抗病毒植物的制作方法

专利名称：抗病毒植物的制作方法
背景技术：
本发明涉及抗病原体的植物抗性，特别涉及其中对入侵病原体如病毒在被入侵作出反应而引发对病原产生抗性的植物，在这样植物上所用的DNA构建物以及在植物体中引入病毒诱生抗性的方法。
病毒感染植物时常使植物在生长过程中产生有害反应、不期望的形态变异和减产等等。这样的侵染经常导致被侵染的植物对其他病原体及植物虫害更大的感病性。
病毒颗粒通常含有相对少量的遗传物质(单链或双链的RNA或DNA)，外被一种或多种蛋白所保护，在有一些病毒类型中蛋白也会被寄主所产生的脂类膜所包被，构成了感染性颗粒。病毒的增殖依赖于寄主细胞因而被视为细胞内寄生物。
植物已发展了很多防御机制以限制病毒感染的效应。例如，所谓水平或局部抗性其本质是多基因控制，所谓垂直抗性其本质是单基因控制的。
在育种计划中，水平抗性难以成功地导入植物，然而，垂直抗性在育种计划中比较容易地在植物中增生。编码抗病毒的基因以消极的组成型地起作用，即不需要诱导基因表达。组成型地表达的抗病毒性包括无寄主抗性作用的方式耐受性即抑制病害的发生，免疫性即抑制病毒的转运或出现抗病毒因子等等。或者是，植物中编码抗病毒的基因能够通过诱导一个或数个为表达编码抗病毒基因而主动地打开，这种体系的实例包括过敏反应。
已报导植物中所谓过敏反应(HSR)一般特征认为植物细胞在邻接的细胞被入侵病原体侵染后不久死亡。病原体穿越侵染细胞或向侵染细胞移动由于被入侵细胞的周围细胞或被侵染细胞的坏死而被限制或阻断。此外，过敏(HSR)包含阶梯式附加的或次生的防御反应，以及一些蛋白和次生代谢物的蓄积，从而引起抵抗病原体攻击的抗性水平全面地提高。通常认为对入侵生物体的过敏反应也牵涉植物细胞中抗性基因的产物，该产物可以识别引发体(elicitor)因子，即病原体的无毒基因的产物，并与之相互作用。抗性植物中，引发体(elicitor)因子的识别引发了过敏反应因而将病原体感染限制在单个细胞或几个细胞中，或至多也只限制在紧邻的一些植物细胞之内。
过敏介导的抗病毒感染的一个实例是烟草植物携有抗烟草花叶病毒群例如烟草花叶病毒(TMV)及西红柿花叶病毒(TOMV)的N′抗性基因。迄今，已鉴定了二十余种显性HSR型抗性基因。它们出现在包括烟草、蕃茄、土豆、胡椒、莴苣等很多重要的农作物中。
尽管抗某些病毒的抗性资源表面上很丰富，但很多植物对重要的病毒病原体，仍然缺乏有效的抗性基因[Fraser，R.S.S.(1992).Euphytica 63175]。搜寻野生型种质采集品中，仅鉴定了有数几个抗病毒抗性的合适资源，它们能够成功地被导入到重要的农作物中。许多重要的农作物包括但不限于西红柿、胡椒、黄瓜、甜瓜，莴苣等等品种，缺乏对黄瓜花叶病毒(CMV)的垂直抗性基因，就是一个实例。
植物育种者们一直试图培育出种类繁多的对于特定病毒品系有耐受性或抗性的作物品种。过去，具有抗病毒特性的基因，从与商用植物相近的野生型通过育种转移到商用品种中。将野生存在的抗性从野生型基因库中转移到栽培品种是一个麻烦的过程，首先必须从来源(供体)植物品种中鉴定抗性(载体)基因，然后将其结合到商用品种的基因库中。以此方法产生的抗性或耐受性，其典型活性仅仅抗所述的那个病毒的一种，最多抗几个品系。更进一步的缺点是，这种育种计划通常花费很长时间，数以年计，才能得到农业上有用的植物。
或者，采用所谓的″交叉—保护″方法。交叉—保护是这样一种现象一种植物被一种病毒品系侵染之后，可以保护此植物不被第二种与此病毒相关品系的重侵染。交叉—保护方法首先必须包括使用无毒病毒品系去侵染植物，以抑制同一种病毒的有毒品系的继发侵染。然而使用天然的交叉—保护方法有几个缺点。第一这方法劳动强度大因为需要把作物逐一接种，其次带有无毒株如突变成有毒株，而有毒株本身成为作物致病因子的风险。另外可能的风险是，一种植物品种的无毒病毒品系对另一植物品种可能成为有毒品系。
遗传工程的交叉保护是一种抗病毒形式，表现型上与自然交叉—保护相类似。但需通过表达来自遗传操作过的植物基因组的病毒外壳蛋白的遗传信息来实现。已经知道，转基因植物基因组的烟草花叶病毒品系U1(TMV-U1)的外壳蛋白的基因达，用任一TMV品系侵染后都能使其症状发展迟延。同样在苜蓿花叶病毒(AMV)，马铃薯病毒X(PVX)，以及黄瓜花叶病毒(CMV)获得了外壳蛋白介导的保护。对某些植物病毒，如黄矮病毒来说，在转基因植物中难以获得可检测的量的相应的外壳蛋白，所以，通常对病毒抗性低。此外，任何一个能称得起的保护都要求植物持续地制造外壳蛋白，因而使植物增加能量的负担。这种局限性使这一技术的商用价值仍不明显。
另一个用遗传工程方法得到抗病毒的实例包括导入植物病毒的卫星RNA，其中整合进去的遗传物质的表达，修饰了植物病毒或改变其影响。
本发明的一个目的，就是在植物中对本领域已熟知的用工程方法得到抗病毒性提供另一种更可靠的用工程方法得到抗病毒性策略，它基于入侵病原体在植物寄主中定居之前，直接病原体在植物靶组织中诱导分子表达。
本发明的另一个目的是，将遗传工程植物转化技术同植物组织中自然存在的植物病毒防御机制结合起来。
详细说明按照本发明所述，提供一种能够直接或间接编码反义RNA分子的植物病毒DNA结构物，而这种反义RNA分子有与入侵病毒所编码的依赖于RNA的RNA多聚酶相互作用的能力，这样，作为它同所说的入侵病毒编码的依赖于RNA的RNA多聚酶相互作用的结果，至少会产生一种引发(eliciting)因子。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种能够编码一种正义RNA分子的植物病毒重组DNA结构物而这种正义RNA分子能够同侵染病毒所编码的依赖于RNA的RNA多聚酶起相互作用，这种相互作用的结果是，正义RNA分子至少能够编码一种引发因子，它在植物被所说侵染病毒侵染时，在植物体内引出天然的植物防御。
这种植物病毒DNA结构物可以从任一能够侵染植物的病毒源中得出。然而，这种植物病毒DNA优先考虑从任一已知侵袭、被怀疑侵袭、或能够侵袭具有农业价值植物品种的病毒源中得到。它可以是经过修饰适于表达的天然植物病毒DNA，也可以人工合成获得。这种植物病毒DNA在植物细胞中，应有编码转录与病毒RNA(即正义)互补的RNA序列(即反义)的能力。另外，这种植物病毒DNA应该含有这样的一个部分或其片段，当其转录生成反义RNA，以及进一步转录生成正义RNA时，通过转译正义RNA，能够生成至少一种足以引出对抗侵染病毒的天然植物防御机制的引发(eliciting)因子或其一部分。合适的植物病毒DNA或RNA源可从能够侵染这样一些植物种类的植物病毒中得到，例如西红柿、胡椒、甜瓜、莴苣、花椰菜、硬花甘蓝、卷心菜、芽甘蓝、甜菜、玉米、甜玉米、洋葱、胡萝卜、韭菜、黄瓜、烟草等等，也包括来源于侵染装饰作物的植物种类的植物病毒衍生植物病毒DNA或RNA源，例如凤仙花属、秋海棠、牵牛花、天竺葵属(天竺葵、堇菜、仙客来、马鞭草、蔓长春花、万寿菊、报春花、圣保罗草等。
反义RNA分子含有所说的植物病毒DNA的一部分中的至少一个顺反子或与其当的一部分，而且还能从所说的反义RNA分子中转录产生正义RNA分子，在植物细胞中正义RNA分子编码产生至少一个引发因子或其一部分。反义RNA能够从所说的植物病毒DNA中直接转录，或从所说的DNA衍生而来的正义RNA转录。这样，从正义RNA转录反义RNA，按本发明的目的认为是所说的DNA的间接转录。座落于反义RNA分子上的顺反子或几个顺反子或其一部分的如此的定位或极性，使得植物病毒DNA结构物在转录之后引发因子不会直接被编码到顺反子或几个顺反子或其一部分的遗传密码座落在反义RNA分子的互补链上，即正义RNA上。当侵染病毒所编码的依赖于RNA的RNA多聚酶催化反义病毒RNA序列进行复制，产生正义RNA分子时，编码引发(eliciting)因子的顺反子就能够被翻译。
此中反义RNA也包括那些可以描述成具有双义特征的RNA分子，如来源于托斯普病毒(tospoviruses)等的RNA分子。这种情形下，反义RNA至少包含一个顺反子，与所说植物病毒DNA的一部分相对应，能够从所说的反义RNA中转录出正义RNA分子，这种RNA分子在植物细胞中能够编码并生成至少一种引发因子或其一部分。
正义病毒RNA分子能直接或间接地编码至少一种引发(eliciting)因子或其一部分，而这种引发因子能在植物细胞中表达，且具有天然的或工程过的植物防御引发活力。正义RNA分子与病毒反义RNA互补，在植物细胞中，经转译能直接或间接生成至少一种引发体(elicitor)因子。这样，病毒正义RNA分子可以看作反义RNA分子的互补RNA分子。
此中正义RNA也包括那些被描述为具有双义特征的RNA分子。在这种情形下，正义RNA含有至少一个顺反子，与所说植物病毒DNA的一部分相当，它能够在植物细胞中直接编码并生成至少一个引发因子或该因子的一部分。
植物细胞中表达的引发因子的量应该足以引出对抗侵染病毒的植物细胞的防御反应，结果导致自然的或工程过的植物反应，使有效地阻断或限制病毒进一步的活动。因而，正义RNA分子，无论是反义RNA互补物还是双义RNA都必须能产生引发体因子。这种引发体因子无论是通过直接转译，还是通过产生亚基因组RNA，都会引发出或激发出天然的或经工程的植物防御反应。正义RNA依据植物防御反应类型/被引发的植物防御反应，最终编码出一个或多个引发体因子。病毒正义RNA序列优先含有这样一个序列其中至少有一个病毒顺反子被至少一个能够在植物细胞中表达编码引发体因子的顺反子所取代，且具有在植物组织中有激发天然或工程过的植物防御反应的活力。
引发因子可以是来自上述的植物病毒DNA的正义RNA顺反子转译而来的任一因子，可以是蛋白、多肽、肽或其片段等等。最好的引发因子的实例包括所谓的引发体的蛋白和/或细胞抑制蛋白。
引发体蛋白是这样的蛋白，假如在植物组织中出现，能够引出，激发，或诱导高度敏感反应(HSR)，HSR是一种针对入侵病原体，如病毒的天然的植物防御机制。引发体蛋白可来自植物病毒，例如外壳蛋白，细胞至细胞间移动所涉及的蛋白，蜗牛酶，依赖于RNA的RNA聚合酶等。另外引发体蛋白也可以从其他植物病原体如细菌、真菌、线虫等等为来源或衍生。
细胞抑制蛋白是这样一种蛋白，如果它在植物组织中出现，就对植物细胞产生有害作用，从而导致细胞生长被抑制例如细胞分裂，及/或细胞死亡。细胞抑制因子包括但不局限于核糖核酸酶、蛋白酶、核糖体抑制蛋白，细胞壁降解蛋白等。
正义和反义RNA分子也被视为植物病毒RNA，因为它们是从上述的植物DNA结构物衍生而来，其中当然也包含植物病毒的基因组或基因组的一个片段。在这样的植物病毒RNA里，所选定的核苷酸片段可以被另一片段取代，或被删除。核苷酸的取代及/或删除或核苷酸组成的片段的取代或删除应该以不妨碍RNA分子在病毒侵染的植物细胞内增殖或复制能力为准。另外，取代及/或删除核苷酸、取代/或删除密码子或核苷酸组成的片段应该以不妨碍入侵病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶识别能力，和对RNA分子(在正义或负义的RNA定位)的作用力为度，从而能开始如上描述的事物的顺序，生产出有效量的、能引发自然的、或工程过的植物的防御反应的引发体因子。合适的植物病毒RNA分子包括，但不限于这些选定病毒群的基因组RNA分子或其片段，选定的病毒群，包括马铃薯Y病毒群、马铃薯X病毒群、烟草花叶病毒群、黄矮病毒群、或者是黄瓜花叶病毒群、雀麦花叶病毒群、托斯普病毒群(tospoviruses)等。
植物病毒DNA在一个启动子控制之下表达，在植物中起功能作用，而且包括一个在植物中起作用的终止子。
启动子是位于转录起始位点上游的核苷酸序列，且含有转录所需的全部调节区域，适用于本发明的DNA结构物的启动子包括病毒的、真菌的、细菌的、动物及植物来的，能够在植物细胞中起功能作用的启动子。最适用的启动子应能够使DNA在所有植物的活组织中表达。主张采用的启动子应该能使病毒的植物DNA以足够的速率表达，以生产出的编码至少一种引发体因子的RNA的量，该引发因子在病毒侵染转化过的植物时，能引发天然的植物防御反应。所要求的需转录的RNA的量随植物种类而变化。合适的启动子包括花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)以及19S(CamV19S)启动子，燕脂碱合成酶及章鱼碱合成酶启动子，热休克蛋白80(hsp80)启动子等。
终止子被认为是(A)病毒DNA的下游DNA序列，编码一段能转录出自身催化，自我剪切的RNA序列随着(B)转录单位末端的一段DNA序列为转录终止发出信号，终止子序列就从重组病毒的RNA序列上释放出来。这些因子是一段3′端非翻译序列，含有多聚腺苷化信号，它的作用能使新生的转录物的3′端加上多聚腺苷序列。下面所述序列实例(A)包括自我剪切RNA分子或核酶如核糖核酸酶P、四膜虫L-19插入序列、撞水鲛核酶、肝炎δ(delta)病毒RNA，脉孢菌线粒体VS RNA等等[Symons，R.H.(1992).Ann.Rev.Biochem.61641]。下面所述的序列(B)可以从真菌、细菌、动物及/或植物中分离到。例如特别适用于本发明的DNA结构物包括根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的燕脂碱合成酶的多聚腺苷化信号、CaMV的35S多聚腺苷化信号以及来自玉米(Zea mays)的玉米醇溶蛋白多聚腺苷化信号。
在合适的杂交条件下，按照碱基配对原则，一段DNA或RNA序列能够和另一段DNA或RNA序列形成氢键复合物叫做互补。适合本发明的目的杂交条件包括但不局限于这些例如，在含有5X标准柠檬酸盐(SSC)，0.5％十二烷基磺酸钠(SDS)，5 x Denhardt′s溶液，50％甲酰胺及100μg/ml载体DNA或RNA的缓冲体系(以后均采用此体系)中42℃温育16小时。接着在含有1xSSC和0.1％SDS的缓冲液中，65℃洗3次，每次约1小时。这样才获得的RNA或DNA分子的杂交信号，例如通过放射自显影阅读，出现的条带给专业人员观看已足够清晰说明，获得的RNA或DNA分子能有效地用于构建适于本发明应用的植物病毒DNA结构。当然，这样的RNA或DNA分子应该具有本文所叙述的要求的活性。因而，置换和/或删除核苷酸、密码子或者由核苷酸组成的片段应该不干扰本发明的DNA构建物具有的上述编码负义RNA分子的能力。该负义RNA分子如本文所述具有识别入侵病毒的依赖于RNA的RNA多聚酶的能力，并与之相互作用，从而引发了文中所述的事件顺次发生，导致产生有效量的，能引发天然的或工程过的植物防御反应的引发因子。
本发明采用的合适的杂交条件包括在缓冲体系49℃温育约16小时，以及在含有0.1xSSC及0.1％SDS的缓冲液里在55℃清洗3次，每次约1小时。更合用的杂交条件包括在缓冲体系中55℃温育16小时，以及在含有0.1xSSC及0.1％SDS缓冲液里65℃清冼3次，每次约1小时。当然，任何在这样的杂交条件下经受实验的RNA或DNA分子应该具有文中所述的所要求的活性。
本发明也提供了能够将本发明的DNA构建物导入植物细胞的运载体，以及制备这种运载体的方法。这里采用的运载体一词是指，借助于它的DNA分子或其片段能整合到寄主生物体的运载工具中。合适的运载工具包括质粒、用微注射法或粒子枪导入的裸露的DNA等等。[Offringa(1992).PhD thesis，State University Leiden，The Netherlands，Ch1pages 7-28]文中采用的植物一词是广义的，指分化植物以及未分化植物材料，后者在合适的条件下能发育成为成熟的植物，如原生质体、植物细胞、种籽、胚等，其子代和其部分例如这样的植物的插条和果实。
本发明进一步提供了其基因组包含了本发明的DNA结构的植物，以及生产这种植物的方法。
按照本发明所载，植物减低了对致病的各个病毒的感病性，而且没有在这里讨论过的用传统方法或遗传工程方法获得的植物的缺点局限性。
本发明将由下述无局限性的实施例及附属图例说明。
图一.病原体与植物编码蛋白相互作用，使诱导出HSR反应的图解说明。
图二.烟草或西红柿植物抗黄瓜花叶病毒(CMV)的图解说明，这二种植物通过表达CMV负义RNA3分子而获得，其中RNA分子的MP基因被编码引发体西红柿花叶病毒外壳蛋白(ToMV CP或P30)或细胞抑制蛋白(RNase T1)的基因所取代。
图三.烟草或西红柿植物抗CMV的图解说明，这二种植物通过表达CMV正义RNA3分子而获得，其中RNA分子的MP基因被编码引发体(ToMV cp或P30)或细胞抑制蛋白(RNase T1)基因所取代。
序列ID1嵌合黄瓜花叶病毒RNA3的核苷酸序列。
序列ID2西红柿花叶病毒(ToMV)外壳蛋白(相当于序列ID1的123-600位核苷酸)氨基酸序列。
序列ID3对应于序列ID1的897-1550位核苷酸的黄瓜花叶病毒外壳蛋白的氨基酸序列。
序列ID4嵌合黄瓜花叶病毒RNA3的核苷酸序列。
序列ID5对应于序例ID4的123-437位核苷酸的核糖核酸酶T1(RNase T1)的氨基酸序列序列ID6编码西红柿花叶病毒(To MV)P30的嵌合黄瓜花叶病毒RNA3的核苷酸序列。
序列ID7对应于序列ID No.6的123-914位核苷酸的ToMV的P30的氨基酸序列。
序列ID8嵌合西红柿斑点枯萎病毒S RNA，它编码ToMV的外壳蛋白，以及在相反极性上编码无结构蛋白NSp的核苷酸序列。
序列ID9无结构蛋白NSP(相反极性)在对应序列ID的1141-2543位核苷酸的氨基酸序列。
实施例这里所有黄瓜花叶病毒(CMV)，西红柿斑点枯萎病毒(TSMV)及西红柿斑点病毒(ToMV)来自RNA的序列都以DNA序列列出，唯一目的在于一致性。主张这样做仅是出于方便。
植物转化研究中所用栽培品种烟草(Nicotiana tabacum)及西红柿Lycopersicon esculentum在标准温室条件下生长。无菌分离块材料在含有合适的植物激素及合适蔗糖浓度的标准MS培养基[Murashige and skoog(1962).physiol.plant 15473]中生长。
E.coli细菌在37℃标准LB培养基中进行摇床培养。根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株在补充了0.1％葡萄糖的MinA培养基中生长[Ausubel et al.(1987)Current Protocols inMolecular Biology，Green Publishing Associates and WileyIhter-sciences，New York，Chichester，Brisbane，Toronto，and Singapore]。
在所有的克隆步骤中，E.coli JM83(F-，△(Ias-pro)，ara，rpsL， 80，dlacZM15)品系是重组质粒首先选用的受体株。二元体载体是被联合到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumfaciens)LBA4404中，该菌株含有Ti质粒vir区[Hoekema et al(1983).Nature 303179]，在标准三亲株交配中用含有pRK2013质粒[Figurski and Helinski，(1979).Prec.Natl.Acad.Sci.USA761648]的E.coli HB101作为辅助菌株。合用的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens受体菌在含有利福平(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的培养基上进行抗性选择。
将片段克隆到载体pUC19[Yanish-perron et al(1985).Gene 33103].pBluescript(stratagene).pBIN19[Beven etal(1984).Nucl.Acids Res.128711]或其衍生载体中，限制性内切酶分析DNA、对E.coli受体菌株转化、小规模及大规模制备质粒DNA、缺刻翻译、体外转录、DNA序列分析、Southern印迹转移和DNA凝胶电泳都按标准步骤进行[Maniatis et al(1982)分子克隆(Molecular Cloning)实验手册(A Laboratory Manual)ColdSpring Harbor Laboratary， New York；Ausubel et al supra.(1987)]。
DNA扩增所采用的多聚酶链式反应(PCR)按Taq多聚酶(PerkinElmer Cetus)供应商推荐的方法进行。通过反转录扩增RNA及随后的标准DNA扩增都按供应商(Perkin Elmer Cetus)推荐的基因扩增用RNA的多聚酶链式反应(Gene Amp RNA PCR)方法进行。
实施例1黄瓜花叶病毒(CMV)颗粒及其遗传物质的分离从南瓜中分离到CMV血清型I，通过机械通道在南瓜中保存。病毒基本上按照Francki等人[(1979)CMI/AAB Descr.of PlantViruses 213]的步骤从全面感染的南瓜叶中被纯化。用苯酚抽提到的250μl体积中大约有100μg病毒，然后用苯酚和氯仿混合液抽提，最后用氯仿抽提，经乙醇沉淀后再离心收集RNA，然后把沉淀溶于20μl水中。
实施例2西红柿花叶病毒(ToMV)颗粒及其遗传物质的分离从西红柿中分离ToMV，通过机械通道保存在烟草中。病毒基本上按Hollings & Huttinga[(1976)CMI/AAB Descr.of PlantViruses 156]的方法从全面感染的烟草叶中纯化。体积300微升中大约有200μg病毒，先用苯酚，然后用苯酚氯仿混合液，最后用氯仿抽提，用乙醇沉淀RNA，离心收集。然后把沉淀溶于50μl水中。
实施例3黄瓜花叶病毒(CMV)RNA3的分子克隆以纯化过的CMV RNA为基础进行PCR反应的RWA中分离到CMVRNA3序列(Perkin Elmer Cetus Supra)。设计了两个引物，Zupo69(5′TTTGGATCCA CGTGGTCTCC TTTTGGAG 3′)，它互补于CMV RNA 3(Seq.Id No.1)的3′末端的前16个核苷酸，以及ZUP068(5′TTTGGATCCG TAATCTTACC ACT 3′)它和CMV RNA 3(Seq.Id.No.1)5′端的前14个核苷酸相同。两个引物均含有BamHI内切酶切点，使能进一步克隆经扩增的DNA分子。纯化过的CMV RNA进行基因扩增RNA多聚酶链式反应(Gene Amp RNAPCR)，生成的PCR片段是从琼脂糖凝胶上分离到并把它克隆到经SmaI内切酶切后而线性化的pUC19质粒上，产生重组质粒pIU181。
实施例4西红柿斑点枯萎病毒TSWV S RNA的分子克隆通过在单一E.eoRI内切酶切位点上融合eDNA克隆的520及614生成pTSMV-S1[De Haan er al(1990)J.Gen Virol.711001]，以构建出包含几乎完整的TSWV S RNA特异序列的cDNA克隆。将纯化的pTSWV-S1 DNA为基础进行RNA的PCR反应(Perkin Elmer CetuSsupra)，分离到完整的TSWV S RNA序列。设计了两个引物，IUP2505′(TTTGGATCCAGAGCAATCGTGTCAATTTTGTGTTCATACCTTAAC)3′包含36个核苷酸，和TSWV S RNA(Seq.Id.No.8)的5′末端的前36个核苷酸相同，以及ZUP2515′(TTTGGATCCA GAGCAATTGT GTCAGAATTT TGTTCATAATCAAACCTCAC TT)3′包含43个核苷酸，和TSWV S RNA(Seq.Id.No.8)的3′末端的前43个核苷酸互补。两个引物均含有BamHI内切酶位点，从而使能进一步克隆扩增过的DNA分子。得到的PCR片段是从琼脂糖凝胶上分离到，并把它克隆到SmaI内切酶线性化的pUC19质粒上，产生重组质粒pTSWV-S2。
实施例5西红柿斑点病毒(ToMV)的外壳蛋白(CP)和蛋白30(P30)基因的分子克隆采用以RNA的PCR反应为基础方法分离到对应于ToMV外壳蛋白(CP)和P30的基因序列。引物ZUP112跨越ToMV RNA的CP基因翻译起始位点两端5′GTATTAACC TGGCTTACTC 3′(包括13个核苷酸，和Seq.Id.No.1的121-133位核苷酸相同。)以及引物ZUP113跨越ToMV RNA的CP基因翻译终止密码子的两端5′GCACCCATGG ATTTAAGATG 3′(包括16个核苷酸，和Seq.Id.No.1的595-610位核苷酸互补，以及引物ZUP117跨越ToMV RNA的P30基因翻译起始密码子的两端5′TATTTCTCCA TGGCTCTAGT 3′(包括13个核苷酸，和Seq.Id.No.6的121-133位核苷酸相同)，以及引物ZUP118跨越ToNV RNA的P30基因翻译终止密码子的两端5′GAGTAAGCCA TGGTTAATAC 3′(包括13个核苷酸，和Seq.Id.No.6的911-923位核苷酸互补)引物均含有Nco I限制性内切酶位点，可以进一步克隆经扩增的DNA分子。纯化的ToMV RNA须经用RNA的多聚酶链式反应进行基因扩增(Gene AMP RNA)，生成的多聚酶链式反应后的(PCR)片段从琼脂糖凝胶分离到，并克隆到经SmaI酶切而线性化pUC19质粒上，生成重组质粒pZU183(含有CP基因)以及pZU206(含有P30基因)。
实施例6核糖核酸酶T1基因的合成对应于核糖核酸酶T1的基因序列在产商用DNA合成仪上合成(Pharmacia LKB，Gene assembler plus)，作为引物ZUP110(含有与Seq.Id No.4的121-293位核苷酸相同的核苷酸)5′TTTCCATGGC ATGCGACTAC ACTTGCGGTT CTAACTGCTA CTCTTCTTCAGACGTTTCTA CTGCTCAAGC TGCCGGATAT AAACTTCACG AAGACGGTGAAACTGTTGGA TCTAATTCTT ACCCACACAA ATACAACAAC TACGAAGGTTTTGATTTCTC TGTGAGCTCT CCCTAC 3′以及引物ZUP111(含有与Seq.Id.No.4 278-446位核苷酸互补的核苷酸)5′GGGCCATGGT TATGTACATT CAACGAAGTT GTTACCAGAA GCACCAGTGTGAGTGATAAC ACCAGCATGT TGGTTGTTTT CGTTGAAGAC GACACGGTCAGCACCTGGAG AAGGACCAGA GTAAACATCA CCGCTAGAGA GGATAGGCCATTCGTAGTAG GGAGAGCTCA C 3′两个引物均含有No.I限制性内切酶位点，使能进一步克隆经扩增的DNA分子。引物退火之后，并经受标准的DNA的多聚酶链式(PCR)反应。扩增后的DNA片段从琼脂糖凝胶上分离到，并把它克隆到经SmaI酶切而线性化pUC19质粒上，形成重组质粒pZU230。
实施例7构建表达载体pZU-A35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子片段从重组质粒pZ027中分离出来，该质粒从PUC-19衍生载有444碱基对(bp)的HindIII-PstI片段，它就为CaMV Cabb-S病毒株[Franck et al(1980).Cell21285-294]的35S启动子的HincII内切酶位点-HphI内切酶粒点之间的区域。不同品系之间CaMV株的核苷酸序列十分相似。35S启动子片段以472碱基对(bp)EcoRI-PstI片段形式从pZ027质粒上切下来，包括多聚接头区的一部分，437碱基对(bp)的非转录区，转录起始位点及7个碱基对(bp)的非翻译引导区但不含有任何35S的翻译启动子。35S启动子片段用T4连接酶连接到E.coRl-PstI线性化pZ0008质粒上。质粒pZ0008载有以270bp PstI-HindIII片段形式出现的胭脂碱合成酶(NOS)多聚腺苷化信号。形成的重组质粒pZU-A载有35S启动子，唯一的PstI内切酶位点及NOS终止子[Gielen etal(1991)Bio/Technology 101363]实施例8所产生转录本在用黄瓜花叶病毒(CMV)感染时能复制的植物转化载体的构建使用两个引物，将CMV负义RNA3的5′末端直接与CaMV35S启动子的转录起始位点相融合，ZUP148，5′CCACGTCTTC AAAGCAG3′(与CaMV35S启动子的核苷酸互补)以及ZUP146，5′CTTCGCACCT TCGTGGGGGC TCCAAAAGGA GACCACCTCTCCAAATGAAA 3′(含有与Seq.Id.No.1的1860-1827位核苷酸互补的核苷酸)以pZU-A为模板进行标准DNA多聚酶链式反应。扩增的DNA片段用E.coRV内切酶切，并把它克隆到含E.coRV酶切后而线性化的pZU-A质粒中。生成的质粒以Bstxl和Pstl酶切，并在琼脂糖凝胶上纯化。PZU181用PstI和BstXI酶切之后，在琼脂糖凝胶上纯化得到2.1kb长DNA插入片段，随后把它克隆到经凝胶纯化的pZU-A质粒衍生物上，形成pCMV3AS-1质粒。
以pCMV3AS-1为模板，对两个DNA片段进行PCR扩增，使pCMV3AS-1的运动蛋白(MP)编码域被含单一NcoI克隆位点片段取代，肝炎Hepatitisδ病毒RNA的斧头结构被克隆到CMV负义RNA3的3′末端的下游。第一个DNA片段使用引物ZUP505′AGCTGCTAAC GTCTTATTAA G 3′(含有与序列(Seq)Id.No.11020-1039位核苷酸互补的核苷酸)以及ZUP3295′GTCTTTAGCA CCATGGTG 3′(含有与序列(Seq)Id.No.1604-612位核苷酸相同的核苷酸)DNA片段用NruI及NcoI酶酶切。并从琼脂糖凝胶上分离到411bp长的DNA片段位在片段(Seq)Id.No.1的607-1016。第二个DNA片段用引物ZUP327
5′GGAGAGCCAT GGCTCGGG 3′(含有与序列(Seq).Id.No.1的115-126位核苷酸互补的核苷酸)以及ZUP350扩增，该引物用核苷酸合成，含有与反基因组肝炎与病毒RNA互补的核苷酸，(正如Perrotta AT & Been MD(1991)Nature VoL 350(4)pp434-436所描述)，同与片段(Seq)Id.No.1的1-14位核苷酸相同的核苷酸(该引物的3′末端)相连接。
5′TTTCTGCAGATCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCGTAATCTT ACCACT) 3′该DNA片段用PstI及NcoI酶酶切，并从琼脂糖凝胶分离得208bp长的DNA片段。所得到的两个片段都克隆到pCMV3AS-1中，用PstI和NruI酶切并线性化，以得到pCV3AS-2。编码引发体(elicitor)(实施例5)或细胞抑制蛋白(实施例6)的基因可作为NcoI酶切DNA片段克隆到pCMV3AS-2的单一NcoI位点上。形成的pCV3AS-2衍生质粒用HindIII酶酶切，含有嵌合基因的DNA片段就可从琼脂糖凝胶上分离出来，并连接到HindIII酶切线性化的pBIN19上，分别形成二元体植物转化载体pBINCMV3-CP、pBINCMV3-P30和pBINCMV3-T1。
实施例9在感染西红柿斑点枯萎病病毒(TSWV)时能复制所生成转录本的植物转化载体的构建。
使用两个引物ZUP148(实施例8)和引物ZUP255，以pZU-A为模板进行标准DNA PCR反应，使反义西红柿斑点枯萎病毒(TSWV)S RNA的5′末端直接和CaMV 35S启动子的转录起始位点融合。ZUP2555′ACACAATTGC TCTCCTCTCC AAATGAAA 3′(含有与序列(Seq).Id.No.8的2608-2621位核苷酸相同的核苷酸)
扩增的DNA片段用E.coRV酶切，并克隆到E.coRV酶切线性化过的质粒pZU-A上。生成的质粒用MunI和PstI酶切，并在琼脂糖凝胶上纯化。pTSWV-S2用Pstl和MunI酶切，取2.9kb的插入DNA片段在琼脂糖凝胶上纯化，然后把它克隆到凝胶上纯化过的pZU-A质粒衍生物上，形成pTSWVSAS-1质粒。
通过以pTSWVSAS-1质粒为模板，用PCR扩增两个DNA片段，pTSWVSAS-1质粒的N编码域被含单一NcoI酶切的克隆位点取代，肝炎(Hepatitis)病毒RNA的斧形结构克隆到反义TSMV S RNA 的3′末端下游。第一个DNA片段用引物ZUP252扩增5′GACCCGAAAG GGACCAATTT C 3′(含有与Seq Id.No.8911-930位核苷酸互补核苷酸)以及ZUP2535′TTTCCATGGC TGTAAGTTAA ATT 3′(含有与Seq Id.No.8636-655位核苷酸互补核苷酸)用BalI和NcoI酶切该DNA片段，并从琼脂凝胶上分离得269bp碱基对长的DNA片段(Seq Id.No.8的636-911位)。第二个DNA片段用引物ZUP2545′TTTCCATGGT GATCGTAAAA G 3′(含有与Seq.Id.No.8的140-157位核苷酸互补的核苷酸)以及ZUP255扩增。ZUP255是用核苷酸人工合成的引物含有与反基因组肝炎δ病毒RNA(正如Perrotta AT和Been MD(1991)Nature Vol 350(4)pp434-436中所描述互补核苷酸，并连接到与片段(Seq)Id.No.8的1-14核苷酸(引物的3′末端相同的核苷酸上
5′TTTCTGCAGA TCTTAGCCAT CCGAGTGGAC GTGCGTCCTCCTTCGGATGC CCAGGTCGGA CCGCGAGGAG GTGGAGATGC CATGCCGACCCAGAGCAATC GTGTC 3′用pstI和NcoI酶切DNA片段，并从琼脂糖凝胶分离到245bp的DNA片段上。所得到的两个片段都克隆到pTSWVSAS-1质粒中，用PstI和BalI酶切线性化，生成pTSWVSAS-2编码引发体elicitor(实施例5)或细胞抑制蛋白(实施例6)的基因作为NcoI酶切的DNA片段克隆到pTSWVSAS-2的单一NcoI酶切位点上。生成的pTSWVSAS-2衍生质粒用XbaI酶切，并把含有嵌合基因的DNA片段从琼脂糖凝胶上分离出来，再连接到XbaI酶切线性化pBIN-19质粒上，分别生成二元体植物转化运载体质粒pBINTSWVS-CP(Seq Id.No.8)、pBINTSWVS-P30和pBINTSWVS-T1。
实施例10选择合用的寄主植物1)烟草学名为Nicotina tabacum var.Samsun EN，一种携有N.sylvestris的N′基因的烟草栽培品种，当受到西柿花叶病毒(ToMV)侵染时表现出高度敏感反应。ToMV的外壳蛋白CP在该寄主中引出强的过敏反应的防御反应。
2)西红柿学名Lycopersicon esculentum var.ATV847，是商用杂交品系Yaiza和Gemma的亲本品系。是一种携有抗ToMV的Tm-22抗性基因的西红柿品系。已经证实西红柿花叶病毒(ToMV)的蛋白30(P30)在resistag30nt基因型中引起高度敏感(HS)反应[Fraser(1986)CRC Crit.Rev.Plant Sci3257；keen(1990)，Ann.Rev.Genet.24447]。
实施例11二元运载体在烟草和西红柿植物材料中的转化将二元运载体转入植物材料的方法已完善地建立起来，且已为专业人员所熟识。由于所用的土壤杆菌(Agrobacterium)品系不同、分离块材料来源不同、所依赖的再生体系不同、以及所采用栽培品种和植物种类不同，所以也存在有步骤操作的不同。
上述二元植物转化运载体按下面步骤用于植物转化实验。二元运载体构建物通过三亲株交配转入受体根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumfaciens)菌株中。接着对在外一接合体进行Southern分析以证实该构建物已合适转入受体菌株中，用选出的根癌土壤杆菌接种到无菌分离块上并共同培养，用合适的抗生素选择性杀死根癌土壤杆菌，在含有卡那霉素的选择性培养基上以能否生长选出转化细胞，转移组织块到诱生枝条的培养基中，把选出的枝条转移到诱导生根的培养基中，把小植物转移到土壤。从转基因植物中分离总DNA进行Southern分析，检测结构的完整性，通过Northern分析和/或酶分析以及对蛋白进行Western blot分析，检测插入进去的嵌合基因的合适功能。[Ausubel et al supra，(1987)]。
实施例12嵌合序列在烟草及西红柿植物细胞中的表达按下面程式从再生植物叶中提取RNA。将200mg叶子在液氮中研成细末。加入800μlRNA抽提缓冲液(100mM Tris.Hcl(pH8.0)，500mM NaCl，2mM EDTA，200mMβ巯基乙醇，0.4％SDS)用苯酚抽提匀浆。经乙醇沉淀收集核酸。将核酸重新悬浮于含0.5ml10MTris.HCl(pH8.0)，1mMEDTA溶液中加入LiCl，使其终浓度为2M。冰上放置4小时后，离心收集RNA。把这RNA重新悬浮于含400μl10mMTris HCI(pH8.0)1mM EDTA液中经乙醇沉淀，最后，把沉淀的RNA重新悬浮于50μl10mM Tris·HCl(pH8.0)1mM EDTA中。RNA在二醛/琼脂糖凝胶上分离开，印迹到基因屏幕纸上(Greenscreen)，如van Grinsven等人所描述[(1986).Theor.Appl.Gen.7394-101]。用[32P]、[35S]或非放射标记技术标记的DNA或RNA探针来探测重组病毒RNA序列，根据Northern分析，可以确定在上再生植物嵌合重组病毒基因表达到何种程度。
用重组病毒DNA序列转化过的植物在接种各种病毒之后也进行蛋白印迹(western blot)分析。按照Laemmli[(1970).Nature24429]方法，通过在样品缓冲液中研磨从转化植物叶中抽提蛋白。基本上如Laemmli supra所描述(1970)那样，把蛋白一份50μg在12.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后Towbin等所描述的(1979，Proc.Natl Acad.Sci，USA764350)把分开的蛋白转移到硝酸纤维膜上，又根据上述Towbin等的方法(1979)用对纯化的西红柿花叶病毒颗粒或对纯化的P30蛋白作用所产生的抗血清与转移蛋白反应。根据western印迹分析的结果，确认转化植物在接种了各自的病毒之后，确实表达了激发体(elicitor)蛋白的。
实施例13烟草及西红柿植物对黄瓜花叶病毒(CMV)或西红柿斑点枯萎病毒(TSWV)感染的抗性转化植物在标准隔离条件下的温室中生长，以防止病原体感染。植物转化体自身传粉并收获种子。分析子代植物插入基因的分离，然后通过机械接种感染CWV或TSWV。从用CMV或TSWV全面感染的植株中获取组织，在5倍体积冰冷的接种缓冲液10mM磷酸缓冲液中研碎、掺入金刚砂粉末、在大约5周龄幼苗的最初两个完全舒展的叶子上涂擦接种，在接种后3周内，监测接种植株症状的发展。
含有CMV相关或TSWV相关DNA序列的植物，与未经转化的对照植株相比，表现出对CMV或TSWV感染的感病性下降。后者在接种后7天之内，表现出严重的全株性的CMV或TSWV症状。
序列一览表序列ID No.1序列类型核苷酸序列长度1860个核苷酸链型单链分子类型编码西红柿花叶病毒(ToMV)的外壳蛋白(CP)的嵌合黄瓜花叶病毒RNA3。GTAATCTTAC CACTCGTGTG TGTGCGTGTG TGTGTGTCGA GTCGTGTTGT CCGCACATTT 60GAGTCGTGCT GTCCGCACAT ATATTTTACC TTTTGTGTAC AGTGTGTTAG ATTTCCCGAG 120CCATGGCTTA CTCAATCACT TCTCCATCGC AATTTGTGTT TTTGTCATCT GTATGGGCTG 180ACCCTATAGA ATTGTTAAAC GTTTGTACAA ATTCGTTAGG TAACCAGTTT CAAACACAGC 240AAGCAAGAAC TACTGTTCAA CAGCAGTTCA GCGAGGTGTG GAAACCTTTC CCTCAGAGCA 300CCGTCAGATT TCCTGGCGAT GTTTATAAGG TGTACAGGTA CAATGCAGTT TTAGATCCTC 360TAATTACTGC GTTGCTGGGG TCTTTCGATA CTAGGAATAG AATAATCGAA GTAGAAAACC 420AGCAGAATCC GACAACAGCT GAAACGTTAG ATGCTACCCG CAGGGTAGAC GACGCTACGG 480TTGCAATTCG GTCTGCTATA AATAATTTAG TTAATGAACT AGTAAGAGGT ACTGGACTGT 540ACAATCAAAA TACTTTTGAA AGTATGTCTG GGTTGGTCTG GACCTCTGCA CCTGCATCTT 600AAATCCATGG TGTATTAGTA TATAAGTATT GTGAGTCTGT ACATAATACT ATATCTATAG 660TGTCCTGTGT GAGTTGATAC AGTAGACATC TGTGACGCGA TGCCGTGTTG AGAAGGGAAC 720ACATCTGGTT TTAGTAAGCC TACATCACAG TTTTGAGGTT CAATTCCTCA TACTCCCTGT 780TGAGTCCCTT ACTTTCTCAT GGATGCTTCT CCGCGAGATT GCGTTATTGT CTACTGACTA 840TATAGAGAGT GTGTGTGCTG TGTTTTCTCT TTTGTGTCGT AGAATTGAGT CGAGTCATGG 900ACAAATCTGA ATCAACCAGT GCTGGTCGTA ACCGTCGACG TCGTCCGCGT CGTGGTTCCC 960GCTCCGCCCC CTCCTCCGCG GATGCTAACT TTAGAGTCTT GTCGCAGCAG CTTTCGCGAC1020TTAATAAGAC GTTAGCAGCT GGTCGTCCAA CTATTAACCA CCCAACCTTT GTAGGGAGTG1080AACGCTGTAA ACCTGGGTAC ACGTTCACAT CTATTACCCT AAAGCCACCA AAAATAGACC1140GTGGGTCTTA TTACGGTAAA AGGTTGTTAT TACCTGATTC AGTCACGGAA TATGATAAGA1200AACTTGTTTC GCGCATTCAA ATTCGAGTTA ATCCTTTGCC GAAATTCGAT TCTACCGTGT1260GGGTGACAGT CCGTAAAGTT CCTGCCTCCT CGGACTTATC CGTTGCCGCC ATCTCTGCTA1320TGTTTGCGGA CGCCGCATTT GGAGTCCAAG CTAACAACAA ATTGTTGTAT GATCTTTCGG1380CGGGAGCCTC ACCGGTACTG GTTTATCAGT ACATGCGCGC TGATATAGGT GACATGAGAA1440AGTACGCCGT CCTCGTGTAT TCAAAAGACG ATGCGCTCGA GACGGACGAG CTAGTACTTC1500ATGTTGACAT CGAGCACCAA CGCATTCCCA CATCTAGAGT ACTCCCAGTC TGATTCCGTG1560TTCCCAGAAC CCTCCCCCCG ATTTCTGTGG CGGGAGCTGA GTTGGCAGTT CTGCTATAAA1620CTGTCTGAAG TCACTAAACG TTTTACGGTG AACGGGTTGT CCATCCAGCT TACGGCTAAA1680ATGGTCAGTC GTGGAGAAAT CCACGCCAGC AGATTTACAA ATCTCTGAGG CGCCTTTGAA1740ACCATCTCCT AGGTTTTTTC GGAAGGACTT CGGTCCGTGT ACCTCTAGCA CAACGTGCTA1800GTCTTAGGGT ACGGGTGCCC CTTGTCTTCG CACCTTCGTG GGGGCTCCAA AAGGAGACCA1860序列ID No.2序列类型氨基酸序列长度159个氨基酸链 单链分子类型西红柿花叶病毒(ToMV)的外壳蛋白(对应于片段(Seq)ID.No.1的123-599位核苷酸)。Met Ala Tyr Ser Ile Thr Ser Pro Ser Gln Phe Val Phe Leu Ser 15Ser Val Trp Ala Asp Pro Ile Glu Leu Leu Asn Val Cys Thr Asn 30Ser Leu Gly Asn Gln Phe Gln Thr Gln Gln Ala Arg Thr Thr val 45Gln Gln Gln Phe Ser Glu Val Trp Lys Pro Phe Pro Gln Ser Thr 60Val Arg Phe Pro Gly Asp Val Tyr Lys Val Tyr Arg Tyr Asn Ala 75Val Leu Asp Pro Leu Ile Thr Ala Leu Leu Gly Ser Phe Asp Thr 90Arg Asn Arg Ile Ile Glu Val Glu Asn Gln Gln Asn Pro Thr Thr 105Ala Glu Thr Leu Asp Ala Thr Arg Arg Val Asp Asp Ala Thr Val 120Ala Ile Arg Ser Ala Ile Asn Asn Leu Val Asn Glu Leu Val Arg 135Gly Thr Gly Leu Tyr Asn Gln Asn Thr Phe Glu Ser Met Ser Gly 150Leu Val Trp Thr Ser Ala Pro Ala Ser 159序列ID No.3序列类型氨基酸序列长度218个氨基酸链 单链分子类型黄瓜花叶病毒外壳蛋白对应片段(Seq).ID No.1897-1550位核苷酸Met Asp Lys Ser Glu Ser Thr Ser Ala Gly Arg Asn Arg Arg Arg 15Arg Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ser Ala Pro Ser Ser Ala Asp Ala 30Asn Phe Arg Val Leu Ser Gln Gln Leu Ser Arg Leu Asn Lys Thr 45Leu Ala Ala Gly Arg Pro Thr Ile Asn His Pro Thr Phe Val Gly 60Ser Glu Arg Cys Lys Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ile Thr Leu 75Lys Pro Pro Lys Ile Asp Arg Gly Ser Tyr Tyr Gly Lys Arg Leu 90Leu Leu Pro Asp Ser Val Thr Glu Tyr Asp Lys Lys Leu Val Ser 105Arg Ile Gln Ile Arg Val Asn Pro Leu Pro Lys Phe Asp Ser Thr 120Val Trp Val Thr Val Arg Lys Val Pro Ala Ser Ser Asp Leu Ser 135Val Ala Ala Ile Ser Ala Met Phe Ala Asp Gly Ala Ser Pro Val 150Leu Val Tyr Gln Tyr Ala Ala Phe Gly Val Gln Ala Asn Asn Lys 165Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Ala Met Arg Ala Asp Ile Gly Asp Met 180Arg Lys Tyr Ala Val Leu Val Tyr Ser Lys Asp Asp Ala Leu Glu 195Thr Asp Glu Leu Val Leu His Val Asp Ile Glu His Gln Arg Ile 210Pro Thr Ser Arg Val Leu Pro Val 218序列ID No.4序列类型核苷酸序列长度1696个核苷酸链 单链分子类型编码Rnase T1的嵌合黄瓜花叶病毒RNA3GTAATCTTAC CACTCGTGTG TGTGCGTGTG TGTGTGTCGA GTCGTGTTGT CCGCACATTT60GAGTCGTGCT GTCCGCACAT ATATTTTACC TTTTGTGTAC AGTGTGTTAG ATTTCCCGAG 120CCATGGCATG CGACTACACT TGCGGTTCTA ACTGCTACTC TTCTTCAGAC GTTTCTACT180CTCAAGCTGC CGGATATAAA CTTCACGAAG ACGGTGAAAC TGTTGGATCT AATTCTTACC 240CACACAAATA CAACAACTAC GAAGGTTTTG ATTTCTCTGT GAGCTCTCCC TACTACGAAT 300GGCCTATCCT CTCTAGCGGT GATGTTTACT CTGGTGGTTC TCCAGGTGCT GACCGTGTCG 360TCTTCAACGA AAACAACCAA CTAGCTGGTG TTATCACTCA CACTGGTGCT TCTGGTAACA 420ACTTCGTTGA ATGTACATAA CCATGGTGTA TTAGTATATA AGTATTGTGA GTCTGTACAT 480AATACTATAT CTATAGTGTC CTGTGTGAGT TGATACAGTA GACATCTGTG ACGCGATGCC 540GTGTTGAGAA GGGAACACAT CTGGTTTTAG TAAGCCTACA TCACAGTTTT GAGGTTCAAT 600TCCTCATACT CCCTGTTGAG TCCCTTACTT TCTCATGGAT GCTTCTCCGC GAGATTGCGT 660TATTGTCTAC TGACTATATA GAGAGTGTGT GTGCTGTGTT TTCTCTTTTG TGTCGTAGAA 720TTGAGTCGAG TCATGGACAA ATCTGAATCA ACCAGTGCTG GTCGTAACCG TCGACGTCGT 780CCGCGTCGTG GTTCCCGCTC CGCCCCCTCC TCCGCGGATG CTAACTTTAG AGTCTTGTCG 840CAGCAGCTTT CGCGACTTAA TAAGACGTTA GCAGCTGGTC GTCCAACTAT TAACCACCCA 900ACCTTTGTAG GGAGTGAACG CTGTAAACCT GGGTACACGT TCACATCTAT TACCCTAAAG 960CCACCAAAAA TAGACCGTGG GTCTTATTAC GGTAAAAGGT TGTTATTACC TGATTCAGTC 1020ACGGAATATG ATAAGAAACT TGTTTCGCGC ATTCAAATTC GAGTTAATCC TTTGCCGAAA 1080TTCGATTCTA CCGTGTGGGT GACAGTCCGT AAAGTTCCTG CCTCCTCGGA CTTATCCGTT 1140GCCGCCATCT CTGCTATGTT TGCGGACGGA GCCTCACCGG TACTGGTTTA TCAGTACGCC 1200GCATTTGGAG TCCAAGCTAA CAACAAATTG TTGTATGATC TTTCGGCGAT GCGCGCTGAT 1260ATAGGTGACA TGAGAAAGTA CGCCGTCCTC GTGTATTCAA AAGACGATGC GCTCGAGACG 1320GACGAGCTAG TACTTCATGT TGACATCGAG CACCAACGCA TTCCCACATC TAGAGTACTC 1380CCAGTCTGAT TCCGTGTTCC CAGAACCCTC CCTCCGATTT CTGTGGCGGG AGCTGAGTTG 1440GCAGTTCTGC TATAAACTGT CTGAAGTCAC TAAACGTTTT ACGGTGAACG GGTTGTCCAT 1500CCAGCTTACG GCTAAAATGG TCAGTCGTGG AGAAATCCAC GCCAGCAGAT TTACAAATCT 1560CTGAGGCGCC TTTGAAACCA TCTCCTAGGT TTTTTCGGAA GGACTTCGGT CCGTGTACCT 1620CTAGCACAAC GTGCTAGTCT TAGGGTACGG GTGCCCCTTG TCTTCGCACC TTCGTGGGGG 1680CTCCAAAAGG AGACCA 1696序列ID NO.5序列类型氨基酸序列长度105个氨基酸链 单链分子类型RNase T1，对应于序列(Seq Id.No.4的123-437位Met Ala Cys Asp Tyr Thr Cys Gly Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Ser 15Asp Val Ser Thr Ala Gln Ala Ala Gly Tyr Lys Leu His Glu Asp 30Gly Glu Thr Val Gly Ser Asn Ser Tyr Pro His Lys Tyr Asn Asn 45Tyr Glu Gly Phe Asp Phe Ser Val Ser Ser Pro Tyr Tyr Glu Trp 60Pro Ile Leu Ser Ser Gly Asp Val Tyr Ser Gly Gly Ser Pro Gly 75Ala Asp Arg Val Val Phe Asn Glu Asn Asn Gln Leu Ala Gly Val 90Ile Thr His Thr Gly Ala Ser Gly Asn Asn Phe Val Glu Cys Thr 105序列ID No.6序列类型核苷酸序列长度2173个核苷酸链 单链分子类型嵌合黄瓜花叶病毒RNA3，编码西红柿花叶病毒(ToMV)的P30。GTAATCTTAC CACTCGTGTG TGTGCGTGTG TGTGTGTCGA GTCGTGTTGT CCGCACATTT 60GAGTCGTGCT GTCCGCACAT ATATTTTACC TTTTGTGTAC AGTGTGTTAG ATTTCCCGAG120CCATGGCTCT AGTTGTTAAA GGTAAGGTAA ATATTAATGA GTTTATCGAT CTGTCAAAGT180CTGAGAAACT TCTCCCGTCG ATGTTCACGC CTGTAAAGAG TGTTATGGTT TCAAAGGTTG240ATAAGATTAT GGTCCATGAA AATGAATCAT TGTCTGAAGT AAATCTCTTA AAAGGTGTAA300AACTTATAGA AGGTGGGTAT GTTTGCTTAG TTGGTCTTGT TGTGTCCGGT GAGTGGAATT360TCCCAGATAA TCGCCGTGGT GGTGTGAGTG TCTGCATGGT TGACAAGAGA ATGGAAAGAG420CGGACGAAGC CACACTGGGG TCATATTACA CTGCTGCTGC TAAAAAGCGG TTTCAGTTTA480AAGTGGTCCC AAATTACGGT ATTACAACAA AGGATGCAGA AAAGAACATA TGGCAGGTCT540TAGTAAATAT TAAAAATGTA AAAATGAGTG CGGGCTACTG CCCTTTGTCA TTAGAATTTG600TGTCTGTGTG TATTGTTTAT AAAAATAATA TAAAATTGGG TTTGAGGGAG AAAGTAACGA660GTGTGAACGA TGGAGGACCC ATGGAACTTT CGGAAGAAGT TGTTGATGAG TTCATGGAGA720ATGTTCCAAT GTCGGTTAGA CTCGCAAAGT TTCGAACCAA ATCCTCAAAA AGAGGTCCGA780AAAATAATAA TAATTTAGGT AAGGGGCGTT CAGGCGGAAG GCCTAAACCA AAAAGTTTTG840ATGAAGTTGA AAAAGAGTTT GATAATTTGA TTGAAGATGA AGCCGAGACG TCGGTCGCGG900ATTCTGATTC GTATTAACCA TGGTGTATTA GTATATAAGT ATTGTGAGTC TGTACATAAT960ACTATATCTA TAGTGTCCTG TGTGAGTTGA TACAGTAGAC ATCTGTGACG CGATGCCGTG 1020TTGAGAAGGG AACACATCTG GTgTTAGTAA GCCTACATCA CAGTTTTGAG GTTCAATTCC 1080TCATACTCCC TGTTGAGTCC CTTACTTTCT CATGGATGCT TCTCCGCGAG ATTGCGTTAT 1140TGTCTACTGA CTATATAGAG AGTGTGTGTG CTGTGTTTTC TCTTTTGTGT CGTAGAATTG 1200AGTCGAGTCA TGGACAAATC TGAATCAACC AGTGCTGGTC GTAACCGTCG ACGTCGTCCG 1260CGTCGTGGTT CCCGCTCCGC CCCCTCCTCC GCGGATGCTA ACTTTAGAGT CTTGTCGCAG 1320CAGCTTTCGC GACTTAATAA GAcGTTAGCA GCTGGTCGTC CAACTATTAA CCACCCAACC 1380TTTGTAGGGA GTGAACGCTG TAAACCTGGG TACACGTTCA CATCTATTAC CCTAAAGCCA 1440CCAAAAATAG ACCGTGGGTC TTATTACGGT AAAAGGTTGT TATTACCTGA TTCAGTCACG 1500GAATATGATA AGAAACTTGT TTCGCGCATT CAAATTCGAG TTAATCCTTT GCCGAAATTC 1560GATTCTACCG TGTGGGTGAC AGTCCGTAAA GTTCCTGCCT CCTCGGACTT ATCCGTTGCC 1620GCCATCTCTG CTATGTTTGC GGACGCCGCA TTTGGAGTCC AAGCTAACAA CAAATTGTTG 1680TATGATCTTT CGGCGGGAGC CTCACCGGTA CTGGTTTATC AGTACATGCG CGCTGATATA 1740GGTGACATGA GAAAGTACGC CGTCCTCGTG TATTCAAAAG ACGATGCGCT CGAGACGGAC 1800GAGCTAGTAC TTCATGTTGA CATCGAGCAC CAACGCATTC CCACATCTAG AGTACTCCCA 1860GTCTGATTCC GTGTTCCCAG AACCCTCCCT CCGATTTCTG TGGCGGGAGC TGAGTTGGCA 1920GTTCTGCTAT AAACTGTCTG AAGTCACTAA ACGTTTTACG GTGAACGGGT TGTCCATCCA 1980GCTTACGGCT AAAATGGTCA GTCGTGGAGA AATCCACGCC AGCAGATTTA CAAATCTCTG 2040AGGCGCCTTT GAAACCATCT CCTAGGTTTT TTCGGAAGGA CTTCGGTCCG TGTACCTCTA 2100GCACAACGTG CTAGTCTTAG GGTACGGGTG CCCCTTGTCT TCGCACCTTC GTGGGGGCTC 2160CAAAAGGAGA CCA2173序列ID No.7序列类型氨基酸序列长度264个氨基酸链 单链分子类型西红柿花叶病毒(ToMV)的蛋白30(P30)，对应于序列(Seq)ID No.6的123-914位Met Ala Leu Val Val Lys Gly Lys Val Asn Ile Asn Glu Phe Ile 15Asp Leu Ser Lys Ser Glu Lys Leu Leu Pro Ser Met Phe Thr Pro 30Val Lys Ser Val Met Val Ser Lys Val Asp Lys Ile Met Val His 45Glu Asn Glu Ser Leu Ser Glu Val Asn Leu Leu Lys Gly Val Lys 60Leu Ile Glu Gly Gly Tyr Val Cys Leu Val Gly Leu Val Val Ser 75Gly Glu Trp Asn Phe Pro Asp Asn Arg Arg Gly Gly Val Ser Val 90Cys Met Val Asp Lys Arg Met Glu Arg Ala Asp Glu Ala Thr Leu 105Gly Ser Tyr Tyr Thr Ala Ala Ala Lys Lys Arg Phe Gln Phe Lys 120Val Val Pro Asn Tyr Gly Ile Thr Thr Lys Asp Ala Glu Lys Asn 135Ile Trp Gln Val Leu Val Asn Ile Lys Asn Val Lys Met Ser Ala 150Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Leu Glu Phe Val Ser Val Cys Ile Val 165Tyr Lys Asn Asn Ile Lys Leu Gly Leu Arg Glu Lys Val Thr Ser 180Val Asn Asp Gly Gly Pro Met Glu Leu Ser Glu Glu Val Val Asp 195Glu Phe Met Glu Asn Val Pro Met Ser Val Arg Leu Ala Lys Phe 210Arg Thr Lys Ser Ser Lys Arg Gly Pro Lys Asn Asn Asn Asn Leu 225Gly Lys Gly Arg Ser Gly Gly Arg Pro Lys Pro Lys Ser Phe Asp 240Glu Val Glu Lys Glu Phe Asp Asn Leu Ile Glu Asp Glu Ala Glu 255Thr Ser Val Ala Asp Ser Asp Ser Tyr 264序列ID No.8序列类型核苷酸序列长度7621个核苷酸链 单链分子类型嵌合西红柿斑点枯萎病毒S RNA，编码西红柿花叶病毒ToMV外壳蛋白及相反极性的非结构蛋白NS。AGAGCAATCG TGTCAATTTT GTGTTCATAC CTTAACACTC AGTCTTACAA ATCATCACAT 60TAAGAACCTA AGAAACGACT GCGGGATACA GAGTTGCACT TTCGCACCTT GAGTTACATA 120CGGTCAAAGC ATATAACAAC TTTTACGATC ACCATGGCTT ACTCAATCAC TTCTCCATCG l80CAATTTGTGT TTTTGTCATC TGTATGGGCT GACCCTATAG AATTGTTAAA CGTTTGTACA 240AATTCGTTAG GTAACCAGTT TCAAACACAG CAAGCAAGAA CTACTGTTCA ACAGCAGTTC 300AGCGAGGTGT GGAAACCTTT CCCTCAGAGC ACCGTCAGAT TTCCTGGCGA TGTTTATAAG 360GTGTACAGGT ACAATGCAGT TTTAGATCCT CTAATTACTG CGTTGCTGGG GTCTTTCGAT 420ACTAGGAATA GAATAATCGA AGTAGAAAAC CAGCAGAATC CGACAACAGC TGAAACGTTA 480GATGCTACCC GCAGGGTAGA CGACGCTACG GTTGCAATTC GGTCTGCTAT AAATAATTTA 540GTTAATGAAC TAGTAAGAGG TACTGGACTG TACAATCAAA ATACTTTTGA AAGTATGTCT 600GGGTTGGTCT GGACCTCTGC ACCTGCATCT TAAATCCATG GCTGTAAGTT AAATTATAAA 660AAAGCCTATA AATATATAAA GCTTTCTTTA TCTTTATTGC TTGTGCTTGC TTAGTGTGTT 720AAATTTTAAA TAAGTGTGTT TAATTAAAGT TTGCTTTCTG TGTGTTGTGC TTAATAAATA 780ATAAAATAAC AAAAACAACG AAAACAAAAA ATAAATAAAA TAAAAATAAA ATAAAAATAA 840AATAAAATAA AAATAAAATA AAAAATAAAA AACAAAAAAC AAAAAACAAA AACAAAACCC 900AAATTTGGCC AAATTGGTCC CTTTCGGGTC TTTTTGGTTT TTCGTTTTTT AATTTTTTGT960TGTTTTTATT TCATTTTTTG ATTTTATTTT ATTTTAATTT TATTTTCATT TTTATTTTTT 1020GTTTTTATGG TTTCTACTAG ACAGGAGGAA TTTGAAAGAG ATGACAAACA GAGAAATAAT 1080TATAAGTAAA GAAAGAAAAT AAACATAACA TAATTAGAAA AAGCTGGACA AAGCAAGATT 1140ATTTTGATCC TGAAGCATAC GCTTCCTTAA CCTTAGATTC TTTCTTTTTG ATCCCGCTTA 1200AATCAAGCTT TAACAAAGAT TTTGCAACTG AAATAGATTG TGGAGAAATT TTAATTTCTC 1250CTCTGGCAAA GTCTATCTTC CATGAAGGGA TTTGGATGCT GTCTAAGTAA GACATAGTTT 1320GTGTGTTAGA TGGAAGACAT TCAAGTGTTT TTGAAAGGAA ATATTTCCTT TTGTAGGCAT 1380CTTCACTGTA ATTCAAGGTT CTTTCACCTA AATCTAACTT TCCAGGAGTT AGCTCAAGGT 1440TGTTCAAAGT GTAGATGATT ACATCTTCTT GCAAGTTAGT TGCAAAGAAC TTGTGCAAAG 1500ATGTGTGAGT TTCGAGCCAG AGCATTGGAA CCGATCCTTT GGGGTATGAA GGGTCATGAA 1560CAATGTTGTA AGGCTCCTTT AAATCAGAAA ACATCATTGA TAATTCAAAA GGAGCTTTGC 1620ATTTGCGAAT TGGGAGCTGA TGCTTGCAAA TAACAGTAAT GTTTAAAGCT GTCTCAACAC 1680TGTTATGGTT TGGAATGCAG GCAATAGATA AATAAAATGT TTTGTTTGTT TCATCTCCTG 1740CAACCTTGAA CAATTTCTGA ATGGAAACCT GCTTCAAAAC CTTTGGAACC CTTAGCCAGA 1800GGCTCAGCTT GAAATGAGAA TCAGTGGAAG CTTGAGAGTT AGGCATGATG TTGTTTTCTG 1860CTGACATGAG CAGAGATTTC ACTGCAAGAG AATTTACAGT TCTGTTGTTG CTTTCAACTT 1920GATTGAAATT TGGCTTGAAA CTGTACAGCC ATTCATGGAC ATTTCTGTTA GGAGATAGAA 1980CATTCACTTT GCCTAAAGCC TGATTATAGC ACATCTCGAT CTTATAGGTA TGCTCTTTGA 2040CACAAGACAA AGAGCCTTTG TTTGCAGCTT CAATGTATTT GTCATTGGGA ATTATGTCTT 2100TTTCTTGGAG CTGGAATCGG TCTGTAATAT CAGATCTGTT CATGATAGAT TCAATAGAGT 2160GGAGCTGGGC AGGAGACAAA ACCTTCAAAT GACCTTGATG TTTCACTCCG TTAGCATTGA 2220CTGTATTTGA GCAAACAGAT AGTGCCAGAA CAGAGTTATC AATATTGATG CTAAAATCAA 2280TATCATCAAA AATAGGGATA TACACATGCT GAGAAAGAAA TCTCTTCTTC TTCACAGGGA 2340AGATCCCTAC TTTGCAGTAT AGCCAAAGGA CTACTTTGCT TCTTGAATCA GAATACAGCT 2400GGGTCTGAAC TAGTTGAGAA CCAGTACCAA GTTCATGAAT CCAGTAAGAA TCTACAACAG 2460CTTTACCAGA TGCAGTTGAT CCCCAGACTG AAGCTCTTGT CTGAATGATC GACTCATAAA 2520CACTTGAAGA CATTATGGTT ATTGGTACTG TGTTCTTATT ACAGTATTGT GATTTTCTAA 2580GTGAGGTTTG ATTATGAACA AAATTCTGAC ACAATTGCTC T 2621序列ID No.9序列类型氨基酸序列长度464个氨基酸链 单链分子类型无结构蛋白NSP，对应于序列(Seq)ID No.8的1142-2533(以相反极性)位核苷酸。Mez Ser Ser Ser Val Tyr Glu Ser Ile Ile Gln Thr Arg Ala Ser 15Val Trp Gly Ser Thr Ala Ser Gly Lys Ala Val Val Asp Ser Tyr 30Trp Ile His Glu Leu Gly Thr Gly Ser Gln Leu Val Gln Thr Gln 45Leu Tyr Ser Asp Ser Arg Ser Lys Val Val Leu Trp Leu Tyr Cys 60Lys Val Gly Ile Phe Pro Val Lys Lys Lys Arg Phe Leu Ser Gln 75His Val Tyr Ile Pro Ile Phe Asp Asp Ile Asp Phe Ser Ile Asn 90Ile Asp Asn Ser Val Leu Ala Leu Ser val Cys Ser Asn Thr Val 105Asn Ala Asn Gly Val Lys His Gln Gly His Leu Lys Val Leu Ser 120Pro Ala Gln Leu His Ser Ile Glu Ser Ile Met Asn Arg Ser Asp 135Ile Thr Asp Arg Phe Gln Leu Gln Glu Lys Asp Ile Ile Pro Asn 150Asp Lys Tyr Ile Glu Ala Ala Ash Lys Gly Ser Leu Ser Cys Val 165Lys Glu His Thr Tyr Lys Ile Glu Met Cys Tyr Asn Gln Ala Leu 180Gly Lys Val Asn Val Leu Ser Pro Aan Arg Asn Val His Glu Trp 195Leu Tyr Ser Phe Lys Pro Asn Phe Asn Gln Val Glu Ser Asn Asn 210Arg Thr Val Asn Ser Leu Ala Val Lys Ser Leu Leu Met Ser Ala 225Glu Asn Asn Ile Men Pro Asn Ser Gln Ala Ser Thr Asp Ser His 240Phe Lys Leu Ser Leu Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Leu Lys Gln 255Val Ser Ile Gln Lys Leu Phe Lys Val Ala Gly Asp Glu Thr Asn 270Lys Thr Phe Tyr Leu Ser Ile Ala Cys Ile Pro Asn His Asn Ser 285Val Glu Thr Ala Leu Asn Ile Thr Val Ile Cys Lys His Gln Leu 300Pro Ile Arg Lys Cys Lys Ala Pro Phe Glu Leu Ser Met Met Phe 315Ser Asp Leu Lys Glu Pro Tyr Asn Ile Val His Asp Pro Ser Tyr 330Pro Lys Gly Ser Val Pro Met Leu Trp Leu Glu Thr His Thr Ser 345Leu His Lys Phe Phe Ala Thr Asn Leu Gln Glu Asp Val Ile Ile 360Tyr Thr Leu Asn Asn Leu Glu Leu Thr Pro Gly Lys Leu Asp Leu 375Gly Glu Arg Thr Leu Asn Tyr Ser Glu Asp Ala Tyr Lys Arg Lys 390Tyr Phe Leu Ser Lys Thr Leu Glu Cys Leu Pro Ser Asn Thr Gln 405Thr Met Ser Tyr Leu Asp Ser Ile Gln Ile Pro Ser Trp Lys Ile 420Asp Phe Ala Arg Gly Glu Ile Lys Ile Ser Pro Gln Ser Ile Ser 435Val Ala Lys Ser Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ser Gly Ile Lys Lys 450Lys Glu Ser Lys Val Lys Glu Ala Tyr Ala Ser Gly Ser Lys 46权利要求
1.一种能直接或间接编码反义RNA分子的DNA结构物，它所编码的反义RNA分子具有与入侵植物病毒所编码的依赖于RNA的RNA多聚酶相互作用的能力，在病毒入侵植物时反义RNA分子与所说的侵染病毒编码的依赖于RNA的RNA多聚酶相互作用结果、生成至少一种引发(elicitmg)因子，前述这种结构的表达受能够在植物起作用的启动子和终止子所控制。
2.一种能够编码正义RNA分子的重组DNA结构物，所编码的正义RNA分子能够与病毒侵染植物的病毒所编码的依赖于RNA的RNA多聚酶相互作用，这种相互作用的结果是正义RNA分子能够编码至少一种引发(eliciting)因子
3.一种依据权利要求1包含序列(Seq.)Id.No.1的结构。
4.一种依据权利要求1包含序列(Seq.)Id.No.4的结构。
5.一种依据权利要求1包含序列(Seq.)Id.No.6的结构。
6.一种依据权利要求1包含序列(Seq.)Id.No.8的结构。
7.依据权利要求1或权利要求2的重组DNA结构，其中引发(eliciting)因子从蛋白、多肽、肽类群中选择。
8.一种依据权利要求7的结构，其中引发(eliciting)因子能够引出植物过敏反应或者释放细胞抑制蛋白。
9.一种依据权利要求1或权利要求2的结构，其中引发体(elicitor)的蛋白来源于植物病毒、细菌、真菌、或线虫。
10.一种依据权利要求1或权利要求2的结构，其中细胞抑制蛋白是从核糖核酸酶、蛋白酶、核糖体抑制蛋白、以及细胞壁降解蛋白类群中选择。
11.一种依据权利要求1至10的任一权利要求的结构，其中结构含组成型的启动子，从病毒、真菌、细菌及植物衍生的启动子类群中选择。
12.一种依据权利要求11的结构，其中启动子从CaMV195、nopaline合成酶、章鱼碱合成酶、热休克80启动子类群中选择。
13.其基因组包含依据权利要求1至12任一权利要求的结构的植物。
14.一个依据权利要求13的制备植物的方法包含A)在植物细胞基因组中插入依据权利要求1的DNA结构；B)获得转化细胞；C)从转化细胞中再生在遗传上经过转化植物。
全文摘要
能够编码一种与病毒侵染植物时病毒所编码的依赖于RNA的RNA聚合酶相互作用的RNA分子的DNA结构，作为同所说的侵染病毒所编码的依赖于RNA的RNA聚合酶相互作用的结果，产生了引发eliciting因子或正义RNA分子，借此，任何一个产生的正义RNA分子能够编码引发(eliciting)因子，含有这种结构的植物以及获得这种植物的方法。
文档编号C12N15/83GK1128048SQ94192894
公开日1996年7月31日 申请日期1994年6月3日 优先权日1993年6月4日
发明者P·T·德哈安 申请人:山道士有限公司