一种在制作褐色乳酸菌饮料时提高产酸速度的方法与流程

[0001]
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种在制作褐色乳酸菌饮料时提高产酸速度的方法。


背景技术：

[0002]
褐色乳酸菌饮料是一种经美拉德反应后，由干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌或瑞士乳杆菌等菌株发酵，再以白砂糖、柠檬酸等调酸均质而成的高糖高酸、低粘度的活性乳酸菌饮料。由于褐色乳酸菌饮料在后期工艺中需要进行二次调配工艺，对乳酸菌发酵所产乳酸进行了稀释，因而褐色乳饮料为获得较高的酸度往往需要进行较长时间的发酵以提高发酵基料酸度。长时间发酵对设备具有较高要求、发酵过程控制更加困难，且水电能能耗较高，造成生产成本的升高。如何提升乳酸菌发酵产酸速度，对于简化褐色乳酸菌饮料生产过程及控制生产成本，具有较大的应用价值。
[0003]
目前对提高乳酸菌产酸能力的研究主要集中在培养基的研究，对培养方法的研究还很少。如现有技术公开的一种乳酸菌发酵培养基及高产量生产乳酸的工艺（申请公布号cn105087680a），采用传统的改进培养基和工艺的方法，虽然可提高乳酸产量，但要经过种子培养和二级培养，因此生产周期长，成本高。如现有技术公开了一种提高乳酸菌生物量及产酸量的方法（授权公告号：cn 105802881 b，授权公告日：2020.03.31），该方法在乳酸菌发酵的过程中，利用超声作为辅助手段提高乳酸菌生物量和产酸量。使用该方法使乳酸菌生物量增加了12%
ꢀ-
55%，产酸量提高了15%
ꢀ-ꢀ
60%，到达最高产酸量的时间缩短了0 .5
ꢀ-ꢀ
3 h。虽然使用了超声波处理，但对缩短发酵时间的效果也并不显著，仅只能缩短0 .5
ꢀ-
3 h，因此乳酸菌培养的方法也很难改进。因此，研究一种简便易行能在短时间提高乳酸菌的产酸量的方法，对生产褐色乳酸菌饮料有至关重要的作用。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种稳定可靠、操作简便的提高副干酪乳杆菌l9发酵产酸速率进而有效简化生产工艺并降低生产成本的方法。
[0005]
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一种在制作褐色乳酸菌饮料时提高产酸速度的方法，所述方法是用含有硫酸锰的中间发酵剂培养副干酪乳杆菌l9，然后用中间发酵剂发酵褐色乳酸菌饮料基料，再通过糖水稀释发酵好的褐色乳酸菌饮料基料，包括下述工艺步骤：（1）制备中间发酵剂：将脱脂奶粉用水稀释至蛋白质含量为3.0%后，添加硫酸锰，使硫酸锰在脱脂奶粉中的终浓度质量体积比为0.05-0.25
‰
，115 ℃灭菌15 min后备用，将用mrs液体培养基活化好的副干酪乳杆菌l9，按体积比为2%的接种量接种到制备好的脱脂奶粉中，38℃下静置培养18h；（2）配制褐色乳酸菌饮料基料：将制作褐色乳酸菌饮料基料用的脱脂奶粉用水稀释至蛋白质含量为4.2%，向其中添加质量百分比为6.0%的果葡糖浆，果葡糖浆中果糖含量不低
于42%，然后在95 ℃条件下褐变2.5 h；冷却至38 ℃后备用；（3）褐色乳酸菌饮料基料发酵培养：将步骤（1）制备好的中间发酵剂，按质量百分比为2%的添加量添加至褐色乳酸菌饮料基料中，摇匀，38 ℃静置培养36-60 h，发酵到滴定酸度达到200-220
°
t时终止发酵；（4）配制糖水：在无菌水中加入蔗糖和果葡糖浆，蔗糖的质量浓度为10-20%，果葡糖浆的质量浓度为2-3%，经沸水浴煮沸保温30 min，冷却后置于4 ℃保藏，制得调配用糖水；（5）调配褐色乳酸菌饮料：将步骤（3）制得的褐色乳酸菌饮料基料破乳、均质后，用步骤（4）制得的调配用糖水稀释成褐色乳酸菌饮料，褐色乳酸菌饮料基料与调配用糖水的体积比为1:2.5-3.0，制成的褐色乳酸菌饮料的酸度达到55-60
°
t，蛋白质质含量达到1.0-1.2%，糖度达到10-12%。
[0006]
副干酪乳杆菌l9菌株保藏编号为9800，其保藏说明如下：分类命名：副干酪乳杆菌；拉丁名：lactobacillus paracasei；参椐的生物材料：l9；保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏机构简称：cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号；保藏日期：2014年10月22日；保藏中心登记入册编号：cgmcc no .9800。
[0007]
与现有技术相比，本发明的有益效果有：1、本发明通过在脱脂奶粉中添加一定浓度的锰离子培养副干酪乳杆菌l9后，获得活性较高的中间剂，可显著提高副干酪乳杆菌l9在褐色乳酸菌饮料基料中的产酸速率，缩短发酵时间。
[0008]
通过添加锰离子缩短褐色乳酸菌饮料发酵时间的主要原因在于：乳酸菌发酵碳源的主要代谢途径为经同型发酵或异性发酵，将乳糖最终转化为乳酸并生成生命活动所必需的能量。研究表明，将葡萄糖转化为丙酮酸的糖酵解途径中的主要酶类大多数需要mn
2+
或mg
2+
参与以维持相关酶的活性。mn
2+
或mg
2+
能提高甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙酮酸水合酶及丙酮酸激酶与底物的结合亲和能力，mn2+也可提高果糖二磷酸醛缩酶活性。mrs培养基作为培养乳酸菌的通用培养基，其中硫酸锰主要作为生长及代谢活动相关因子，同时也作为乳酸菌培养过程中清除氧自由基，达到清除氧气形成厌氧环境的目的。在我们的研究中，我们考察了不同营养成分，尤其是无机盐对副干酪乳杆菌发酵褐色乳酸菌饮料基料过程中产酸速率的影响。结果表明mn
2+
可显著提高副干酪乳杆菌发酵过程中的产酸速率，缩短发酵周期。
[0009]
2、本发明方法简便，简化了发酵生产工艺，可有效降低生产成本。通过本发明所述方法，能显著提高副干酪乳杆菌在褐色乳酸菌饮料基料中的产酸速率，缩短发酵时间。当在中间发酵剂中添加质量体积比为0.05
‰
的硫酸锰培养副干酪乳杆菌18 h后，转入褐色乳酸菌饮料生产发酵剂中，发酵60 h后酸度即可达到220
ꢀ°
t。相较于优化前，该方法将褐色乳酸菌饮料发酵时间由96 h缩短至60 h，时间缩短50%，效果非常显著，而且制得的褐色乳酸菌饮料在保质期内具有良好的稳定性及副干酪乳杆菌活性。
附图说明
[0010]
图1：在制备中间发酵剂中添加不同浓度硫酸锰，对副干酪乳杆菌l9发酵生产褐色乳酸菌饮料在货架期内后酸变化的影响。
[0011]
图2：在制备中间发酵剂中添加不同浓度硫酸锰，对副干酪乳杆菌l9发酵生产褐色乳酸菌饮料在货架期内析水情况的影响。
[0012]
图3：在制备中间发酵剂中添加不同浓度硫酸锰，对副干酪乳杆菌l9发酵生产褐色乳酸菌饮料在货架期内活菌数情况的影响。
[0013]
下面结合实施例，进一步阐述本发明，但不限于实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0014]
实施例1一种在制作褐色乳酸菌饮料时提高产酸速度的方法，所述方法是用含有硫酸锰的中间发酵剂培养副干酪乳杆菌l9，然后用中间发酵剂发酵褐色乳酸菌饮料基料，再通过糖水稀释发酵好的褐色乳酸菌饮料基料，具体包括下述工艺步骤：（1）制作mrs液体培养基：具体方法为向1000ml水中加入20g葡萄糖、10g酪蛋白质胨、10g牛肉浸膏、5g酵母浸粉、5g无水乙酸钠、2g柠檬酸三铵、2g磷酸氢二钾、1ml吐温-80、0.25g硫酸锰及0.58g硫酸镁，硫酸镁及硫酸锰分开溶解后与其余成分混合，121℃灭菌20min，备用。
[0015]
（2）活化副干酪乳杆菌l9：吸取甘油管保存菌液50 ml，按体积比为2%的接种量接种至mrs液体培养基中，38 ℃静置培养18 h。
[0016]
（3）制备含不同营养因子的脱脂奶粉：将脱脂奶粉用水稀释至蛋白质含量为3.0%，向其中添加不同浓度及种类的营养因子，115 ℃灭菌15 min后备用。不同浓度及种类的营养因子分别是：2%葡萄糖、1%酪蛋白质胨、0.5%酵母浸粉、0.2%柠檬酸三铵、0.2%磷酸氢二钾、0.025%硫酸锰、0.058%硫酸镁、0.5%无水乙酸钠。
[0017]
（4）制备中间发酵剂：将经步骤（2）活化好的副干酪乳杆菌l9，按体积比为2%接种量接种于步骤（3）制备的含不同营养因子的脱脂奶粉中，以不添加营养因子的脱脂奶粉为对照组，38℃下静置培养18h。
[0018]
（5）配制褐色乳酸菌饮料基料:将制作褐色乳酸菌饮料基料用的脱脂奶粉用水稀释至蛋白质含量为4.2%，向其添加质量百分比为6.0%果葡糖浆(f42)，95 ℃条件下褐变2.5 h，冷却至38 ℃后备用。
[0019]
（6）褐色乳酸菌饮料基料发酵培养：将中间发酵剂按体积比为2%的添加量，转接至褐色乳酸菌饮料基料中，摇匀，38 ℃条件下静置培养120 h。
[0020]
（7）酸度曲线测定：分别测定添加了不同浓度及种类营养因子的各实验组发酵第0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120 h时的滴定酸度。
[0021]
滴定酸度测定方法为：准确称取相应时间段发酵基料5.0 g，加入40 ml水，摇匀后加入2 ml酚酞指示剂，以1.0 mol/l氢氧化钠进行滴定，记录消耗氢氧化钠体积。滴定酸度（
°
t）=消耗氢氧化钠体积（ml）
×
2。
[0022]
含不同营养因子的中间发酵剂对副干酪乳杆菌l9在褐色乳酸菌饮料基料发酵培养中滴定酸度（
°
t）结果见表1。
[0023]
表1表1的实验结果表明，相较于在脱脂奶粉中添加其它营养因子，添加硫酸锰能显著促进副干酪乳杆菌在褐色乳酸菌饮料基料中产酸速率，添加0.25
‰
硫酸锰时，发酵36 h褐色乳酸菌饮料基料酸度即可达到200
ꢀ°
t以上，但添加其余营养因子，发酵96 h后滴定酸度才能达到200
ꢀ°
t以上。因此，在脱脂奶粉中添加硫酸锰，可显著提高副干酪乳杆菌l9在褐色乳酸菌饮料基料中的产酸速率，有利于缩短褐色乳酸菌饮料发酵时间。
[0024]
实施例2一种在制作褐色乳酸菌饮料时提高产酸速度的方法，所述方法是用含有硫酸锰的中间发酵剂培养副干酪乳杆菌l9，然后用中间发酵剂发酵褐色乳酸菌饮料基料，再通过糖水稀释发酵好的褐色乳酸菌饮料基料，具体包括下述工艺步骤：（1）制作mrs液体培养基：同实施例1。
[0025]
（2）活化副干酪乳杆菌l9：同实施例1。
[0026]
（3）制备含不同浓度硫酸锰的脱脂奶粉：向蛋白质含量为3.0%脱脂奶粉中添加不同浓度硫酸锰，115 ℃灭菌15 min后备用。硫酸锰的浓度分别0.05
‰
、0.10
‰
、0.15
‰
、0.20
‰
、0.25
‰
，硫酸锰的浓度均为质量体积比。
[0027]
（4）配制褐色乳酸菌饮料基料：同实施例1。
[0028]
（5）制备中间发酵剂：将经步骤（2）活化好的副干酪乳杆菌l9，按体积比为2%的接种量接种至经步骤（3）制作的含不同浓度硫酸锰的脱脂奶粉中，以不添加硫酸锰的脱脂奶粉为对照组，38 ℃下静置培养18h。
[0029]
（6）褐色乳酸菌饮料基料发酵培养：将中间发酵剂按体积比为2%的添加量转接至褐色乳酸菌饮料基料中，摇匀，38 ℃条件下静置培养120 h。
[0030]
（7）酸度曲线测定：分别测定添加了不同浓度硫酸锰的各实验组和对照组发酵第0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120 h时滴定酸度。滴定酸度测定方法同实施例1。
[0031]
本实施例含不同浓度硫酸锰的中间发酵剂对副干酪乳杆菌l9在褐色乳酸菌饮料基料发酵培养中滴定酸度（
°
t）结果见表2。
[0032]
表2表2的实验结果表明，添加不同浓度硫酸锰在发酵前24 h，对副干酪乳杆菌l9在褐色乳酸菌饮料基料中发酵产酸并无显著影响，24 h后发酵产酸速率及终点酸度均随硫酸锰添加浓度升高而逐渐升高。结果反映了中间发酵剂中硫酸锰浓度会显著影响副干酪乳杆菌l9发酵褐色乳酸菌饮料过程中的产酸速率，以及后期保藏过程中的后酸、稳定性等特性。
[0033]
实施例3一种在制作褐色乳酸菌饮料时提高产酸速度的方法，其特征在于：所述方法是用含有硫酸锰的中间发酵剂培养副干酪乳杆菌l9，然后用中间发酵剂发酵褐色乳酸菌饮料基料，再通过糖水稀释发酵好的褐色乳酸菌饮料基料，具体包括下述工艺步骤：（1）制作mrs液体培养基：同实施例2。
[0034]
（2）活化副干酪乳杆菌l9：同实施例2。
[0035]
（3）制备含不同浓度硫酸锰的脱脂奶粉：同实施例2。
[0036]
（4）配制褐色乳酸菌饮料基料：同实施例2。
[0037]
（5）制备中间发酵剂：同实施例2。
[0038]
（6）褐色乳酸菌饮料基料发酵培养：同实施例2。
[0039]
（7）配制糖水：向无菌水中添加蔗糖及果葡糖浆，使两种物质终浓度分别为15%及2.5%，沸水浴煮沸后，保温30 min，冷却后置于4 ℃冰箱保存备用，制得调配用糖水。
[0040]
（8）调制褐色乳酸菌饮料：当褐色乳酸菌饮料发酵基料滴定酸度达到220
ꢀ°
t时结束发酵，摇匀破碎后，先用20 mpa均质机第一次均质，用步骤（7）制得的调配用糖水稀释成褐色乳酸菌饮料，褐色乳酸菌饮料基料与调配用糖水的体积比为1:2.5，然后于20 mpa条件下进行二次均质，于4 ℃条件下冷藏即制得褐色乳酸菌饮料。该褐色乳酸菌饮料的酸度为58
°
t，蛋白质质含量为1.08%，糖度为10.5%。
[0041]
对本实施例制作的褐色乳酸菌饮料产品在货架期内后酸、稳定性的变化情况进行测试，测试的方法是将褐色乳酸菌饮料样品分装至透明玻璃瓶中，分别测定第0、5、10、15、20、25、30天时产品滴定酸度、析水及活菌数变化情况。
[0042]
滴定酸度按实施例2中步骤（7）所述的测定方法进行。
[0043]
析水具体检测方法为：将分装至透明玻璃瓶中的样品置于水平台面，用直尺测量上层清液厚度，并记录。活菌数检测方法为：吸取1 ml样品，用生理盐水进行梯度稀释，吸取稀释至相应梯度的溶液1 ml于玻璃平皿中，使用mrs固体培养基倾注板法倒平皿，38 ℃培养48 h后计量菌落数，并记录。
[0044]
含不同浓度硫酸锰的中间发酵剂对副干酪乳杆菌l9发酵生产所得褐色乳酸菌饮料后酸、析水情况及活菌数影响结果分别见图1、图2及图3所示。
[0045]
根据图1、图2及图3的实验结果表明，在中间发酵剂中添加不同浓度硫酸锰对褐色乳酸菌饮料产品保质期内后酸、析水均有较大影响，但对保质期内活菌数并无显著影响。具体来说，当在中间发酵剂中添加0.05
‰
、0.10
‰
、0.15
‰
、0.20
‰
及0.25
‰
的硫酸锰时，所得褐色乳酸菌饮料在30天保存期内后酸由61.5
ꢀ°
t分别升高至67
°
t、71
°
t、75
°
t、78
°
t、78
°
t，析水层在30天保存期后分别升至5 mm、6 mm、7 mm、7 mm、9 mm。也就是说，随着在中间发酵剂中硫酸锰添加浓度的升高，所得褐色乳酸菌饮料产品在保存期内产品适口度及稳定性均呈下降趋势。
[0046]
总的测试结果表明，在副干酪乳杆菌生产褐色乳酸菌饮料中间发酵剂中添加0.05
‰
硫酸锰，有利于发酵过程中乳酸产生，且所得产品在货架期内具有较低的后酸及良好的稳定性。
[0047]
由于目前尚未有关于在饮料中mn
2+
的添加量的相关的国家法律法规，参照gb14880-2012中锰作为营养强化剂添加在乳粉中标准规定，儿童用乳粉和孕产妇用乳粉除外的调制乳粉，允许锰的添加量为0.3-4.3 mg/kg，儿童用调制乳粉允许锰添加量为7-15 mg/kg，孕产妇用调制乳粉允许锰添加量为11-26 mg/kg。通过第三方检测机构检测，结果表明向中间发酵剂中添加0.05
‰
硫酸锰所生产褐色乳酸菌饮料产品中锰含量为0.164-0.166 mg/kg，符合gb14880-2012中相关规定。
[0048]
发明人通过长期反复的试验，发现本发明的方法可有效提高副干酪乳杆菌发酵生产褐色乳酸菌饮料产酸速率。也就是说向中间发酵剂中添加0.05-0.25
‰
硫酸锰，能显著缩短副干酪乳杆菌l9发酵生产褐色乳酸菌饮料的发酵时间，降低生产成本。
[0049]
以上所述仅为本发明的优选实施例，但并不限制于本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明中参数可由不同菌株的特性差异而改变。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换及改进，均应包含在本发明的保护范围之内。