露般的甘甜，因而被誉为“天下第一奇果”。神秘果独特的变味功能和改善胰岛素抵抗的药理活性为糖尿病患者的治疗开辟了一条新的途径，亦可以开发成减肥药或抑制食欲的药物以及低能量的甜味剂外，神秘果还具有较强的抗氧化能力和抗肿瘤活性，是一种很有发展前途的食品。
神秘果是一种极具开发前景的天然食品，但其鲜果期短，其含有的独特神秘果素又不耐高温，严重阻碍了神秘果的开发与利用。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种神秘果酵素原液、酵素冻干粉及各自的制备方法。
本发明首先提供了一种神秘果酵素原液，它是由包括如下步骤的制备方法制成的：
1)预处理:取神秘果，去核，打浆；
2)酵母菌发酵:按照0.05％～0.15％(w/w)的接种量加入酵母菌，20～33℃下发酵6～36小时，取上清液；
3)乳酸菌发酵:按照0.5％～3％(w/w)的接种量加入乳酸菌，25～43℃下发酵12～60小时，取上清液，得酵素原液。
步骤(2)中，酵母菌接种量为0.08％～0.12％(w/w)；优选地，酵母菌接种量为0.10％(w/w)；
和/或，步骤2)中，发酵温度为25～30℃；优选地，发酵温度为28℃；
和/或，步骤2)中，发酵时间为12～36小时；优选地，发酵时间为24小时；
和/或，步骤2)中，所述酵母菌是葡萄酒·果酒用酵母。
步骤3)中，所述乳酸菌选自保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌中的一种或几种；
和/或，步骤3)中，乳酸菌接种量为1.5％～2.5％(w/w)；优选地，乳酸菌接种量为2.0％(w/w)；
和/或，步骤3)中，发酵温度为30～40℃；优选地，发酵温度为35℃；
和/或，步骤3)中，发酵时间为24～48小时；优选地，发酵时间为36小时。
本发明还提供了一种神秘果酵素冻干粉，它是由前述的酵素原液，经过冻干制成。
优选地，它是由如下冻干方法制成的：
取酵素原液，在-33～-40℃预冷冻8～10小时，再在真空度30～50pa、温度25～35℃条件下真空干燥18～24小时，粉碎，即得。
优选地，所述冻干的工艺是：在-35℃低温预冷冻8～10小时，再在真空度30～50pa、加热温度35℃条件下干燥。
优选地，所述冻干的厚度为10～20mm，优选为15mm。
本发明还提供了一种制备神秘果酵素原液的制备方法，它包括如下步骤：
1)预处理:取神秘果，去核，打浆；
2)酵母菌发酵:按照0.05％～0.15％(w/w)的接种量加入酵母菌，20～33℃下发酵6～36小时，取上清液，
3)乳酸菌发酵:按照0.5％～3％(w/w)的接种量加入乳酸菌，25～43℃下发酵12～60小时，取上清液，得酵素原液；
优选地：
步骤(2)中，酵母菌接种量为0.08％～0.12％(w/w)；优选地，酵母菌接种量为0.10％(w/w)；
和/或，步骤2)中，发酵温度为25～30℃；优选地，发酵温度为28℃；
和/或，步骤2)中，发酵时间为12～36小时；优选地，发酵时间为24小时；
和/或，步骤2)中，所述酵母菌是葡萄酒·果酒用酵母；
优选地：
步骤3)中，所述乳酸菌选自保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌中的一种或几种；
和/或，步骤3)中，乳酸菌接种量为1.5％～2.5％(w/w)；优选地，乳酸菌接种量为2.0％(w/w)；
和/或，步骤3)中，发酵温度为30～40℃；优选地，发酵温度为35℃；
和/或，步骤3)中，发酵时间为24～48小时；优选地，发酵时间为36小时。
本发明还提供了一种制备神秘果酵素冻干粉的方法，步骤如下：取前述的酵素原液，在-33～-40℃预冷冻8～10小时，再在真空度30～50pa、温度25～35℃条件下真空干燥18～24小时，粉碎，即得；
优选地，所述冻干的工艺是：在-35℃低温预冷冻8～10小时，再在真空度30～50pa、加热温度35℃条件下干燥；
优选地，冻干的厚度为10～20mm，优选为15mm。
本发明还提供了前述的神秘果酵素冻干粉、前述的神秘果酵素冻干粉在制备具有抗氧化功能的食品、保健品或药品中的用途。
本发明提供的神秘果酵素原液及其冻干粉，既保存了神秘果的风味和营养物质，还增加了其抗氧化能力，可以制成抗氧化功能的食品、保健品或药品，大大提高了神秘果加工与利用水平，为神秘果的综合开发利用开辟新道路。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1降温时神秘果酵素浆液电阻值变化情况；
图2升温时神秘果酵素浆液电阻值变化情况；
图3神秘果酵素浆液预冻温温度变化曲线图。
具体实施方式
实施例1本发明制备方法制备神秘果酵素原液
1物料
酵母菌：葡萄酒·果酒专用酵母rw，物料编号：80000877，来源：安琪酵母股份有限公司；
乳酸菌：嗜酸乳杆菌与青春双歧杆菌的混合菌，嗜酸乳杆菌：编号:bncc185342，来源：北京北纳创联生物技术研究院；青春双歧杆菌：bncc186535，来源：北京北纳创联生物技术研究院
2制备步骤
1)预处理：取成熟度基本一致的新鲜神秘果，除去坏果和杂质，用纯净水洗净后，在100mg/lnaclo2溶液中浸泡2min，以杀灭表面的霉菌，然后用纯净水冲洗干净，沥干，去核，打浆；
2)酵母菌发酵：按照接种量0.10％w/w)接种酵母菌，28℃下发酵24小时，取上清液；
3)乳酸菌发酵：按照接种量2％(w/w)接种乳酸菌，35℃下发酵36小时，取上清液，得酵素原液，酵素原液应于4℃下保存。
实施例2本发明制备方法制备神秘果酵素原液
1物料
酵母菌：葡萄酒·果酒专用酵母rw，物料编号：80000877，来源：安琪酵母股份有限公司；
乳酸菌：嗜酸乳杆菌与青春双歧杆菌的混合菌，嗜酸乳杆菌：编号:bncc185342，来源：北京北纳创联生物技术研究院；青春双歧杆菌：bncc186535，来源：北京北纳创联生物技术研究院
2制备步骤
1)预处理：取成熟度基本一致的新鲜神秘果，除去坏果和杂质，用纯净水洗净后，在100mg/lnaclo2溶液中浸泡2min，以杀灭表面的霉菌，然后用纯净水冲洗干净，沥干，去核，打浆；
2)酵母菌发酵：按照接种量0.05％w/w)接种酵母菌，20℃下发酵6小时，取上清液；
3)乳酸菌发酵：按照接种量0.5％(w/w)接种乳酸菌，25℃下发酵12小时，取上清液，得酵素原液，酵素原液应于4℃下保存。
实施例3本发明制备方法制备神秘果酵素原液
1物料
酵母菌：葡萄酒·果酒专用酵母rw，物料编号：80000877，来源：安琪酵母股份有限公司；
乳酸菌：嗜酸乳杆菌与青春双歧杆菌的混合菌，嗜酸乳杆菌：编号:bncc185342，来源：北京北纳创联生物技术研究院；青春双歧杆菌：bncc186535，来源：北京北纳创联生物技术研究院
2制备步骤
1)预处理：取成熟度基本一致的新鲜神秘果，除去坏果和杂质，用纯净水洗净后，在100mg/lnaclo2溶液中浸泡2min，以杀灭表面的霉菌，然后用纯净水冲洗干净，沥干，去核，打浆；
2)酵母菌发酵：按照接种量0.15％w/w)接种酵母菌，33℃下发酵36小时，取上清液；
3)乳酸菌发酵：按照接种量3％(w/w)接种乳酸菌，43℃下发酵60小时，取上清液，得酵素原液，酵素原液应于4℃下保存。
实施例4本发明制备方法制备神秘果酵素原液
1物料
酵母菌：葡萄酒·果酒专用酵母rw，物料编号：80000877，来源：安琪酵母股份有限公司；
乳酸菌：嗜酸乳杆菌与青春双歧杆菌的混合菌，嗜酸乳杆菌：编号:bncc185342，来源：北京北纳创联生物技术研究院；青春双歧杆菌：bncc186535，来源：北京北纳创联生物技术研究院
2制备步骤
1)预处理：取成熟度基本一致的新鲜神秘果，除去坏果和杂质，用纯净水洗净后，在100mg/lnaclo2溶液中浸泡2min，以杀灭表面的霉菌，然后用纯净水冲洗干净，沥干，去核，打浆；
2)酵母菌发酵：按照接种量0.085％w/w)接种酵母菌，25℃下发酵12小时，取上清液；
3)乳酸菌发酵：按照接种量1.5％(w/w)接种乳酸菌，30℃下发酵24小时，取上清液，得酵素原液，酵素原液应于4℃下保存。
实施例5本发明制备方法制备神秘果酵素原液
1物料
酵母菌：葡萄酒·果酒专用酵母rw，物料编号：80000877，来源：安琪酵母股份有限公司；
乳酸菌：嗜酸乳杆菌与青春双歧杆菌的混合菌，嗜酸乳杆菌：编号:bncc185342，来源：北京北纳创联生物技术研究院；青春双歧杆菌：bncc186535，来源：北京北纳创联生物技术研究院
2制备步骤
1)预处理：取成熟度基本一致的新鲜神秘果，除去坏果和杂质，用纯净水洗净后，在100mg/lnaclo2溶液中浸泡2min，以杀灭表面的霉菌，然后用纯净水冲洗干净，沥干，去核，打浆；
2)酵母菌发酵：按照接种量0.12％w/w)接种酵母菌，30℃下发酵36小时，取上清液；
3)乳酸菌发酵：按照接种量2.5％(w/w)接种乳酸菌，40℃下发酵48小时，取上清液，得酵素原液，酵素原液应于4℃下保存。
实施例6本发明制备方法制备神秘果酵素冻干粉
取实施例1制得的神秘果酵素原液，平铺成15mm的厚度，-33～-40℃预冷冻8～10小时，再在真空度30pa、温度35℃条件下真空干燥18小时，粉碎，真空包装，即得。
以下通过实验例来证明本发明神秘果酵素冻干粉制备方法的合理性：
实验例1酵母菌发酵工艺研究
酵母菌：葡萄酒·果酒专用酵母rw，物料编号：80000877，来源：安琪酵母股份有限公司。
取新鲜神秘果，除去坏果和杂质，用纯净水洗净，风干，去核，打浆，按下法进行酵母菌单独发酵工艺研究。
(1)发酵时间对酵母菌数量和sod活性的影响
发酵时间影响着酵母菌的数量和sod活性，在保证充分溶氧的条件下，将发酵温度设为25℃，酵母菌的接种量为0.1％，分别研究了在0，6，12，24，36，48和72h发酵后酵母菌数量、sod活性、糖度和ph的变化，结果如表1。
表1发酵时间对酵母菌数量和sod活性的影响
从表1可知，随着发酵时间的延长，发酵液中的sod活性和酵母菌的数量不断增加，发酵时间达到24h时酵母菌数量最大，此时sod活性为301.3u/g，糖度为8.0，随后发酵液中的酵母菌数量开始下降，此时sod活性增趋于稳定，而在此过程中ph一直在缓慢减少。
实验结果说明，本发明发酵方法中，酵母菌发酵的发酵时间可以为12～36h，优选24～36h，最优选24h。
(2)酵母菌接种量对酵母菌发酵的影响
接种量会影响发酵液中酵母菌的生长，合适的接种量可以使生产菌在发酵过程中迅速生长，从而减少杂菌的生长机会，但是接种量过大也可能使菌种生长过快，导致培养液黏度过大，从而使溶氧不足，影响产物的合成。试验在保证充分溶氧的条件下，将发酵温度设为25℃，发酵时间设为24h，酵母菌的接种量分别为0.05％，0.08％，0.10％，0.12％和0.15％，研究了在不同接种量时酵母菌数量、sod活性等相关指标的变化，结果如表2。
表2酵母菌接种量对酵母菌数量和sod活性的影响
由表2可知，当接种量在0.05％～0.10％时，酵母菌数量和sod活性明显呈上升趋势，当接种量在0.10％时达到最大值，此时sod活性为301.7u/g，当接种量在0.10％～0.15％时两者有明显下降，在整个发酵过程中ph和糖度变化趋势不明显，因此酵母菌的最佳接种量为0.10％。
实验结果说明，本发明发酵方法中，酵母菌发酵的接种量可以为0.05～0.15％，优选0.08～0.12％，最优选0.10％。
(3)发酵温度对酵母菌发酵的影响
温度会影响微生物细胞的生长速率和产物形成、产物合成方向，因此它对酵母菌数量和sod活性有直接的影响。在保证充分溶氧的条件下，接种0.10％的酵母菌，发酵时间设为24h，研究不同发酵温度下20℃，25℃，28℃，30℃和33℃酵母菌数量、sod活性等相关指标的变化，结果如表3。
表3发酵温度对酵母菌数量和sod活性的影响
由表3可知，在一定温度范围内随着温度的升高，酵母菌数量和sod活性随之增加，28℃下达到最大，此时sod活性为330.1u/g，在28℃～33℃2种显著下降，但在整个温度范围内糖度、ph趋于稳定，变化不明显。此时28℃可设为最佳发酵温度。
实验结果说明，本发明发酵方法中，酵母菌发酵的发酵温度可以是20～33℃，优选25～30℃，最优选28℃。
实验例2冻干工艺研究
1共晶点与共熔点的测定
神秘果在进行真空冷冻干燥前，要使预冻结物料达到完全冻结状态，必须使预冻温度低于物料的共晶点温度，且在干燥升华过程中，加热板温度必须保证使物料的内部温度低于其共熔点温度。因此，共晶点与共熔点是神秘果真空冷冻干燥预冻工艺条件的重要参数。
本试验采用电阻法测定神秘果的共晶点与共熔点温度。冻结是在lg-1.5型真空冷冻干燥试验机(沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司)速冻库间内进行，测定时，将lg-1.5型冻干机速冻库内的测温探头与万用表电阻探头平行插入神秘果酵素原液的中心位置，导线引出后开始进行测试。当物料完全冻结时，万用表显示的电阻值会突然增大；当完全冻结的物料开始融化时，物料电阻值将会开始减小。因此，将物料电阻值突然增大时所对应的温度记为共晶点温度，物料电阻值突然减小时所对应的温度记为共熔点温度。
由图1可知，神秘果酵素原液的共晶点约为-28℃，真空冷冻干燥前，为了保证神秘果酵素原液全部冻结，预冻温度一般需比共晶点温度低5～10℃。由图2可知，神秘果酵素原液的共熔点温度约为-24℃。
2预冻工艺参数确定
预冻速率直接决定了冰晶的粒度和晶核形成的数目，进而影响冻干制品的质量和冻干速率。缓慢冻结时物料内部形成的冰晶颗粒大而数量少，容易破坏组织结构，造成汁液流失，干燥后产品复原性差，进而影响冻干制品品质；快速冻结物料内部形成的冰晶颗粒小数量多，分布均匀，冻干后产品的复原性和复水性好。因此，本试验采用快速冻结法对神秘果酵素进行预冻。
根据神秘果酵素共晶点温度确定预冻温度，在真空冷冻干燥过程中，若预冻温度过低，则冷冻时间就会延长，造成能源浪费增加成本；若预冻温度高于物料的共晶点温度，则物料不能完全冻结，真空冷冻干燥升华过程不能顺利进行，对干燥后物料的品质及商品外观均有影响。因此，本试验选取的物料预冻温度比其共晶点温度低5～10℃。同时，物料的冻结过程是一个放热的过程，故当物料达到预冻温度后应再保持1～2h以保证完全冻结。
将速冻库温度设置为-35℃，放入神秘果酵素原液进行预冻，液层厚度为15mm,测定神秘果酵素温度变化情况，其温度变化情况见图3。
综上，本品预冻工艺参数确定为：取神秘果酵素原液，在-33～-40℃低温预冷冻8～10小时。
3真空冷冻干燥工艺单因素试验
进行真空冷冻干燥时，影响冻干的主要工艺参数有：物料特性、物料厚度、冷肼温度、加热板温度、干燥室真空度等。本试验排除不可控制因素外，以物料厚度、加热板温度、干燥室压力为影响因素，以冻干速率为测定指标，对神秘果酵素的最佳冻干工艺条件进行研究。
质量干燥速率能表征干燥过程，是评价冻干过程的重要指标，且可以避免因试样取量不同而带来的影响，其公式如下：
式中，vd为质量干燥速率，h-1；mw为干燥前物料的质量，g；md为干燥后物料的质量，g；td为干燥时间，h。
(1)物料厚度对冻干过程中干燥速率的影响
将神秘果酵素原液，按厚度分别为5mm、10mm、15mm、20mm、25mm放入-35℃的速冻库间内进行快速冻结，预冻8小时，然后快速放入冷阱温度为-45℃的干燥室内进行冻干，此时，设定干燥室内加热板温度30℃，真空度40pa，直至物料的温度曲线与加热板温度曲线平行，冻干结束。按上式计算质量干燥速率，测定结果见表4。
表4物料厚度对冻干速率的影响
结果显示，随着物料厚度的增加，物料的干燥速率呈下降趋势。但物料太薄，会增加单位面积的生产成本。综合考虑，在上述冻干条件下，物料厚度范围为5mm～25mm，优选10mm～20mm，最优选15mm。
(2)加热板温度对冻干过程中干燥速率的影响
在对物料进行加热时，神秘果酵素浆液冻结层的温度必须低于其共熔点温度，已干层温度低于其塌陷温度。将厚度为15mm的神秘果酵素原液，放入-35℃的速冻室内进行快速冻结，预冻8小时，然后快速放入冷阱温度为-45℃的干燥室内进行冻干，设定干燥室压力为40pa，加热板温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃进行单因素试验，直至物料的温度曲线与加热板温度曲线平行，冻干结束。按上式计算质量干燥速率，测定结果见表5。
表5加热板温度对冻干速率的影响
结果显示，随着加热板温度的升高，物料的干燥速率呈升高趋势，但温度升高，不利于物料中热敏成分的保存。综合考虑，在上述冻干条件下，加热板温度为20℃～40℃，优选25℃～35℃，最优选35℃。
(3)干燥室压力对冻干过程中干燥速率的影响
在真空冷冻干燥过程中，物料水分蒸发是从物料内部到表面，再到冷阱表面进行扩散流动的。因此，当干燥室内的压力小于物料表面的饱和蒸汽压，大于冷阱表面饱和蒸汽压时，才可以保证水蒸气的顺利扩散。
将厚度为15mm的神秘果酵素原液，放入-35℃的速冻室内进行快速冻结，预冻8小时，然后快速放入冷阱温度为-45℃的干燥室内进行冻干，设定加热板温度为30℃，干燥室压力为20pa，30pa，40pa，50pa，60pa进行单因素试验，直至物料温度曲线与加热板温度曲线平行，冻干结束。按上式计算质量干燥速率，测定结果见表6。
表6干燥室压力对冻干速率的影响
结果显示，随着干燥室压力的升高，物料的干燥速率呈先升高后降低的趋势。综合考虑，在上述冻干条件下，干燥室压力范围为20pa～60pa，优选30pa～50pa，最优选50pa。
4真空冷冻干燥工艺正交试验
根据单因素筛选实验结果，对物料厚度、加热板温度、干燥室压力等三个冻干工艺关键参数进行考察，各因素分别设计三个水平，选取l9(34)正交表进行正交试验，因素水平设计见表7。
实验方法：取神秘果酵素原液，按正交表的冻干工艺进行冻干，直至物料温度曲线与加热板温度曲线平行，冻干结束。按上式计算质量干燥速率，并以质量干燥速率为指标对正交结果进行分析，结果如下见表8～9。
表7冻干工艺因素水平表
表8处方优选正交试验结果
表9处方正交试验方差分析
*f0.05(2,2)＝19**f0.001(2,2)＝99
正交试验结果中极差值(r)表明，影响冻干效果的因素顺序为：加热板温度＞物料厚度＞干燥室压力。由k值可知：物料厚度15mm最佳；加热板温度35℃最佳；干燥室压力50pa最佳。由k值及方差分析可得：物料厚度、干燥室压力对冻干效果无显著性影响，但综合生产成本考虑，确定为物料厚度15mm，干燥室压力30pa。加热板温度对冻干效果影响较大，有显著性差异，确定为35℃。
5最佳冻干工艺重复试验
取神秘果酵素原液，平铺成15mm的厚度，在-35℃低温预冷冻8～10小时，再在真空度30pa、加热温度35℃条件下干燥，直至物料温度曲线与加热板温度曲线平行，冻干结束。平行制备三批神秘果酵素冻干产品，平均干燥时间为18小时，平均质量干燥速率为0.63。
对三批神秘果醇素冻干产品质量进行测定，测定结果见表10。
表10神秘果酵素冻干产品品质测定结果
实验例3不同神秘果产品抗氧化性试验
1、实验方法
按照本发明方法制备的酵素与新鲜神秘果、干神秘果进行比较，分别测定它们的抗氧化性能。
本发明方法制备酵素的方法：按照实施例6的方法制备酵素。
取1g新鲜神秘果肉制备的酵素、0.2g干神秘肉(新鲜神秘果果肉中含水量约占80％)以及1g新鲜神秘果肉，加水100ml超声处理30分钟，离心，取上清液进行抗氧化试验。试验参照葛瑞宏、储瑞蔼、李井泉，等.桂圆酵素制备及其抗氧化性研究，食品科技，2015，40(8)：262-267的方法进行抗氧化试验。
2、实验结果
测定结果见表11。
表11不同神秘果产品抗氧化性试验测定结果
结果显示，经过本发明方法处理后的酵素，其抗氧化能力明显高于未经处理的新鲜神秘果，更高于经过烘干处理的神秘果。说明本发明方法可以提高神秘果的抗氧化能力，制备得到的酵素抗氧化活性优良。
实验例4本产品与神秘果鲜果营养成分的比较研究
本发明方法制备酵素的方法：按照实施例6的方法制备酵素，其检测结果如表12所示：
表12本产品营养成分测定结果*
*上述结果均以干燥品计。
结果显示，本产品可以较好的保留神秘果鲜果中的营养成分。
综上，本发明通过酵母菌和乳酸菌联合发酵制备的酵素，其抗氧化性能优良，同时有效保留的神秘果鲜果的有效成分，应用前景优良。