本发明涉及水产食品保鲜技术领域，尤其涉及一种红鳍东方鲀生物保鲜剂及其制备方法与应用。
背景技术：
红鳍东方鲀，属硬骨鱼纲，鲀形目，鲀亚目，鲀科，东方鲀属。红鳍东方鲀以其高营养高品质的特点而深受消费者的喜爱，具有较大的市场潜力。目前我国的河鲀鱼资源丰富，随着市场的开放，国内对于河豚鱼需求量增加，生鲜河豚鱼的储运保鲜十分重要，河豚鱼在贮运过程中新鲜度的控制对于未来河豚鱼贮藏与运输产业的发展有着重要意义，也有利产业的进一步扩大发展。
冻藏作为一种常用的水产品保鲜方式，使水产品中90％以上水分冻结，酶活性和微生物生长几乎完全受到抑制，从而使其得以长期保藏。然而，水产品在冻藏过程中会出现品质下降、干耗、蛋白变性、脂肪氧化等现象。镀冰衣作为一种有效的减少干耗，保护水产品的贮藏手段，被广泛应用于水产品冷冻保存中。镀冰衣在冻藏期间能有效减缓质构的劣变，但随着贮藏时间的延长，简单镀冰衣水产品通常出现颜色变化，蛋白质氧化、品质明显下降等现象。此外，随着人们健康意识逐渐加深，开始关注保鲜剂成分残留问题，因此化学保鲜这一方法的发展受到一定的限制。天然生物保鲜剂凭借安全健康、水溶性好，对水产品品质影响小，能保持水产品较好的风味而更受欢迎。目前还没有红鳍东方鲀天然保鲜剂及其应用的报道。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种红鳍东方鲀生物保鲜剂及其制备方法与应用。本发明实施例提供的以鱼皮为原料的红鳍东方鲀肉的冷冻镀冰衣贮藏保鲜方法，是发明人在大量研究的基础上，结合红鳍东方鲀的特点，利用加工的副产物鱼皮为原料，应用生物酶解技术制备了具有抗氧化和抗冻功能的鱼皮酶解产物蛋白肽，本发明提供的鱼皮酶解产物生物保鲜剂应用于镀冰衣的红鳍东方鲀中，红鳍东方鲀肉冻藏12个月后，产品品质保持较好的水平，感官评价保持新鲜红鳍东方鲀肉的94％以上，显著优于纯水镀冰衣的红鳍东方鲀肉。
本发明的一方面提供一种红鳍东方鲀生物保鲜剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)，将冷冻鱼皮进行解冻，清洗后打浆，然后加水，在100～121℃下煮制；
步骤2)，降温至65～75℃，超声处理，然后加入复合蛋白酶进行酶解，即得。
根据本发明的一些优选实施方式，所述冷冻鱼皮为冷冻罗非鱼鱼皮。发明人以特定鱼皮为原料，经过大量的实验，意外开发了一种具有对红鳍东方鲀具有很好抗冻功能的鱼皮蛋白肽液保鲜剂及成套制备方法。
根据本发明的一些优选实施方式，步骤1)中，所述解冻的温度为10～12℃；和/或，所述加水的量为鱼皮重量的3.5～4.5倍；和/或，所述煮制的时间为60～120min。
根据本发明的一些优选实施方式，步骤2)中，所述超声处理的频率为40～60kh，时间为15～25min。
根据本发明的一些优选实施方式，步骤2)中，所述复合蛋白酶按照所述冷冻鱼皮重量的0.1～0.3％加入；和/或，所述酶解的温度为50～60℃，时间为0.5～1.0h。
根据本发明的一些优选实施方式，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，优选的，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1～2：1：1～2；和/或，所述碱性蛋白酶为alcalase2.4l,来源于地衣芽孢杆菌；所述中性蛋白酶为来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶。根据本发明的一些优选实施方式，所述酶解后还包括以下步骤：冷却至室温，在4000～5000g条件下离心3～8min，收集上清液，将蛋白含量调节至1.5～2％，冷却至0～4℃。
本发明另一方面提供一种红鳍东方鲀生物保鲜剂，采用所述的制备方法得到的红鳍东方鲀生物保鲜剂
本发明再一方面提供所述制备方法得到的生物保鲜剂或所述的生物保鲜剂在红鳍东方鲀肉的冷冻镀冰衣贮藏保鲜中的应用。
根据本发明的一些优选实施方式，鲜活红鳍东方鲀剪断鱼体头部后方动脉进行放血，然后去除内脏，用水漂洗后沥干，经过-35～45℃冷冻3～5h，将冷冻的红鳍东方鲀浸没于所述生物保鲜剂中10～15s，冰衣含量控制在15～20％，得到镀冰衣的红鳍东方鲀；然后将镀冰衣的红鳍东方鲀装入封口袋中，真空包装在-18～-23℃下冻藏。
本发明的有益效果至少在于：(1)本发明利用鱼皮经过特定的生物酶解处理，开发用于红鳍东方鲀的天然抗冻保鲜剂；(2)鱼皮进行打浆处理，然后进行100-121℃处理，利用蛋白酶直接酶解，蛋白酶的总使用量只有鱼皮重量的0.1-0.3％。酶解过程没有添加如何化学物质；(3)开发的产品安全，本发明采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解获得特定功能的鱼皮蛋白肽，为100％鱼皮蛋白肽；(4)本发明开发的鱼皮蛋白肽生产工艺简单，不经过分离纯化，生产成本低，具有较好的抗冻功能。(5)本发明开发鱼皮蛋白肽液用于红鳍东方鲀的贮藏保鲜，具有显著的保鲜效果，产品贮藏12个月后，产品感官品质保持在94％以上。(6)本发明开发的蛋白肽液，能广泛作为水产食品天然保鲜剂。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
本发明中，所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。以下实施例中：所用碱性蛋白酶为alcalase2.4l,来源于地衣芽孢杆菌；中性蛋白酶为来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶。
实施例1
本实施例提供一种红鳍东方鲀保鲜方法，包括以下步骤：
1)选用冷冻鱼皮50克，在10-12℃条件下进行解冻，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮,鱼皮清洗后用打浆机将鱼皮打成浆，加入鱼皮重量3.5倍的水，在110℃的条件下煮制120分钟。然后将温度调整到65℃，利用超声波发生器经超声波(频率为60kh)处理15-25分钟，得到鱼皮浆液。
2)按照鱼皮重量0.1％的重量百分比比例向(1)中加入复合蛋白酶进行酶解，蛋白酶(碱性蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶)组成，它们之间的质量比为1：1：2)，在50℃的条件下进行酶解反应0.5h，冷却至室温，在5000g条件下离心5分钟，收集上清液，将蛋白含量调节到1.5％，冷却至0-4℃。
3)鲜活红鳍东方鲀剪断鱼体头部后方动脉进行放血，随后去内脏，用水漂洗后沥干，经过-40℃液体冷冻4小时，将冷冻的红鳍东方鲀浸没于步骤(2)0℃的液体中15s，冰衣含量为18％，得到镀冰衣的红鳍东方鲀。
4)镀冰衣的红鳍东方鲀装入聚乙烯封口袋中，真空包装置于-18至-23℃冷库中冻藏。冷冻12个月。
实施例2
本实施例提供一种红鳍东方鲀保鲜方法，包括以下步骤：
1)选用冷冻罗非鱼鱼皮500克，在10-12℃条件下进行解冻，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮,鱼皮清洗后用打浆机将鱼皮打成浆，加入鱼皮重量4.0倍的水，在121℃的条件下煮制60分钟。然后将温度调整到75℃，利用超声波发生器经超声波(频率为40kh)处理25分钟，得到鱼皮浆液。
2)按照鱼皮重量0.2％的重量百分比比例向(1)中加入复合蛋白酶进行酶解，蛋白酶(碱性蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶)组成，它们之间的质量比为2：1：1)，在60℃的条件下进行酶解反应1.0h，冷却至室温，在4000g条件下离心8分钟，收集上清液，将蛋白含量调节到2％，冷却至0-4℃；
3)鲜活红鳍东方鲀剪断鱼体头部后方动脉进行放血，随后去内脏，用水漂洗后沥干，经过-40℃冷冻5小时，将冷冻的红鳍东方鲀浸没于步骤(2)0℃的液体中12s，冰衣含量控制在15-18％，得到镀冰衣的红鳍东方鲀。
4)镀冰衣的红鳍东方鲀装入聚乙烯封口袋中，真空包装置于-18至-23℃冷库中冻藏，冷冻12个月。
实施例3
本实施例提供一种红鳍东方鲀保鲜方法，包括以下步骤：
1)选用冷冻罗非鱼鱼皮1000克，在10-12℃条件下进行解冻，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮,鱼皮清洗后用打浆机将鱼皮打成浆，加入鱼皮重量4.5倍的水，在100℃的条件下煮制120分钟。然后将温度调整到75℃，利用超声波发生器经超声波(频率为60kh)处理15分钟，得到鱼皮浆液。
2)按照鱼皮重量0.3％的重量百分比比例向(1)中加入复合蛋白酶进行酶解，蛋白酶(碱性蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶)组成，它们之间的质量比为1：1：1)，在55℃的条件下进行酶解反应1.0h，冷却至室温，在5000g条件下离心4分钟，收集上清液，将蛋白含量调节到2％，冷却至0-4℃；
3)鲜活红鳍东方鲀剪断鱼体头部后方动脉进行放血，随后去内脏，用水漂洗后沥干，经过-40℃冷冻5小时，将冷冻的红鳍东方鲀浸没于步骤(2)0℃的液体中15s，冰衣含量控制在20％，得到镀冰衣的红鳍东方鲀。
4)镀冰衣的红鳍东方鲀装入聚乙烯封口袋中，真空包装置于-18至-23℃冷库中冻藏，冷冻12个月。
对比例1
本对比例提供镀茶多酚液冰衣的红鳍东方鲀的镀制方法均同实施例2(镀鱼皮蛋白肽液冰衣的红鳍东方鲀)，不同之处在于所镀液体为2％茶多酚液。
对比例2
本对比例提供镀纯水冰衣的红鳍东方鲀的镀制方法均同实施例2(镀鱼皮蛋白肽液冰衣的红鳍东方鲀)，不同之处在于所镀液体为纯水。
实验例1红鳍东方鲀品质的测定
1、蒸煮损失率的测定
红鳍东方鲀解冻后，称一定重量的鱼肉装入保鲜袋中，排出空气并封口，于85℃水浴锅中煮20min后取出，室温冷却10min，用滤纸擦干后再次称重，计算蒸煮损失率。蒸煮损失率(％)＝(蒸煮前鱼肉重-蒸煮后鱼肉重)/蒸煮前鱼肉重*100。
2、二硫键含量的测定参照benjakul等人(foodchemistry,2003,80(4):535-544.)的方法。二硫键含量计算公式为:二硫键含量＝a×d/(c×b)，其中a表示吸光值，b表示待测液蛋白浓度(mg/ml)，c表示摩尔吸收系数，其值为13600mol-1·cm-1·l，d为稀释倍数，本实验为1.25。
3、羰基含量的测定：
羰基含量的测定使用dnph法(oliver，1987)。将1ml肌原纤维蛋白溶液(2mg/ml)中加入等体积的10mmdnph-hcl溶液于暗处反应1h。反应完毕后加入10％(w/v)三氯乙酸溶液终止反应并在10,000g条件下离心5min。弃去上清液后，沉淀中未反应的dnph用乙醇/乙酸乙酯(1：1，v/v)溶液洗涤三次。洗涤后的沉淀用3ml6m盐酸胍溶解并于37℃水浴锅中孵育15min。待溶液恢复至室温后，在370nm条件下测定溶液的吸光度值(a370)。使用2,4-二硝基苯腙的摩尔消光系数(22,000m-1cm-1)计算羰基含量，羰基含量表示为nmol/mg蛋白。
4、参照sc/t3032-2007标准水产品中挥发性盐基氮的方法，采用半微量蒸馏法测定挥发性盐基氮。称取5.00g绞碎的鱼肉置于100ml的烧杯中，加入100ml蒸馏水，搅拌30min后用中速滤纸过滤，收集滤液。取5ml滤液与5ml10g/l氧化镁混悬液在消化管中迅速混合，以盛有10ml20g/l硼酸及5-6滴甲基红-次甲基蓝混合指示剂的锥形瓶作为接受器，利用凯氏定氮仪蒸馏5min。用0.010mol/l的盐酸标准溶液滴定吸收液，以蓝紫色作为滴定终点。同时，以等量蒸馏水替代滤液进行空白试验。
5、参照fan等(foodchemistry,2008,108(1):148–153.)的方法测定k值。取1.00g绞碎的鱼肉置于研钵中，加入2ml10％冷高氯酸研磨，在6000rpm的条件下离心5min，上清液留存待用，残渣用2ml5％冷高氯酸洗涤并离心两次，合并三次上清液。用10mol/lnaoh溶液、1mol/lnaoh溶液及5％的高氯酸溶液调节上清液ph值至6.40±0.05，6000rpm离心5min，残渣用ph6.4的高氯酸洗涤，合并上清液并定容至10ml。样液经0.22μm的水系滤膜过滤后，利用高效液相色谱仪测定，所用色谱柱为cosmosil5c18-paq(4.6×250mm)，流动相为ph6.8的磷酸盐缓冲液，检测波长为254nm，进样量为50μl，流速为1ml/min。根据标准曲线及峰面积计算atp关联物的浓度。k值的计算公式如下：
6、感官评价的测定
任意选红鳍东方鲀5条，由受专门培训的感官评定小组(15人)根据表1对鱼肉感官品质综合评分，最后取平均值。以五项指标成绩加和作为最终感官评价结果，25表示绝对新鲜，12表示已发生较明显的品质劣变。
表1红鳍东方鲀感官评价标准
本实验例对不同处理鱼肉在-18至-23℃冻藏12个月后的主要品质指标进行比较结果见表2。
表2不同处理鱼肉在-18至-23℃冻藏12个月后主要品质指标比较
上述结果说明，本发明实施例1-3制得的红鳍东方鲀生物保鲜剂及利用其进行镀冰衣的红鳍东方鲀经过12个月冻藏后，(如实施例2)其感官评价达到23.7分，感官品质保持在94％以上，蒸煮损失率低于12％，二硫键含量小于3.4mol/105g，羰基含量小于1.5nmol/mg蛋白，挥发性盐基氮小于8mg/100g，显著优于纯水冰衣组和不镀冰衣组，也优于镀2％茶多酚液冰衣组。可见本发明开发的鱼皮生物保鲜剂能够显著延长红鳍东方鲀的保存期，并在抗氧化和抗冻方面效果显著。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。