一种含活性蛋白的乳基婴幼儿配方液态奶及其制备方法与流程

本发明涉及一种含活性蛋白的乳基婴幼儿配方液态奶及其制备方法，属于乳制品技术领域。

背景技术：

目前市面上出售的婴幼儿配方乳以乳粉形式存在的居多，还有少部分是超高温灭菌后的常温贮藏配方液态乳的形式存在。在将新鲜乳转化为配方乳粉或常温储藏的配方液态奶的过程中，诸多热处理操作会导致乳中的热敏型的活性蛋白质发生变性而丧失其生物活性，如乳铁蛋白、免疫球蛋白、乳凝集素、乳过氧化物酶等等。而这些活性蛋白往往在增强婴幼儿免疫力、提高认知能力、增强体质、降低哮喘等疾病发病率方面发挥重要作用，这些活性蛋白的损失大大降低了乳的其营养价值，且现有的婴幼儿配方乳产品加工手段几乎难以保留鲜乳中的这些活性蛋白。

现代营养学公认，母乳是婴幼儿最理想的天然食品，也是婴幼儿配方奶粉的黄金标准。但是由于工作、健康等原因，大部分母亲不能保证正常的母乳喂养，因此以牛乳、羊乳为代表的婴幼儿配方奶粉成为当代新生的主要饮食和营养来源。

但是市面上常见的婴幼儿配方奶粉或者常温婴幼儿配方液态乳的营养价值无法与母乳相比，因为母乳中天然含有丰富的免疫活性物质，例如免疫球蛋白(包括iga、igg和igm等)、乳铁蛋白、酶类以及种类高达几百种的低丰度蛋白，这些低丰度蛋白往往具备调节免疫、促进代谢等生活活性。iga作为人体黏膜免疫的重要抗体之一，在保护新生儿抵御肠道和呼吸道病原微生物感染中起着重要作用(hanson和korotkova，2002)。igg和igm在婴儿肠黏膜防御中也发挥着重要作用，igg可与病毒结合，诱惑病原体或阻止其黏附在黏膜表面(robert-guroff，2000)。现阶段，婴幼儿配方粉一般只能在宏量营养素上尽量模拟母乳，比如调整酪蛋白与乳清蛋白的比例，调节脂肪酸的种类，但却很难在免疫球蛋白等活性蛋白及其他重要功能的低丰度蛋白层面去模拟母乳。troost等人(2001)和jasion等人(2015)的研究表明，乳中存在的乳铁蛋白和免疫球蛋白能够避开肠胃的消化作用，在维持机体抗菌、消炎、调高机体免疫力等方面发挥着十分重要的作用。

现阶段，热处理是生鲜乳在加工过程中最常见的加工方式，生鲜乳中活性蛋白的加工失活是目前乳制品工业中的重要难题。乳制品中的乳铁蛋白、免疫球蛋白等往往是热敏感型的。婴幼儿配方粉的制备往往需要经过一系列的高温处理，如灭菌、浓缩、喷雾干燥等。而常温婴幼儿配方液态乳也要经过超高温灭菌的环节。在这些热处理过程中，其功能蛋白的生物活性几乎全部丧失，并造成乳清中大量低丰度蛋白种类减少，导致其营养价值大大降低。最近，张艳杰公开了一种含乳铁蛋白和益生菌的婴幼儿配方奶粉及其制备方法(公开号：cn108029768a)，其中仍需人工额外添加乳铁蛋白。市售的乳铁蛋白多为提纯过的进口产品，极为稀缺且价格昂贵，且在提纯过程中容易发生蛋白变性，从而丧失其生物活性。

因此，如何开发一款方便饮用、且含有活性蛋白的婴幼儿配方液态奶及其制备方法是本领域亟待解决的一个重要问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种含活性蛋白的乳基婴幼儿液态配方乳的制备方法，所述制备方法包括将液态新鲜牛乳或羊乳与其他营养素进行调配、均质、热杀菌处理，所述热杀菌处理是利用巴氏杀菌72～75℃处理15～20s或63～65℃处理30～40min。

在本发明的一种实施方式中，制备方法包括以下步骤：

(1)取新鲜牛乳或羊乳，测定其蛋白质、乳糖、脂肪和矿物质的含量；

(2)按照食品安全国家标准gb10765-2010计算婴幼儿配方液态乳中所需营养素的含量；

(3)将浓缩乳清蛋白粉、植物调和油、乳糖、磷脂、dha和ara使用纯净水混合溶解，进行充分搅拌后与新鲜牛乳或羊乳混合均匀，使得到的混料中浓缩乳清蛋白粉、植物调和油、乳糖、磷脂、dha和ara含量符合步骤(2)中的计算结果；

(4)将复配矿物质预混料、复配维生素预混料分别用纯净水溶解，分步添加到步骤(3)得到的混料中进行充分混合，添加复配矿物质、复配维生素时，混合时间均不低于15min，再添加肌醇、胆碱、牛磺酸，充分混合，使得到的混料中复配矿物质、复配维生素、肌醇、胆碱、牛磺酸含量符合步骤(2)中的计算结果；

(5)均质；

(6)将均质过的液态奶进行杀菌，利用巴氏杀菌72～75℃处理15～20s或63～65℃处理30～40min。

在本发明的一种实施方式中，所述活性蛋白指的是乳铁蛋白、免疫球蛋白igg、iga、igm、乳过氧化物酶、补体蛋白c3、核糖核酸酶、脂质运载蛋白-2、乳凝集素或其结合。

在本发明的一种实施方式中，所述营养素包括浓缩乳清蛋白粉、植物调和油、乳糖、磷脂、dha、ara、复配矿物质和复配维生素。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)通过电感耦合等离子体质谱icp-ms测定牛乳或羊乳中矿物质的含量。

在本发明的一种实施方式中，添加乳清蛋白粉使乳中乳清蛋白与酪蛋白比例≥3:2，乳中蛋白比例接近母乳中的蛋白比例，总蛋白含量在1.0～2.5g/100ml。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)与步骤(4)中的纯净水温度为40～50℃。

在本发明的一种实施方式中，配方乳中所需添加的乳清蛋白粉、植物调和油、矿物质、维生素、肌醇、胆碱、牛磺酸、dha和ara符合食品安全国家标准gb10765-2010规定的标准。

在本发明的一种实施方式中，均质条件为20～30mpa，均质1～2次。

在本发明的一种实施方式中，杀菌后无菌灌装，冷链运输或低温冷藏。

本发明的另一个目的是提供上述提高活性蛋白保留率的乳基婴幼儿配方液态奶制备方法制备得到的婴幼儿配方奶。

本发明的另一个目的是提供上述提高活性蛋白保留率的乳基婴幼儿液态配方乳制备方法在食品领域中的应用。

本发明的有益效果：

本发明以新鲜乳(牛乳或羊乳)为主要原料，通过调节乳中蛋白，脂肪和碳水化合物比例，添加维生素和矿物质，来更好地模拟母乳配方。此外，本发明对比了不同的热处理工艺对乳中活性蛋白的影响，最终选择巴氏杀菌的方法完成对乳的杀菌，从而开发了一款具有活性蛋白的巴氏杀菌型的婴幼儿液态配方乳。

附图说明

图1：(a)液态婴幼儿配方乳制备过程及(b)液质蛋白组(lc-ms/ms)实验流程。

图2：不同的热处理方式对鲜牛乳中活性蛋白保留率的影响。

图3：不同的热处理方式对鲜羊乳中活性蛋白保留率的影响。

图4：不同热处理后鲜牛乳中乳清蛋白的电泳图谱。

图5：不同热处理后的婴配液态奶中乳清蛋白组的热图(a)和主成分分析图(b)。

图6：高温组处理(e,u,s)与低温处理组(l,h)样品中乳清蛋白组火山图(p＜0.05)。

具体实施方式

本发明的实施方式在于更好地解释发明，并非限制本发明的保护范围。本领域的技术人员应该知道，按照本发明说明书的步骤是可以完整无误地实施本发明。如若因为奶源不同(如非鲜奶及乳的产地)而导致活性蛋白保留率有略微差异不应该作为本发明技术方案不一致的理由。

液态婴幼儿配方乳制备过程及液质蛋白组(lc-ms/ms)实验流程如图1所示。

实施例1

一种含有活性蛋白的较大婴儿(6-12个月)牛乳基液态配方奶

以6～12个月的婴儿营养素需求为标准，以新鲜牛乳、浓缩乳清蛋白粉、植物调和油、乳糖为主要原料，添加复合维生素、矿物质、牛磺酸、肌醇、胆碱等。按重量百分比计包括以下组分：鲜牛乳25％、浓缩乳清蛋白粉0.95％、乳糖5.75％、植物调和油2.58％(按质量百分比计，包括以下原料组分：大豆油45％、玉米油40％、低芥酸菜籽油5％、高油酸葵花籽油5％、椰子油5％)、复配矿物质0.13％(按质量百分比计，包括以下原料组分：无水硫酸铜0.62％、碘酸钾5.40％、硫酸亚铁16.86％、硫酸镁49.35％、硫酸锌7.33％)、复配维生素0.48％(按质量百分比计，包括以下原料组分：醋酸视黄酯1.23％、胆钙化醇0.71％、α-醋酸生育酚4.58％、植物甲萘醌0.16％、硝酸硫胺素0.15％、核黄素0.07％、盐酸吡哆醇0.12％、l-抗坏血酸钠66％、d-泛酸钙0.62％、d-生物素0.31％、叶酸0.17％、烟酰胺0.94％、氰钴胺0.31％、叶黄素0.94％)、二十二碳六烯酸(dha)0.18％(以纯品计)、花生四烯酸(ara)0.22％(以纯品计)、胆碱0.015％和纯净水。

主要包括以下几个步骤：

步骤1：取新鲜牛乳，测量乳中的蛋白质、乳糖、乳脂以及矿物质；

步骤2：以6～12个月的婴儿的营养素需求计算婴幼儿配方乳中宏量营养素的含量；

步骤3：浓缩乳清蛋白粉、植物调和油、乳糖、磷脂、dha和ara使用40～50℃的纯净水混合溶解，进行充分搅拌；

步骤4：将复配矿物质预混料、复配维生素预混料分别在各专用容器中用40～50℃的纯净水溶解，分步添加到步骤1的混料中进行充分混合，复配矿物质和复配维生素添加混合时间应≥15min，再添加肌醇、胆碱、牛磺酸，充分混合；

步骤5：均质：将上述混合物料进行均质，均质压力为25～30mpa，均质1～2遍；

步骤6：将均质过的液态乳进行杀菌(75℃，15s)；

步骤7：无菌灌装后冷链运输、低温冷藏(4℃条件下)。

实施例2

一种含有活性蛋白的幼儿(12～24个月)牛乳基液态配方奶

以12～24个月的幼儿营养素需求为标准，以新鲜牛乳、浓缩乳清蛋白粉、植物调和油、乳糖为主要原料，添加复合维生素、矿物质，牛磺酸、肌醇、胆碱等。按重量百分比计包括以下组分：鲜牛乳25％、浓缩乳清蛋白粉1.35％、乳糖8.35％、植物调和油2.28％(按质量百分比计，包括以下原料组分：大豆油45％、玉米油40％、低芥酸菜籽油5％、高油酸葵花籽油5％)、复配矿物质0.13％(按质量百分比计，包括以下原料组分：无水硫酸铜0.62％、碘酸钾5.40％、硫酸亚铁16.86％、硫酸镁49.35％、硫酸锌7.33％)、复配维生素0.48％(按质量百分比计，包括以下原料组分：醋酸视黄酯1.23％、胆钙化醇0.71％、α-醋酸生育酚4.58％、植物甲萘醌0.16％、硝酸硫胺素0.15％、核黄素0.07％、盐酸吡哆醇0.12％、l-抗坏血酸钠66％、d-泛酸钙0.62％、d-生物素0.31％、叶酸0.17％、烟酰胺0.94％、氰钴胺0.31％、叶黄素0.94％)、二十二碳六烯酸(dha)粉末0.18％、花生四烯酸(ara)粉末0.22％、胆碱0.015％和纯净水。

主要包括以下几个步骤：

步骤1：取新鲜牛乳，测量乳中的蛋白质、乳糖、乳脂以及矿物质；

步骤2：以6～12个月的婴儿的营养素需求计算婴幼儿配方乳中宏量营养素的含量；

步骤3：浓缩乳清蛋白粉、植物调和油、乳糖、磷脂使用40～50℃的纯净水混合溶解，进行充分搅拌；

步骤4：将复配矿物质预混料、复配维生素预混料分别在各专用容器中用40～50℃的纯净水溶解，分步添加到步骤1的混料中进行充分混合，复配矿物质和复配维生素添加混合时间应≥15min，再添加肌醇、胆碱、牛磺酸、dha和ara，充分混合；

步骤5：均质：将上述混合物料进行均质，均质压力为20-30mpa，均质1-2遍；

步骤6：将均质过的液态乳进行杀菌(75℃，15s)；

步骤7：无菌灌装后冷链运输、低温冷藏(4℃条件下)。

实施例3

一种含有活性蛋白的较大婴儿(6-12个月)羊乳基液态配方奶

以6～12个月的婴儿营养素需求为标准，以新鲜羊乳、浓缩乳清蛋白粉、植物调和油、乳糖为主要原料，添加复合维生素、矿物质、牛磺酸、肌醇、胆碱等。按重量百分比计包括以下组分：鲜羊乳25％、浓缩乳清蛋白粉0.95％、乳糖5.75％、植物调和油2.58％(按质量百分比计，包括以下原料组分：大豆油45％、玉米油40％、低芥酸菜籽油5％、高油酸葵花籽油5％、椰子油5％)、复配矿物质0.13％(按质量百分比计，包括以下原料组分：无水硫酸铜0.62％、碘酸钾5.40％、硫酸亚铁16.86％、硫酸镁49.35％、硫酸锌7.33％)、复配维生素0.48％(按质量百分比计，包括以下原料组分：醋酸视黄酯1.23％、胆钙化醇0.71％、α-醋酸生育酚4.58％、植物甲萘醌0.16％、硝酸硫胺素0.15％、核黄素0.07％、盐酸吡哆醇0.12％、l-抗坏血酸钠66％、d-泛酸钙0.62％、d-生物素0.31％、叶酸0.17％、烟酰胺0.94％、氰钴胺0.31％、叶黄素0.94％)、二十二碳六烯酸(dha)0.18％(以纯品计)、花生四烯酸(ara)0.22％(以纯品计)、胆碱0.015％和纯净水。

主要包括以下几个步骤：

步骤1：取新鲜羊乳，测量乳中的蛋白质、乳糖、乳脂以及矿物质；

步骤2：以6～12个月的婴儿的营养素需求计算婴幼儿配方液态奶中宏量营养素的含量；

步骤3：浓缩乳清蛋白粉、植物调和油、乳糖、磷脂、dha和ara使用40～50℃的纯净水混合溶解，进行充分搅拌；

步骤4：将复配矿物质预混料、复配维生素预混料分别在各专用容器中用40～50℃的纯净水溶解，分步添加到步骤1的混料中进行充分混合，复配矿物质和复配维生素添加混合时间应≥15min，再添加肌醇、胆碱、牛磺酸，充分混合；

步骤5：均质：将上述混合物料进行均质，均质压力为25～30mpa，均质1～2遍；

步骤6：将均质过的液态奶进行杀菌(65℃，30min)；

步骤7：无菌灌装后冷链运输、低温冷藏(4℃条件下)。

实施例4

以实施例1中获得的婴儿液态配方奶为例，再次使用酶联免疫的方法比较不同工艺生产的婴儿配方奶中的免疫球蛋白(iga、igg和igm)和乳铁蛋白含量，同时采用sds-凝胶电泳和lc-ms/ms蛋白组学手段鉴定乳清蛋白中低丰度蛋白的种类及含量变化。具体测试过程和结果分析如下：

(一)实验原料、试剂和仪器

鲜乳购于江苏省无锡市天资乳业有限公司，免疫球蛋白试剂检测盒(elisakit)购自美国bethyl公司，lc-ms/ms所用液相色谱为美国thermofisherscientificultimate3000毛细管高效液相色谱仪，质谱为thermofisherscientificqexactive电喷雾-组合型离子阱orbitrap质谱仪。所用毛细管液相色谱柱均为pepmaprplcc18预装柱。流动相a：0.1％甲酸，2％acn；流动相b：0.1％甲酸，80％acn；流速：300nl/min。

(二)实验过程

选购市售6种婴幼儿配方乳粉及常温储存型婴幼儿配方液态奶进行免疫球蛋白和乳铁蛋白含量的测定，将乳粉按照相同质量分数的固形物比例溶解于去离子水中后稀释，其中液态乳直接进行500-1000倍稀释(确保在试剂盒检测范围内)，随后进行免疫球蛋白和乳铁蛋白含量的测定。

按照实施例1制备新鲜的液态婴配样品(r组)，进行不同的热处理工艺进行杀菌。杀菌条件分别为65℃，30min(l组)、75℃，15s(h组)、125℃，5s(e组)、135℃，5s(u组)和喷雾干燥(95℃杀菌15min后，喷雾干燥，进风温度185℃，出风温度85℃，s组)。将不同处理组样品经过超高速离心(美国beckmancoulter离心机，100000g，25℃，90min)后得到乳清后进行免疫球蛋白和乳铁蛋白含量测定(每个样品做两个平行孔)，sds凝胶电泳实验，胰蛋白酶(trypsin)酶解和lc-ms/ms蛋白组实验(每个样品做两个平行)。酶解操作如下：

1)取100μg蛋白转移至10kd超滤管中，加入50mmol/lnh4hco3溶液至200μl，于4℃在12000rcf速度下离心10min。

2)加入50mmol/lnh4hco3溶液200μl，于4℃在12000rcf速度下离心10min，并重复操作两次，直至溶液变为无色透明。

3)加入50mmol/lnh4hco3溶液50μl，加入dtt溶液使其终浓度为10mmol/l，于37℃水浴中还原4h。

4)加入iaa溶液使其终浓度为50mmol/l，避光反应40min后，于4℃在12000rcf速度下离心10min。

5)加入50mmol/lnh4hco3溶液100μl，于4℃在12000rcf速度下离心10min。

6)更换新的套管，于超滤管中加入50μl50mmol/lnh4hco3溶液，按照胰蛋白酶与底物质量比为1:100加入胰蛋白酶，37℃酶切4小时，继续按质量比1:100加入胰酶，37℃酶切反应过夜(16h)。

7)于4℃在12000rcf速度下离心10min，加入100μl水，涡旋后，于4℃在12000rcf速度下离心10min，并重复操作一次。

8)酶切后肽段使用自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂。

9)肽段用样品溶解液(0.1％甲酸、2％乙腈)溶解，充分振荡涡旋，13200rpm，4℃离心10min，上清转移到上样管中，等待质谱分析。一级质谱参数：resolution：70,000；agctarget：3e6；maximumit：40ms；scanrange：350到1800m/z；

二级质谱参数：resolution：75,000；agctarget：1e5；maximumit：60ms；

topn：20；nce/steppednce：27。质谱原始文件使用maxquant(1.6.2.10)检索uniprot-bostaurus数据库，鉴定出的蛋白的生物学功能使用uniprot数据进行检索。

由图2和图3可知，鲜乳经过不同的热杀菌处理方式后，其中的免疫相关的活性蛋白的保留率出现显著差异，不同热处理后乳中活性蛋白保留率以鲜牛乳或羊乳中活性蛋白含量为对照计算得到。整体而言，两种巴氏杀菌方式(l组和h组)对活性蛋白的保留率较高，而经过esl(extendedshelflife、延长货架期的巴氏杀菌方式)处理(e组)，uht(ultrahightemperature、超高温灭菌方式)处理(u组)和喷雾干燥处理(s组)后，乳中的免疫球蛋白均检测不到，含量几乎接近为0。因此，本发明所采用的热处理方式为巴氏杀菌，即72～75℃，15～20s或63～65℃，30～35min。

由图4可以发现，e、u和s组处理后，鲜牛乳中乳清蛋白的类型发生了明显变化。其中，乳铁蛋白，牛血清白蛋白和重链免疫球蛋白的条带已经观察不到；此外，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的条带也减轻了许多，尤其是经过了uht处理以后。因此，本发明选用l或者h的热处理方式对牛乳进行杀菌。

由表1可以发现，与不经热处理的婴幼儿配方液态奶初始混合样品相比，经过两种巴氏杀菌制备的婴配终产品中免疫球蛋白和乳铁蛋白的含量有所下降，但均能得到很大程度的保留；但是h组，e组和s组的样品中均不含免疫球蛋白和乳铁蛋白。同时可以发现，从市面上购买的4种婴幼儿配方乳粉(分别为中国伊利公司金领冠1段、德国pronutra⁺公司aptamil2段、荷兰nutricia公司nutrilon1段、爱尔兰惠氏公司启赋2段)，2种常温婴幼儿配方液态奶：美国进口美赞臣公司(meadjohnson&company)enfagrow幼儿配方液态奶和法国进口圣元公司(synutra)布瑞弗尼幼儿配方液态奶以及1种荷兰进口全脂乳粉(dutchcow)经过试验测试，均检测不到具有活性的免疫球蛋白和乳铁蛋白。因此，本发明选用低温热杀菌的方式制备液态婴幼儿配方乳制品。

表1不同处理方式的牛乳基婴配样品与市售6种婴配产品种免疫球蛋白和乳铁蛋白含量比较

注：同一列的不同字母代表显著性差异(p＜0.05)，“-”表示检测不到。

由鉴定到的蛋白质组数据可以发现，经过不同热处理的婴配样品中乳清蛋白的种类发生了很大变化。由主成分分析图可以发现，l组和h组聚集在一起，几乎不能被区分开，而e、u和s组则聚集在一起。为了方便分析，接下来的实验将l和h归为低温处理组，将e、u和s归为高温处理组，进行生物信息学分析。

由图5和图6可以看出，经过高温组处理后，乳清中的热敏性蛋白的含量发生了明显的变化，其中补体蛋白c3、乳铁蛋白、叶酸受体蛋白、脂质运载蛋白等的含量发生了显著的下降。同时经过高热处理后的乳清中也有一些蛋白的丰度增加了，比如α酪蛋白和β酪蛋白，可能是因为加热过程中这些蛋白以二硫键的形式与乳清中的蛋白发生了键合作用而导致的。

表2列出了经过高温处理后，乳中含量下降以及缺少损失的低丰度乳清蛋白，这些蛋白主要包含酶、补体蛋白、结构蛋白等，涉及催化、免疫、黏合等诸多生理活动。结果表明，使用本发明采用热处理方法制备的婴幼儿配方液态奶保留了含量较高的活性蛋白，如免疫球蛋白、乳铁蛋白、补体蛋白、乳凝集素等。

表2高温处理组与低温处理组蛋白含量对比

注：“-”表示不适用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。