本发明涉及保健食品领域，特别涉及一种抗氧化组合物、保健食品、制备方法及其应用。
背景技术：
抗氧化是抗氧化自由基的简称，人体因为与外界的持续接触，包括呼吸、外界污染、放射线照射等因素，不断的在人体体内产生自由基。科学研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联。研究抗氧化可以有效克服其所带来的危害，所以抗氧化被保健品、化妆品企业列为主要的研发方向之一，也是市场最重要的功能性诉求之一。现有的可参考公开号为cn106490604a的中国专利申请，其公开了一种抗氧化抗自由基养生保健品及其制备方法，成分为β-胡萝卜素5.0-40份、叶黄素2.0-20份、辅酶q10为2.0-20.0份、原花青素5.0-30.0份、茯苓10.0-50份、茶多酚5.0-40份、维生素c5.0-40份、虾青素2.0-20份、硒元素0.01-0.03份、沙棘8.0-35.0份、银杏叶pe6.0-25份、白藜芦醇2.0-15.0份。但是，气虚人群不适宜服用茯苓，人体对叶黄素的吸收利用率相对较低。若气虚人群，尤其是老年人服用上述保健品，容易出现营养物质利用率低的现象。技术实现要素：本发明提供一种抗氧化组合物、保健食品，具有抗氧化的特点。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种抗氧化组合物，按重量份计，包括有以下组分：桑椹提取物20-240份，蓝莓提取物15-190份，葡萄皮提取物25-300份，葡萄籽提取物10-150份，阿萨伊果粉8-120份。较佳的，按重量份计，包括有以下组分：桑椹提取物50-180份，蓝莓提取物45-150份，葡萄皮提取物60-200份，葡萄籽提取物30-120份，阿萨伊果粉20-100份。桑椹含有丰富的糖类、有机酸、脂类、维生素、色素、非色素酚和矿物质等成分，具有清除活性氧自由基、调节机体免疫功能、延缓衰老、润肤美容、降血脂、抗诱变等作用。蓝莓富含糖、酸、维生素c、维生素e、维生素a、维生素b1、sod、熊果甙、花青甙、蛋白质、脂肪等成分及丰富的铁、锌、锰等微量元素，具有防止脑神经衰老、增强心脏功能、明目抗癌等功效；蓝莓中的花青素含量很高而且种类丰富，花青素能够淬灭自由基，与胶原蛋白有较强的亲和力，能形成一层抗氧化保护膜，保护细胞和组织不被自由基氧化；蓝莓中的花青素还能协助维生素c、维生素e的吸收，增强其在体内的抗氧化作用。葡萄皮中富含糖类和多酚类，多酚类中的白藜芦醇具有清除自由基、提高组织中sod等抗氧化相关酶的活性、抑制脂质过氧化等作用。葡萄籽中含有各种矿物质及多种维生素等成分，其中，活性最强的是原花青素。原花青素特点如下：清除超氧阴离子自由基和羟基自由基等、中断自由基链式反应；参与磷脂、花生四烯酸的新陈代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤；螯合金属离子，在体内形成惰性化合物；保护和稳定维生素c，有助于维生素c的吸收；来源广，毒副作用低。阿萨伊果粉中含有原花青素、白藜芦醇、花青素、多酚化合物、膳食纤维、氨基酸、多种天然维生素和矿物质等，还含有ω-3脂肪酸，能促进细胞膜之间的流动性，促进营养吸收和废物的排除，抑制肝内脂质及脂蛋白合成，能降低血浆中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白，增加高密度脂蛋白。采用桑椹提取物、蓝莓提取物、葡萄皮提取物和葡萄籽提取物，结合各种提取物之间的成分以及药理特性，选用科学合理的配比，获得抗氧化组合物，提高产品功效以及原料利用率。本发明的目的二：提供一种抗氧化保健食品，包括所述的抗氧化组合物，还包括药学上可接受的辅料。较佳的，按重量份计，包括有以下组分：桑椹提取物20-240份，蓝莓提取物15-190份，葡萄皮提取物25-300份，萄籽提取物10-150份，微晶纤维素12-180份，阿萨伊果粉8-120份，阿斯巴甜2-40份，硬脂酸镁1-30份。较佳的，按重量份计，包括有以下组分：桑椹提取物50-180份，蓝莓提取物45-150份，葡萄皮提取物60-200份，葡萄籽提取物30-120份，微晶纤维素25-130份，阿萨伊果粉20-100份，阿斯巴甜2-30份，硬脂酸镁1-20份。辅料的加入能够提高抗氧化保健食品中的原料颗粒的分散均匀性、流动性、可压性、便于后续的进一步加工处理，还能提升口感，此外，其中的微晶纤维素含有的膳食纤维还能够促进消化和吸收，阿萨伊果粉中的大量维生素能够进一步提高抗氧化保健食品的营养功效。本发明的目的三：提供一种所述的抗氧化保健食品的制备方法，包括有以下步骤：s1桑椹提取物、蓝莓提取物、葡萄皮提取物、葡萄籽提取物、微晶纤维素、阿萨伊果粉、阿斯巴甜分别过40-200目筛，混合制得总混粉；s2向总混粉中喷洒70％食用乙醇，然后过10-40目筛制粒，干燥至颗粒含水量≤5％，制得干颗粒；s3干颗粒与硬脂酸镁混合，制得抗氧化保健食品。较佳的，所述抗氧化保健食品为软胶囊、片剂、粉剂或硬胶囊中的一种。混合前过筛便于产品的混合均匀性，喷洒食用乙醇便于质粒过程的进行，限定干燥颗粒的含水量，提高产品的质量均一性。通过控制抗氧化保健食品的生产过程，进一步提高产品的品质。本发明的目的四：提供一种所述的抗氧化组合物或所述的抗氧化保健食品的应用，用于机体抗氧化。综上所述，本发明具有以下有益效果：1、桑椹提取物、蓝莓提取物、阿萨伊果粉中含有丰富的花青素，能够淬灭自由基，与胶原蛋白有较强的亲和力，能形成一层抗氧化保护膜，保护细胞和组织不被自由基氧化；葡萄皮、阿萨伊果粉中富含白藜芦醇，具有清除自由基、提高组织中sod等抗氧化相关酶的活性、抑制脂质过氧化等作用；葡萄籽、阿萨伊果粉中含有原花青素，能够清除超氧阴离子自由基和羟基自由基等，参与磷脂、花生四烯酸的新陈代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤。通过科学合理的配比，制得抗氧化组合物，用于抗氧化保健食品中，具有较强的抗氧化性；2、桑椹提取物、蓝莓提取物富含维生素c、维生素e等多种维生素，葡萄籽提取物中富含维生素e，提高抗氧化性，而花青素够能协助维生素c、维生素e的吸收并增强其在体内的抗氧化作用，原花青素能够保护和稳定维生素c、促进维生素c的吸收，协同提高抗氧化性；3、桑椹提取物、蓝莓提取物、葡萄皮提取物、葡萄籽提取物、阿萨伊果粉中含有多种矿物质，补充人体所需元素；4、阿萨伊果粉中富含氨基酸、膳食纤维、ω-3脂肪酸，氨基酸能够直接被人体吸收，减轻肠胃消化负担；膳食纤维能够促进肠胃蠕动和消化；ω-3脂肪酸能够促进细胞膜之间的流动性，促进抗氧化物质、矿物质、维生素等营养吸收和废物的排除；5、辅料的加入能够提高抗氧化保健食品中的原料颗粒的分散均匀性、流动性、可压性、便于后续的进一步加工处理，还能提升口感，此外，其中的微晶纤维素含有的膳食纤维还能够促进消化和吸收；6、通过控制抗氧化保健食品的生产过程，进一步提高产品的品质；7、本发明制得的抗氧化组合物和保健食品具有抗氧化、调节机体免疫功能、延缓衰老、缓解疲劳的作用。具体实施方式以下对本发明作进一步详细说明。实施例1抗氧化组合物保健食品的制备：s1原料获取：桑椹提取物经乙醇提取、浓缩、醇沉、浓缩、干燥制得，蓝莓提取物经乙醇提取、浓缩、干燥制得，葡萄皮提取物经乙醇提取，过滤、柱层析、乙醇洗脱、浓缩、干燥制得，葡萄籽提取物经水提、浓缩、乙醇沉淀、浓缩、干燥制得；s2过筛、混合：在十万级生产洁净区内，取20g桑椹提取物、15g蓝莓提取物、25g葡萄皮提取物、10g葡萄籽提取物、12g微晶纤维素、8g阿萨伊果粉和2g阿斯巴甜分别过40目筛，混合15min后获得总混粉；s3制粒、干燥、整粒：向上述混合粉中均匀喷洒70％食用乙醇，制得软材，软材以“手握成团，轻压即散”为度，然后过10目筛制粒，55℃干燥至颗粒含水量≤5％，得到干颗粒，食用乙醇符合gb10343的规定；s4总混：干颗粒与过60目筛的1g硬脂酸镁混合5mim，获得总混颗粒；s5装胶囊：将总混颗粒置胶囊机中装囊，调整规格为0.45g/粒，检查，剔除不合格胶囊；s6分装：将s5中获得的合格胶囊装瓶，60粒/瓶，转出洁净区；s7外包装、成品检验入库：将上述半成品贴签，随机抽取样品检验，合格成品入库。其中，桑椹提取物的质量标准列于表1，蓝莓提取物的质量标准列于表2，葡萄皮提取物的质量标准列于表3，葡萄籽提取物的质量标准列于表4，阿萨伊果粉的质量标准列于表5，微晶纤维素符合gb1886.103食品安全国家标准食品添加剂微晶纤维素要求，阿斯巴甜gb1886.47食品安全国家标准食品添加剂天门冬酰苯丙氨酸甲酯(又名阿斯巴甜)要求，硬脂酸镁符合gb1886.91食品安全国家标准食品添加剂硬脂酸镁要求，空心胶囊符合《中华人民共和国药典》2015年版四部明胶空心胶囊要求。表1桑椹提取物的质量标准。表2蓝莓提取物的质量标准。项目指标原料来源蓝莓制法经乙醇提取、浓缩、干燥制得提取率(％)10±2感官要求紫色粉末，具有其特殊滋味、气味粒度(目)80花青素(％)≥5.0水分(％)≤5.0灰分(％)≤5.0六六六(mg/kg)≤0.1滴滴涕(mg/kg)≤0.1铅(以pb计)(mg/kg)≤2.0总砷(以as计)(mg/kg)≤1.0总汞(以hg计)(mg/kg)≤0.3菌落总数(cfu/g)≤30000大肠菌群(mpn/g)≤0.92霉菌和酵母(cfu/g)≤50金黄色葡萄球菌≤0/25g沙门氏菌≤0/25g表3葡萄皮提取物的质量标准。表4葡萄籽提取物的质量标准。项目指标原料来源葡萄籽制法经水提、浓缩、乙醇沉淀、浓缩、干燥制得提取率(％)6±1感官要求棕色粉末，具有其特有滋气味粒度(目)80原花青素(uv)(％)≥60.0水分(％)≤5.0灰分(％)≤5.0六六六(mg/kg)≤0.1滴滴涕(mg/kg)≤0.1铅(以pb计)(mg/kg)≤2.0总砷(以as计)(mg/kg)≤1.0总汞(以hg计)(mg/kg)≤0.3菌落总数(cfu/g)≤30000大肠菌群(mpn/g)≤0.92霉菌和酵母(cfu/g)≤50金黄色葡萄球菌≤0/25g沙门氏菌≤0/25g表5阿萨伊果粉的质量标准。实施例2与实施例1的区别在于原料配比不同，s2中的过筛目数为200目，s3中过筛目数为40目。实施例3与实施例1的区别在于原料配比不同，s2中的过筛目数为120目，s3中过筛目数为20目。实施例4-5与实施例1的区别在于原料配比不同。实施例1-5的原料配比列于表6。表6抗氧化组合物的原料。测试包括样品的初始检测、三个月加速试验、毒理学实验、抗氧化功能动物试验、抗氧化功能人体试食试验，具体如下所示。1初始检测和三个月加速试验选取实施例2、3、5，对其进行白藜芦醇、原青花素、重金属、卫生性能的初始检测和三个月加速试验，检测指标列于表7，初始检测结果列于表8，白藜芦醇、原青花素的三个月加速试验结果列于表9，重金属的三个月加速试验结果列于表10，卫生性能的三个月加速试验结果列于表11。表7样品初始检测和三个月加速试验检测指标。表8样品的白藜芦醇、原青花素、重金属、卫生性能的初始检测结果。表9样品的白黎芦醇、原花青素的三个月加速试验结果。表10样品的重金属的三个月加速试验结果。表11样品的卫生性能的三个月加速试验结果。2毒理学实验2.1材料和方法2.1.1样品：选取实施例2，人口服推荐剂量为每日1.8g，成人体重按60kg计算，折合剂量0.03g/kg·bw。2.1.2实验动物及环境：spf级icr种小鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号scxk(湘)2011-0003。spf级昆明种小鼠、sd大鼠和饲料由长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号scxk(湘)2014-0011。实验环境为屏障环境。实验期间实验环境温度22-24℃，湿度54-58％。实验动物使用许可证号为syxk(湘)2015-00120。2.1.3小鼠急性毒性试验：采用最大耐受剂量法，选用体重为18-22g的icr种小鼠20只，雌雄各半。取样品20.00g加蒸馏水至60ml，达最大容许灌胃浓度。给小鼠一日内间隔4小时经口灌胃3次，每次灌胃体积为0.2ml/1og·bw，折合剂量为20.oog/kg·bw。首次灌胃前禁食16小时，灌胃后连续观察两周，记录中毒表现及死亡情况。2.1.4ames试验：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型ta97a、ta98、ta100、ta102四株菌株进行试验。采用多氯联苯(pcb)诱导的大鼠肝微粒体酶(s-9)作为体外代谢活化系统。试验设五个剂量，分别为5000μg/皿、1000μg/皿、200μg/皿、40μg/皿、8μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性突变剂对照。样品配制时，称取样品1.25g加蒸馏水定容至25ml，其浓度为5omg/ml，以此液为原液，取5ml加蒸馏水至25ml配成1omg/ml，取1omg/ml浓度的液体5ml加蒸馏水至25ml,配成2mg/ml，如此类推配成0.4mg/ml和0.08mg/ml浓度组，经0.103mpa，20分钟，灭菌后备用。试验时在顶层琼脂中加入o.1ml试验菌株增菌液、o.1ml受试物溶液和o.5mls-9混合液(当需要代谢活化时)，混匀后倒入底层培养基平板上，37℃培养48小时，计数每皿菌落数。如果受试物的回变菌落数超过自发回变菌落数的2倍以上，并有剂量-反应关系者定为阳性。每个剂量设3个平行皿，整套试验在相同试验条件下重复做一次。2.1.5小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：采用间隔24小时两次经口灌胃法进行试验。取体重为25-30g的昆明种小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。以0.04g/kg·bw剂量的环磷酞胺为阳性对照，蒸馏水为阴性对照。以样品的最大可灌胃浓度和动物最大灌胃体积设置高剂量，试验组高、中、低剂量分别为6.67g/kg·bw、3.33g/kg·bw、1.67g/kg·bw，分别取样品33.35g、16.65g和8.35g加蒸馏水至100ml,配成相应的受试液给小鼠灌胃(0.2ml/log·bw)。末次给样后6小时颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，giemsa染色。光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞(pce)，微核发生率以含微核的pce千分率计。计数200个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值(pce/nce)。用spss软件进行统计分析。2.1.6小鼠精子畸形试验：取体重25-35g的雄性昆明种小鼠25只，随机分为5组，每组5只。以0.04g/kg·bw剂量的环磷酞胺为阳性对照，蒸馏水为阴性对照。以样品的最大可灌胃浓度和动物最大灌胃体积设置高剂量，试验组高、中、低剂量分别为6.67g/kg·bw、3.33g/kg·bw、1.67g/kg·bw，分别取样品33.35g、16.65g和8.35g加蒸馏水至100ml，配成相应的受试液给小鼠灌胃(0.2m1/log·bw)。每日灌胃一次，连续5天，于末次灌胃后的第30天处死动物，取副票涂片，伊红染色，每只动物计数1000个结构完整的精子，计算畸变精子发生率。用spss软件进行统计分析。2.1.730天喂养试验：2.1.7.1剂量组选择与受试物给予方式：取sd大鼠80只，雌雄各半。将实验动物随机分为四组，即对照组及三个受试物组，每组20只，雌雄各半。设低、中、高剂量分别为0.75g/kg·bw、1.50g/kg·bw、3.oog/kg·bw，分别相当于人体推荐剂量的25、50、100倍，低、中、高剂量组受试液配制时分别取样品15.00g、30.00g、60.00g加蒸馏水至200ml，按1.oml/100g·bw体积给大鼠灌胃，对照组给予等体积蒸馏水，每日一次，连续30天。2.1.7.2主要仪器与试剂：主要仪器：sysmexxt-20001全自动血球计数仪，beckmancoulterau680全自动生化分析仪等。主要试剂：总蛋白(tp)、白蛋白(alb)、尿素氮(bun)、血糖(glu)、谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、胆固醇(chol)、甘油三脂(tg)试剂盒购自上海复星长征医学科学有限公司；肌酐(cr)试剂盒购自上海申能一德赛诊断技术有限公司。2.1.7.3实验方法：实验期间所有动物单笼饲养，自由摄食饮水，每天观察动物的活动和生长情况，每周加食2次，记录给食量和剩食量，每周称一次体重，计算进食量和食物利用率，给受试物30天后禁食16小时采血。禁食前和禁食后(采血前)称量动物体重。采血时，每只大鼠摘眼球采集两份血：抗凝血用sysmexxt20001全自动血球计数仪测定血红蛋白(hb)、红细胞压积(hct)，进行红细胞(rbc)、白细胞(wbc)、血小板(plt)计数及wbc分类。非抗凝血分离血清，用beckmancoulterau680全自动生化分析仪测定tp、alb、alt、cr、bun、ast、chol、tg和glu。采血后颈椎脱臼处死动物作大体解剖，称肝、肾、脾、翠丸重量，计算脏/体比值，取肝、肾、脾、胃、十二指肠、翠丸、卵巢作病理切片检查。在对各剂量组动物作大体检查未发现明显病变和生化指标改变时，只进行最高剂量组及对照组动物主要脏器的组织病理学检查，如发现病变则对较低剂量组相应器官及组织进行检查。2.1.7.4实验数据统计：用excel,spss软件进行统计分析。分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用dunnett法进行多个剂量组与一个对照组均数间的两两比较。若方差不齐则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到方差齐的目的，改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采用不要求方差齐性的tamhane’st2检验进行两两比较。2.2结果2.2.1急性经口毒性试验表12样品急性经口毒性试验小鼠体重结果(均值±标准差,g)。性别动物数(只)初始始重一周末体重二周末体重雄1085.3±5.9142.7±11.8196.5±12.8雌1087.3±5.5136.1±6.4171.3±9表13样品小鼠急性毒性试验结果。性别动物数(只)途径剂量(g/kg·bw)死亡数(只)mtd(g/kg·bw)雄10经口20.000＞20.00雌10经口20.000＞20.00由表12、13可见，以20.oog/kg·bw剂量的样品给两种性别的icr种小鼠灌胃后未见明显中毒症状，观察14天无死亡。观察期末将受试动物处死进行解剖检查，肝、脾、肾、胃、肠、心、肺等主要脏器，未见明显异常改变。样品对icr种雌、雄小鼠的最大耐受剂量(mtd)大于20.00g/kg·bw。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的急性毒性分级标准，属无毒级。2.2.2ames试验表14样品ames试验结果(第一次)(均值±标准差,g)。阳性对照:ta97a+59、ta98+s9、ta100+s9采用2-af(剂量：1o.oμg/皿)；ta97a-s9、ta98-s9采用9-芴酮(剂量：0.2μg/皿)；ta100-s9采用nan3(剂量：1.5μg/皿)；ta102+s9采用1,8-二轻蒽醌(剂量：5o.oμg/皿)；ta102-s9采用mmc(剂量：0.5μg/皿)。表4同。表15样品ames试验结果(第二次)(均值±标准差)。由表14、15可见，对ta97a、ta98、ta100、ta102四株试验菌株，加与不加s-9，样品各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，亦无剂量-反应关系。2.2.3小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验表16样品对小鼠骨髓微核发生率的影响。由表16可见，样品各剂量组微核率与阴性对照组比较差异无显著性(p>0.05)，而环磷酞胺组与阴性对照组比较差异有显著性(p<0.01)。样品各剂量组pce/nce比值未少于阴性对照组的20％，表明该样品对小鼠骨髓细胞未见明显毒性。2.2.4小鼠精子畸形试验：表17样品对小鼠精子畸形发生率的影响。由表17可见，样品各剂量组小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较差异无显著性(p>0.05)，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较差异有显著性(p<0.01)。2.2.530天喂养试验30天喂养期间，各组动物生长发育良好，无异常行为和中毒症状，无死亡。2.2.5.1样品对大鼠体重及食物利用率的影响见表18-23。喂养期间，各剂量组雌雄鼠各时点体重、末重和增重、每周及总进食量、每周及总食物利用率与对照组比较差异无显著性(p>0.05)。表18样品对大鼠体重的影响(均值±标准差)。表19样品对大鼠食物利用率(第1周)的影响(均值±标准差)。表20样品对大鼠食物利用率(第2周)的影响(均值±标准差)。表21样品对大鼠食物利用率(第3周)的影响(均值±标准差)。表22样品对大鼠食物利用率(第4周)的影响(均值±标准差)。表23样品对大鼠总食物利用率的影响(均值±标准差)。2.2.5.2样品对大鼠血常规指标的影响见表24-25。各剂量组雌雄大鼠的血红蛋白、红细胞总数、红细胞压积、血小板数、白细胞总数及分类与对照组比较，差异无显著性(p>0.05)。表24样品30天喂养试验血液学检查结果(均值±标准差)。表25样品对大鼠wbc计数及其分类的影响(均值±标准差)。2.2.5.3样品对大鼠生化指标的影响见表26-27。各剂量组雌雄大鼠的总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆固醇、甘油三酷、尿素氮、肌配、血糖与对照组比较均无显著性差异(p>0.05)。表26样品30天喂养试验末期生化检验结果(均值±标准差)。表27样品30天喂养试验末期生化检验结果(均值±标准差)。2.2.5.4样品对大鼠实验末禁食后体重、脏器重量和脏器/体重比值的影响由表28-29可见，各剂量组大鼠的实验末禁食后体重及肝脏、肾脏、脾脏、睾丸的绝对重量和肝/体、脾/体、肾/体、雄鼠睾/体比值与对照组比较，差异无显著性(p>0.05)。表28样品对大鼠实验末禁食后体重及脏器重量的影响(均值±标准差)。表29样品对大鼠脏体比的影响(均值±标准差)。2.2.5.5大体解剖及组织学检查结果2.2.5.5.1大体解剖检查共检查对照组和各剂量组共80只大鼠，雌、雄各半。剖检后肉眼观察，心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、睾丸(卵巢)等主要脏器的色泽、大小、形态结构等均未见明显异常。2.2.5.5.2镜下检查共检查高剂量组与对照组大鼠各20只，雌、雄各半。肝脏：被膜完整，肝小叶结构清楚，其中对照组雌鼠1只肝细胞轻度脂肪变性。肾脏：被膜完整，肾小球、肾小管结构正常。其中高剂量组雌鼠1只肾间质见少量炎性细胞浸润。胃肠：各层结构清楚，粘膜上层完整，粘膜下各层无异常。脾脏：被膜完整，脾小梁结构正常，红、白髓比例正常。卵巢：上皮与白膜正常，各级卵泡发育良好，无异常。睾丸：曲精管内各级生精细胞发育良好，无异常。上述检查结果表明，高剂量组雌、雄大鼠的肝、脾、肾、胃、肠、睾丸(卵巢)均未见明显与试验因素有关的病理组织学变化。2.3小结本实验室条件下，样品对icr种雌、雄小鼠的最大耐受剂量(mtd)大于20.oog/kg·bw，属无毒级。ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性。以0.75g/kg·bw、1.5og/kg·bw、3.oog/kg·bw剂量的样品给大鼠灌胃30天，实验期间，动物生长发育良好，各剂量组体重、增重、食物利用率、血常规指标、血生化指标、脏器重量及脏器/体重比值与对照组比较，无显著性差异(p>0.05)。大体解剖和组织病理检查未见明显与样品有关的异常改变。提示样品30天喂养对大鼠未见明显毒副作用。3抗氧化功能动物试验3.1材料和方法3.1.1样品:实施例3，人体口服推荐剂量为每日1.8g，体重按60kg计算，折合剂量0.03g/kg·bw。3.1.2实验动物：spf级icr雄性8-10月龄小鼠40只，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号为scxk(湘)2011-0003。3.1.3实验环境条件：实验条件为屏障环境，实验期间实验环境温度22-23℃，湿度54-58％。实验动物使用许可证号为syxk(湘)2015-0012号。3.1.4主要仪器与试剂：动物台秤、恒温水浴箱、紫外可见分光光度计、离心机等；丙二醛(mda)、蛋白质拨基、超氧化物歧化酶(sod)、还原性谷胱甘肽(gsh)测试盒由南京建成生物工程研究所提供。3.1.5剂量分组及受试物给予：实验设三个剂量组和一个溶剂对照组。样品低、中、高剂量分别为0.1g/kg·bw、0.30g/kg·bw、0.90g/kg·bw(分别相当于人体推荐量的5、10、30倍)。受试物配制时，分别取样品内容物1.50g、3.00g、9.00g加蒸馏水定容至200ml，对照组给予等体积蒸馏水，分别给予受试动物灌胃，灌胃体积为0.2ml/10g·bw，每日1次，连续30天。3.1.6实验方法：采用老龄动物。试验前，将老龄小鼠称重后，采尾尖血20μl加入0.48ml蒸馏水制成4％溶血液，按试剂盒说明书测定溶血液中的mda水平。按mda水平将小鼠分为对照组和三个剂量组。各剂量组小鼠按1.5中的剂量设计给予不同浓度的受试液，对照组予以等体积的溶剂，连续灌胃30天。第31天，采尾尖血测定4％溶血液过氧化脂质降解产物丙二醛(mda)含量、全血抗氧化物质还原性谷胱甘肽(gsh)含量；摘眼球采血离心，取血清测定蛋白质氧化产物蛋白质羰基含量、抗氧化酶超氧化物歧化酶(sod)活力。3.1.7实验数据统计：用excel、spss软件进行统计分析。用spss软件分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用dunnett法进行多个剂量组与一个对照组均数间的两两比较。若方差不齐则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到方差齐的目的，改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采用不要求方差齐性的tamhane’st2检验进行两两比较。3.1.8结果判定：过氧化脂质含量、蛋白质拨基、抗氧化酶活性、还原性谷胱甘肽四项指标中三项指标阳性，可判定该受试样品抗氧化动物实验结果阳性。3.2结果3.2.1样品对老龄小鼠体重的影响表30样品对老龄小鼠体重的影响。由表30可见，各剂量组实验初始、中期、末期小鼠体重及增重与对照组比较，无显著性差异(p>0.05)。3.2.2样品对老龄小鼠4％溶血液过氧化脂质的影响见表31。经口给予不同剂量的样品30天后，高剂量组试验末溶血液mda水平与对照组比较差异有显著性(p<0.05)。表31样品对老龄小鼠mda含量的影响。3.2.3样品对老龄小鼠血清超氧化物歧化酶(sod)活力的影响见表32。经口给予不同剂量的样品30天后，高剂量组血清sod活力与对照组比较差异有显著性(p<0.05)。表32样品对老龄小鼠血清sod活力的影响。3.2.4样品对老龄小鼠全血还原性谷胱甘肽gsh含量的影响见表33。经口给予不同剂量的样品30天后，高剂量组全血gsh含量与对照组比较有显著性差异(p<0.05)。表33样品对老龄小鼠全血gsh含量的影响。3.2.5样品对老龄小鼠血清蛋白质羰基含量的影响见表34。经口给予不同剂量的样品30天后，各剂量组血清蛋白质拨基含量与对照组比较无显著性差异(p>0.05)。表34样品对老龄小鼠血清蛋白质羰基含量的影响。3.3结论本实验室条件下，经口灌胃给予老龄小鼠0.15g/kg·bw、0.30g/kg·bw、0.90g/kg·bw剂量的样品内容物30天，0.90g/kg·bw剂量能显著降低血中脂质过氧化物(mda)水平(p<0.05)，显著提高血清超氧化物歧化酶(sod)活力(p<0.05)，显著提高血中gsh含量(p<0.05)，各剂量组血清蛋白质羰基与对照组比较无显著性差异(p>0.05)。提示受试样品对动物具有抗氧化功能。4抗氧化功能人体试食试验4.1材料和方法4.1.1样品样品1号、2号，二者在包装、外观、色泽及口感上基本一致，其中一个为实施例4，另一个为安慰剂，人口服每日2次，每次2粒。4.1.2受试者选择4.1.2.1纳入标准:选年龄18-65岁，身体健康状况良好，无明显脑、心、肝、肺、肾、血液疾患，无长期服药史，志愿受试保证配合的人群。4.1.2.2受试者排除标准:4.1.2.2.1妊娠或哺乳期妇女，对保健食品过敏者。4.1.2.2.2合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病患者。4.1.2.2.3短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。4.1.2.2.4不符合纳入标准，未按规定食用受试样品，无法判定功效或资料不全影响功效或安全性判断者。4.1.3实验设计与分组对受试者按mda、sod、gsh-px水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如年龄、性别、生活饮食习惯等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。按双盲法进行试食试验。4.1.4试验方法采用自身和组间两种对照设计。将符合纳入标准并保证配合试验的自愿受试者，按照1.3随机分为试食组和对照组。试验组按推荐服用方法、服用量每日服用受试产品，对照组服用安慰剂，连续90天。试验期间对照组和试食组原生活、饮食不变。4.2观察指标各项指标在试验开始及结束时各检测1次。4.2.1安全性指标4.2.1.1一般状况：试验前详细询问受试者健康状况，了解受试者的精神、睡眠、饮食、大小便等情况，并测定体重、血压、心率等。对所有受试者进行常规体格检查及必要的实验室检查。4.2.1.2血、尿、便常规检查。4.2.1.3肝、肾功能检查。4.2.1.4胸透、心电图、腹部b超检查。4.2.1.5不良反应观察。4.2.2功效指标4.2.2.1过氧化脂质含量:观察试验前后mda的变化及mda下降百分率。mda下降率＝(试验前mda-试验后mda)/试验前mda×100％4.2.2.2超氧化物歧化酶：观察试验前后sod的变化及sod的升高百分率。sod升高率＝(试验后sod-试验前sod)/试验前sod×100％4.2.2.3谷胱甘肽过氧化物酶：观察试验前后gsh-px的变化及gsh-px的升高百分率。gsh-px升高率＝(试验后gsh-px-试验前gsh-px)/试验前gsh-px×100％4.3.数据处理和结果判定凡自身对照资料可以采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t’检验或秩和检验；但变异系数太大(如cv>50)的资料应用秩和检验。在试验前组间比较差异无显著性的前提下，可进行试验后组间比较。各功效观察指标试验前后自身比较和试食后组间比较均有统计学意义，方可判定该指标阳性。过氧化脂质含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项实验中任二项实验结果阳性，可判定该受试样品具有抗氧化功能作用。4.4.结果双盲法观察结束揭晓：服食2号者为样品，服食1号者为安慰剂。4.4.1一般情况：初始试验人群试食组52例，对照组52例，试食前后，受试者精神、睡眠、饮食、大小便状况未见异常。对照组:男/女为11/41，年龄为52.42±6.33岁；试食组：男/女为10/42，年龄为52.17±6.38岁。4.4.2安全性观察4.4.2.1体重、血压、心率、尿常规、大便常规、血常规及生化检测见表35、36。食用受试物90天后，试食组和对照组体重、血压、心率均未见明显异常改变，血常规、尿常规、大便常规及生化指标均在正常范围内，提示样品对机体健康无明显损害。表35试食前后体重、血压、心率、血常规、尿常规、大便常规变化情况(均值±标准差)。表36试食前后生化指标变化情况(均值±标准差)。4.4.2.2心电图、腹部b超、胸透检查，均未见明显异常。4.4.2.3试食期间未见与样品相关的不良反应。4.4.3功效观察试食试验前后血清mda、sod、gsh-px水平变化情况见表37、38试验前，对照组和试食组血清mda、sod水平比较，p值均大于0.05，提示两组之间具有可比性。试验后试食组血清sod及gsh-px活力与对照组试食后及自身试验前比较，差异均有显著性(p<0.05)。试食后试食组mda与对照组及自身试验前比较，差异无显著性(p>0.05)。试食组血清sod较试验前升高11.01％，血清mda较试验前降低2.69％，血清gsh-px活力较试验前升高10.54％。表37试食前后血清mda、sod、gsh-px水平比较(均值±标准差)。表38试食前后血清mda、sod、gsh-px变化率。指标对照组试食组mda降低率(％)0.342.69sod升高率(％)0.1411.01gsh-px升高率(％)1.5010.544.4.4脱失率经过90天试验后，对照组有2例受试者因间断服用受试品无法判断效果被筛除；试食组有2例受试者因间断服用受试品无法判断效果被筛除。最后有效试验人群对照组50例，试食组50例。见表39。表39试验脱失率。组别对照组(例)试食组(例)试食前5252脱失数22脱失率3.85％3.85％4.5.小结受试者服用受试物90天后，结果表明:试食后试食组血清sod、gsh-px活力分别较试验前提高11.01％、10.54％，血清mda较试验前降低2.69％，其中sod活力和血清gsh-px活力与对照组试食后及自身试验前比较，差异均有显著性(p<0.05)。试食前后体重、血压、心率均未见明显异常改变，血常规、尿常规、大便常规、生化检测、心电图、b超、胸透等安全性指标均在正常范围内。试食期间未见与样品相关的不良反应。上述结果提示样品具有抗氧化功能。上述具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。当前第1页12