专利名称：来自真菌的α-1，4-葡聚糖裂解酶，其纯化，基因克隆和在微生物中的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶，特别是α-1，4-葡聚糖裂解酶(“GL”)。本发明还涉及提取该酶的方法。
FR-A-2617502和Baute等在PhytochemistryVol.27No.11pp3401-3403中报道了以明显的酶促反应在普通羊肚菌(Morchella vulgaris)中生产1，5-D-脱水果糖(“AF”)。AF的产量相当低。尽管提及了可能的酶促反应，但这两份文献都没有提供任何酶的任何氨基酸序列资料，更不用说任何核苷酸序列资料。这些文献说到AF可作为制备抗生素羟基羟甲基吡喃酮的前体。
Yu等在Biochimica et Biophysica ActaVol.1156pp313-320中报道了从红海藻中制备GL和其降解α-1，4-葡聚糖以生产AF的用途。AF的产量相当低。尽管该文献提及了GL酶，但未提供该酶的任何氨基酸序列，更不用说编码该酶的任何核苷酸序列资料。该文献还建议GL的来源就是藻类。
根据本发明，提供了一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含从真菌培养物中分离该酶，其中，该培养基本上不含任何其它生物体。
优选使用不会被该酶降解的凝胶分离和/或进一步纯化该酶。
优选的是凝胶以糊精或其衍生物为基础，优选环糊精，更优选β-环糊精。
根据本发明，还提供了一种以本发明的方法制备的GL酶。
优选的真菌是Morchella costata或普通羊肚菌(Morchellavulgaris)。
优选该酶包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2，或其任意变异体。
术语“其任意变异体”指在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下对该序列一个氨基酸的任意取代，改变，修饰，置换，缺失或增加。
根据本发明，还提供了编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，优选其中的序列不存在于其天然环境中(即不构成表达该酶的细胞生物体天然基因组的一部分)。
优选的核苷酸序列是DNA序列。
优选的DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源或含任意合适的密码子取代的序列。
“基本上同源”的表达包含有关结构和/或核苷酸成份和/或生物活性的同源性。
“含任意合适的密码子取代”的表达包含用另一编码相同氨基酸的密码子进行的任何密码子置换或取代或在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下对其进行的任何增加或删除。
换句话来说，本发明也包含修饰的DNA序列，其中至少一个核苷酸已缺失，取代或修饰，或者其中至少插入了一个额外的核苷酸以编码具有葡聚糖裂解酶活性的多肽，优选酶具有增强的裂解酶活性。
根据本发明，还提供了制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含表达本发明的核苷酸序列。
根据本发明，还提供了使用β-环糊精来纯化酶，优选GL。
根据本发明还提供了一种核苷酸序列，其中的DNA序列由至少一种与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源，或含任意合适的密码子取代的序列构成，优选其中的序列是一种分离的形式。
因此，本发明涉及从真菌中分离α-1，4-葡聚糖裂解酶。例如，真菌可以是Discina perlata，Discina parma，Gyromitra gigas，Gyromitra infula，Mitrophora hybrida，尖顶羊肚菌，Horchellacostata，弹丝羊肚菌，Morchella hortensis，Morchella rotunda，普通羊肚菌，疣孢褐盘菌，Sarcosphaera eximia，Disciotisvenosa，Gyromitra esculenta，卷曲马鞍菌，空隙马鞍菌，Leptopodia elastica，指状钟菌，和羊肚菌属的其它形式之任一。优选的真菌是Morchella costata或普通羊肚菌。
可用Yu等(出处同上)描述的方法进行酶的初步纯化。
然而，优选的酶初步纯化包括一种最优化的程序，其中使用在纯化步骤中不会分解的固相支持物。这种凝胶支持物还具有与标准实验室蛋白质纯化装置相匹配的优点。
这种最优化的纯化方法的详情在下文给出。以已知的蛋白质纯化标准技术终止纯化。
使用互补电泳技术可易于测定酶的纯度。
根据pI，温度和pH最适值鉴定了纯化的裂解酶GL。
关于这点，通过pH梯度为从3至9的凝胶等电聚焦电泳测定真菌裂解酶表现出pI大约为5.4。经在8-25％梯度凝胶上进行SDS-PAGE测定分子量为110KDa。酶表现出pH最适范围为pH5-7。发现最适温度位于30℃至45℃之间。GL来源 最适pH最适pH范围最适温度M.costata 6.5 5.5-7.5 37℃；40℃普通羊肚菌6.4 5.9-7.6 43℃；48℃使用糖原作底物测定参数，其它参数的测定使用支链淀粉作底物。
在优选的实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上亲和层析，在Mono Q HR5/5中离子交换和在Superose12柱上凝胶过滤从真菌Morchella costata中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。
PAS染色表明真菌裂解酶不发生糖基化。在无细胞真菌提取物中，经在电泳凝胶上进行活性凝胶染色只检测到α-1，4-葡聚糖裂解酶的一种形式。
优选该酶为外泌型的以简便其纯化。为此，将编码成熟酶的DNA与选定宿主的信号序列，启动子和终止子融合。
为了在黑色曲霉(Aspergillus niger)中表达，将gpdA(来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)启动子和信号序列与编码成熟裂解酶的DNA(例如SEQ.I.D.No.3或SEQ.ID.No.4)的5′端融合。将黑色曲霉trpC基因的终止子序列置于该基因的3′端(Punt.P.J.et al(1991)J.Biotech.17，19-34)。将该构建体插入含E.coli复制起点和选择起点及黑色曲霉选择标记的载体中。黑色曲霉选择标记的例子是用于选择转化子的amdS基因，argB基因，pyrG基因，hygB基因，BmlR基因。可将该质粒转化进黑色曲霉并可从转化子培养基中回收成熟的裂解酶。
可将构建体转化进蛋白酶缺陷型菌株中以减少培养基中对裂解酶的蛋白裂解性降低(Archer D.B.et al(1992)Biotechnol.Lett.14，357-362)。
根据Barholt和Jensen的方法(Anal BiochemVol177pp318-322)可确定氨基酸的组成。用于纯化酶氨基酸分析的样品可含69μg/ml的蛋白质。
根据本发明的GL酶的氨基酸序列如SEQ.I.D.No.1和SEQ.I.D.No.2所示。
根据布达佩斯条约，下列样品于1994年10月3日保藏于认可的保藏单位(The National Collections of Industrial andMarine Bacteria Limited(NCIMB)at23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB2 1RY)含质粒pMC(NCIMB40687)的大肠杆菌-[参考DH5α-pMC]；含质粒pMV1(NCIMB40688)的大肠杆菌-[参考DH5α-pMV1]；和含质粒pMV2(NCIMB40689)的大肠杆菌-[参考DH5α-pMV2]。
质粒pMC是含有从Morchella costata构建的基因组文库中分离的4.1kb片段的pBluescriptII KS。该片段含有编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。
质粒pMV1是含有从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的2.45kb片段的pBluescriptII KS。该片段含有编码α-1，4-葡聚糖裂解酶基因的5′端。
质粒MV2是含有从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的3.1kb片段的pPUC19。该片段含有编码α-1，4-葡聚糖裂解酶基因的3′端。
在下面讨论中，MC代表Morchella costata，MV代表普通羊肚菌。
如上所述，在两个质粒中含有普通羊肚菌的GL编码序列。参考图5(下文讨论)，pMV1含有454位至2902位的核苷酸；pMV2含有从2897位(包括该位置)起的下游核苷酸。参考图2和3(下文讨论)，为了连接编码序列，可用限制性酶EcoRI和BamHI消化pMV2，然后将有关片段插入用限制性酶EcoRI和BamHI消化的pMV1中。
因此，本发明高度优选的实施方案包括由存在于质粒中的GL编码序列的表达来获得GL酶，该质粒是保藏品NCIMB 40687或者保藏品NCIMB40688和保藏品NCIMB40689的主体。
现在本发明将仅以实施例的方式进行描述。
在下面实施例中以附图作为参考，其中
图1显示了pMC的质粒图谱图2显示了pMV1的质粒图谱；图3显示了pMV2的质粒图谱；图4显示了从Morchella costata获得的基因组DNA的GL编码序列和部分5′和3′非翻译区；图5显示了从普通羊肚菌获得的基因组DNA的GL编码序列和部分5′和3′非翻译区；图6显示了Morchella costata和普通羊肚菌GL编码序列和非翻译区的比较；图7显示SEQ.I.D.No.1代表的氨基酸序列，显示了测序的肽片段的位置；和图8显示了SEQ.I.D.No.2代表的氨基酸序列，显示了测序的肽片段的位置。
更详细地说，在图4中，碱基总数是4726个，DNA序列组成是1336A；1070C；1051G；1269T。ATG起始密码子以粗体字显示。在内含子下划线。终止密码子以斜体字表示。
在图5中，碱基总数是4670，DNA序列组成是1253A；1072C；1080G；1265T。ATG起始密码子以黑体字显示。在内含子下面划线。终止密码子以斜体字表示。
图6中，两个对比的序列是从MC(残基总数1066)和MV(残基总数1070)获得的序列。所用的比较模型是遗传结构模型(打开缺口失去10；连接缺口失去2)。在该图中，表示两个比较的残基相同的符号是“∶”。表示两个比较的残基相似的符号是“.”。说成是‘相似’的氨基酸有A，S，TD，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。总体上是相同；920(86.30％)；相似51(4.78％)。在MC中插入的空缺数量是1，在MV中插入的空缺数是1。
在所附的序列表中SEQ.I.D.No.1是从Morchella costata中获得的GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.2是从普通羊肚菌中获得的GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.3是从Morchella costata获得的GL的核苷酸编码序列；SEQ.I.D.No.4是从普通羊肚菌中获得的GL的核苷酸编码序列。
在SEQ.I.D.No.1中，残基总数是1066。GL酶的氨基酸组成为46Ala13Cys25His18Met73Thr50Arg37Gln54Ile43Phe23Trp56Asn55Glu70Leu56Pro71Tyr75Asp89Gly71Lys63Ser78Val
在SEQ.I.D.No.2中，残基总数是1070。GL酶的氨基酸组成为51Ala13Cys22His17Met71Thr50Arg40Gln57Ile45Phe24Trp62Asn58Glu74Leu62Pro69Tyr74Asp87Gly61Lys55Ser78Val1.来自真菌Morchella costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶纯化和特征鉴定1.1材料和方法真菌Morchella costata得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。使用ATCC推荐的培养基在摇瓶中25℃下培养真菌。经过滤收集菌丝体并用0.9％NaCl洗涤。
经匀浆破碎真菌细胞，接着在冰上在50mM柠檬酸盐-NaOH pH6.2(缓冲液A)中超声处理6×3分钟。经在25,000×g下离心40分钟去掉细胞碎片。在该程序中获得的上清液当作是无细胞提取物，在8-25％梯度凝胶中分离后用于活性染色和Western印迹。1.2用β-环糊精Sepharose凝胶分离将无细胞提取物直接上样到用缓冲液A预先平衡的β-环糊精Sepharose凝胶4 B柱(2.6×18cm)上。用3体积缓冲液A与2体积的含1M NaCl的缓冲液A洗柱。用含2％糊精的缓冲液A洗脱α-1，4-葡聚糖裂解酶。集中活性组分并将缓冲液变为20mM Bis-tris丙烷-HCl(pH7.0，缓冲液B)。
将活性组分上样到用缓冲液B预先平衡的Mono Q HR5/5柱上。于0.3M NaCl缓冲液B线性洗脱真菌裂解酶。
另一种途径是，将经过β-环糊精Sepharose层析后获得的裂解酶制品浓缩到150μl并上样到在FPLC条件下操作的Superose12柱上。1.3α-1，4-葡聚糖裂解酶活性分析和测定底物特异性，最适pH和温度条件用于分析α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反应混合物含10mgml-1支链淀粉和25mM Mes-NaOH(pH6.0)。
反应在30℃下进行30分钟并经加入3，5-二硝基水杨酸试剂终止反应。在室温静置10分钟后，在550nm下测量光密度。当使用无细胞提取物时，向试验混合物中加入10mM EDTA。
试验混合物中的底物支链淀粉可用其它底物取代，反应温度可按本文限定的范围变动。
在最适pH研究中，反应混合物含以10mg ml-1溶于40mM缓冲液中的支链淀粉或麦芽四糖。所用的缓冲液是甘氨酸-NaOH(pH2.0-3.5)，HoAc-NaoAc(pH3.5-5.5)，Mes-NaOH(pH5.5-6.7)，Mops-NaOH(6.0-8.0)和N-二[羟乙基]甘氨酸-NaOH(7.6-9.0)。反应在30℃进行30分钟。在温度最适值研究中的反应条件与上述相同，除了在全部实验中使用缓冲液MoPs-NaOH(pH6.0)。反应温度按本文所述变化。
分别使用8-25％梯度凝胶和3-9pH梯度的凝胶在PhastSystem上进行SDS-PAGE，Natiye PAGE和等电聚焦。电泳后，根据厂商(Pharmacia)推荐的方法以银染染色凝胶。以使适于PhastSystem的PAS可染色糖蛋白。为进行活性染色，电泳在6℃自然条件下进行。
电泳后，在1％可溶性淀粉存在的条件下将凝胶在30℃下培养过夜。经过用I2/KI溶液染色显示真菌裂解酶的活性带。1.4结果1.4.1 α-1，4-葡聚糖裂解酶的纯化，分子量和等电点发现真菌裂解酶吸附到装有β-环糊精Sepharose，淀粉和RedSepharose的柱上。装有β-环糊精Sepharose4B凝胶和淀粉的柱子可用于纯化目的。
以该步骤获得的裂解酶制品仅含少量分子量比真菌裂解酶高的污染蛋白质。经在Mono Q HR5/5上进行离子交换层析或更有效地经过在Superose12上进行凝胶过滤来除去杂质。
纯化的酶外观无色并在可见光区无光吸收。以SDS-PAGE估测分子量为110KDa。
经过3-9的pH梯度凝胶等电聚焦，测定纯化的真菌裂解酶表现出pI5.4的等电点。在天然电泳凝胶中，酶表现为一条单一带。经活性染色检测该带表现出淀粉降解活性。取决于用于提取酶的培养物的时期，经天然和等电聚焦凝胶的酶显示出具有相同迁移率和pI的清晰带或弥散的带。1.4.2真菌裂解酶催化反应的pH和温度最适值发现真菌裂解酶催化反应的最适pH的pH范围在pH5和pH7之间。1.4.3底物特异性纯化的真菌裂解酶降解以麦芽糖到麦芽七糖的麦芽糖类。然而，降解率不同。对麦芽四糖具有最高活性(活性为100％)，其次为麦芽六糖(97％)，麦芽七糖(76％)，麦芽三糖(56％)，用麦芽糖观察到最低活性(2％)。
真菌裂解酶也降解支链淀粉，直链淀粉和糖原(可确定其百分数)。真菌裂解酶是一种外切裂解酶，不是内切裂解酶，因为它降解对硝基苯α-D-麦芽七糖，但不降解还原末端封闭的对硝基苯α-D-麦芽七糖。1.5普通羊肚菌从普通羊肚菌获得的α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶纯化和鉴定方法与上面Morchella costata所用的方法相同(结果相似-见上述结果)。2.真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的氨基酸测序2.1裂解酶的氨基酸测序使用来自溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum)的内蛋白酶Arg-C或来自Lysobacter enzymogenes的内蛋白酶Lys-C消化裂解酶，两者都是测序级，购自德国Boehringer Mannheim。为了用内蛋白酶Arg-C进行消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl10M尿素，50mM甲胺，0.1M Tris-HCl，pH7.6的溶液中，充入N2并加入10μl 50mM DTT和5mM EDTA后使蛋白质变性并在N2下50℃还原10分钟。接着，加入1μg溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH8.0的内蛋白酶Arg-C，充入N2并在37℃下消化6小时。
为了随后衍生半胱氨酸，加入12.5μl 100mM碘乙酰胺，将溶液在N2中避光室温保温15分钟。
为了用内蛋白酶Lys-C消化，可将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH8.4中。充入N2并加入5μl 45mM DTT后，蛋白质在50℃N2中变性和还原15分钟。冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺在N2中避光室温处理15分钟以衍生形成半胱氨酸。随后，加入90μl水和溶于50μl 50mM麦黄酮和10mMEDTA pH8.0中的5μg内蛋白酶Lys-C并在37℃N2存在下消化24小时。
使用溶剂A0.1％TFA水溶液和溶剂B0.1％TFA乙腈溶液经在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separations Groap；California)上经反向HPLC分离所得的多肽。在使用脉冲液体快速循环在Applied Biosystems476A 测序仪上测序前，使用相同的溶剂系统将所选的肽类在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μm；Dr.Ole Schon，Novo Nordisk，Denmark)上再层析。
来自真菌Morchella costata的酶的氨基酸序列资料在图7中显示。
来自真菌普通羊肚菌的酶的氨基酸序列资料在图8中显示。3.编码真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因的DNA测序3.1分子生物学方法按Dellaporte等(1983-Plant Mol Biol Rep vol.1 pp19-21)所述分离DNA。3.2 PCR使用Gene Amp DNA扩增试剂盒(Perkin Elmer Cetus，美国)并按照厂商说明书制备有关DNA分子，不同的是Taq聚合酶较晚加入(见PCR循环)并将温度循环变成如下方式PCR循环循环次数 C 时间(分)1 985605加入Taq聚合酶和油359414727231 72203.PCR片段的克隆按照提供者的说明将PCR片段克隆进pT7 Blue(来自Novagen)。3.4 DNA测序基本上按照Sanger等(1979)的双脱氧法使用自动阅读测序试剂盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA序列仪测序双链DNA.(参见Sanger，F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1979)。DNA sequencing with chain-determinatinginhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467.)。3.5文库的筛选除了预杂交和杂交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt′s和100μg/ml变性鲑精DNA中进行外，按照厂商说明书对来自Stratagene的入Zap文库进行筛选。
向杂交溶液中加入32P标记的变性探针。在55℃进行杂交过夜。滤膜在2×SSC，0.1％SDS中洗两次，在1×SSC，0.1％SDS中洗两次。3.6探针经过用合适的限制性酶消化从pT7blue载体中分离已克隆的PCR片段。经琼脂糖凝胶电泳从载体中分离片段并用Agarase(BoehringerMannheim)从琼脂糖中纯化片段。由于片段仅为90-240bp长，因此在使用Prime-It随机引物试剂盒(Stratagene)或Ready to GoDNA标记试剂盒(Pharmacia)以32P-dCTP标记前要对分离的片段进行连接反应。3.7结果3.7.1编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的PCR DNA片段的产生使用α-1，4-葡聚糖裂解酶的三个重叠的胰酶肽氨基酸序列(下面显示，制备混合的可用作PCR引物的寡核苷酸以扩增从MC和MV分离的DNA。Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr Val Leu Asp Ile Val LysPro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly Gly Ile Gln Phe Met LysGlu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val TyrAla Gln Gly Ala Leu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr在第一次PCR扩增中，引物A1/A2(见下面)用作上游引物，引物B1/B2(见下面)用作下游引物。引物A1CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGCT(GATC)AA(GA)GA(CT)AC引物A2CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGTT(GA)AA(GA)GA(CT)AC引物B1TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GA)CT(GA)TG(GA)TA引物B2TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GATC)GA(GA)TG(GA)TA在2％LMT琼脂糖凝胶上分析PCR产物，从凝胶上切下预期大小的片段并用Agarase(Boehringer Manheim)处理，克隆进pT7blue载体(Novagen)并测序。
PCR扩增的克隆片段编码与测序肽(见上面)相对应的氨基酸并且在每例中增加了两个内含子序列。对于MC，PCR扩增的DNA序列与参照图4位置1202到位置1522所示的序列相对应。对于MV，PCR扩增的DNA序列与参照图5位置1218至位置1535所示的序列相对应。3.7.2用克隆的PCR片段筛选基因组文库对每种来源使用上述克隆筛选文库产生了两个克隆。对于MC，结合两个克隆形成了图4所示的序列(见下面)。对于MV，以上面所述的方式结合两个克隆形成了图5所示的序列。
使用下面所示的寡核苷酸作为上游引物进行再次PCR以补充紧接ATG起始密码子之前具有PstI，PvuII，AscI和NcoI限制性位点的MC克隆AAACTGCAGCTGGCGCGCCATGGCAGGATTTTCTGAT含有图4中bp1297-1318互补序列的引物用作下游引物。
经过将该基因的5′端以一个基因组克隆(第一克隆)的BglII-EcoRI片段的形式克隆进Stratagene pBluescriptII KS+载体的BamHI-EcoRI位点来制备MC的完整序列。在用EcoRI和EcoRV消化经修饰的pBluescriptII KS+载体后经过连接另一基因组克隆(第二克隆)的NspV(使用Amersham International DNA钝端试剂盒钝端化)-EcoRI片段将该基因的3′端克隆进修饰的pBluescriptIIKS+载体中。然后将该基因的中介片段以第一个克隆的E.coRI片段的形式，和经E.coRI酶切的进一步修饰的pBluescsiptII KS+载体连接起来，这样，该基因的中介片段就克隆进修饰的pBluescriptII KS+载体。4.GL基因在微生物中的表达可将编码GL的DNA序列导入微生物中以生产高比活和高产量的酶。
为做到这点，将MC基因(图4)以XbaI-XhoI钝端化(使用Amersham International的DNA钝端化试剂盒)片段的形式克隆进用EcoRI消化并钝端化(使用Amersham International的DNA钝端化试剂盒)的毕赤氏酵母属表达载体pHIL-D2(含AOX1启动子)中以便在Pichia pastoris中表达(根据Invitrogen提供的毕赤氏酵母属表达试剂盒中所述的方案)。
在另一实施方案中，将MC基因1(与图4相同，除了如上所述经PCR修饰导入了限制性位点)以PvuII-XhoI钝端化片段的形式(使用Amersham International的DNA钝端形成试剂盒)克隆进用SmaI消化的曲霉属表达载体pBARMTE1(含有来自Neuropera crassa的甲基色氨酸抗性启动子)中以便在黑色曲霉中表达(Pall et al(1993)Fungal Genet Newslett.Vol40 Page59-62)。根据Daboussi等(Curr Genet(1989)vol.15pp453-456)的方法使用溶胞酶Sigma L-2773和溶胞酶Sigma L-8012制备原生质体。随后根据Buxton等(Gene(1985)Vol.37 pp207-214)所述的方案进行原生质体的转化，除了涂布经转化的原生质体时，使用了Punt等(Methods in Enzymology(1992)Vol216pp447-457)描述的方案并使用0.6％渗透稳定的上层琼脂糖。
结果表明在转化的Pichia pastoris和黑色曲霉中观察到裂解酶活性。现在描述这些实验。
毕赤氏酵母属裂解酶转化子和曲霉属裂解酶转化子的分析一般方法无细胞提取物的制备。
以9000rpm离心5分钟收获细胞，用0.9％NaCl洗涤并重悬于破碎缓冲液(50mM K-磷酸盐，pH7.5，含1mM EDTA和5％甘油)中。使用玻璃珠和涡旋处理破碎细胞。破碎缓冲液含1mM PMSF(蛋白酶抑制剂)。以9000rpm离心5分钟后接着以20,000×g离心5分钟获得裂解酶提取物(上清)。
以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS)试验裂解酶的活性。
将1体积的裂解酶提取物与等体积4％的支链淀粉溶液混合。然后在控制的温度下保温反应混合物，以特定的间隔取样并分析AF。
也使用放射活性方法分析了裂解酶活性。
反应混合物含10μl14C-淀粉溶液(1μCi；Sigma ChemicalsCo.)和10μl裂解酶提取物。反应混合物在25℃放置过夜，然后在常规TLC系统中分析。使用Instant Imager(Pachard InstrumentCo.，Inc.，Meriden，CT)检测产生的放射活性AF。
电泳和Western印迹使用8-25％梯度凝胶和Phast System(Pharmacia)进行SDS-PAGE。也在PhastSystem的Semidry转移单位上进行Western印迹。以1∶100的稀释度使用抗裂解酶的第一抗体，此抗体是针对纯化的从青岛(中国)收集的红海藻的。与碱性磷酸酶连接的猪抗兔IgG(Dako A/S，Glostrup，Denmark)用作第二抗体并以1∶1000的稀释度被使用。I部分，含上述构建体的毕赤氏酵母属转化子的分析MC裂解酶在Pichia pastoris细胞内的表达培养物名称 比活*A18 10A20 32A21 8A22 8A24 6*比活定义为在25℃下每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol值。II部分.曲霉属转化子结果I.培养(含0.2％酪蛋白的酶水解产物的基础培养基)5天后以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂分析测定裂解酶活性在无细胞提取物中分析裂解酶活性培养物名称 比活*8.13118.16 5388.1937*比活定义为在25℃下每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol值。
结果表明MC-裂解酶在黑色曲霉细胞内表达。
除了用黑色曲霉作宿主外，也可使用其它已知具有良好表达系统的工业上重要微生物，如米曲霉，曲霉属种类，木霉属种类，啤酒糖酵母，克鲁维氏酵母属种类，汉逊氏酵母属种类，毕赤氏酵母属种类，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，芽孢杆菌属种类，链霉菌属种类或大肠杆菌。
本发明其它优选的实施方案包括下列任意一个一种由于导入本文所述的DNA序列而具有产生AF能力的转化的宿主生物体；这种转化的宿主生物体是一种微生物，其中优选宿主生物体选自由细菌，霉菌，真菌和酵母组成的组中；优选宿主生物体选自由糖酵母属，克鲁维氏酵母属，曲霉属，汉逊氏酵母属，毕赤氏酵母属，芽孢杆菌属，链霉菌属，大肠杆菌属组成的组中，如米曲霉，啤酒糖酵母，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，大肠杆菌；一种制备1，5-D-脱水果糖的方法，包含将α-1，4-葡聚糖(例如淀粉)与转化宿主生物体表达的α-1，4-葡聚糖裂解酶接触该生物体含有编码该酶的核苷酸序列，其中优选核苷酸序列是DNA序列，优选其中的DNA序列是上文所述的序列之一；一种插入了上文所述核苷酸序列的载体，优选其中载体是一种复制载体，优选其中的载体是含有在启动子序列下游的核苷酸序列的表达载体，该载体优选含有一个标记(如抗性标记)；用该载体转化的细胞生物体，或细胞系；一种产生α-1，4-葡聚糖裂解酶或编码该酶的任意核苷酸序列或其部分之产物的方法，包含培养用该载体转染的该生物体(或来自细胞系的细胞)并回收该产物。
不偏离本发明的范围对本发明进行的其它修改对本领域的技术人员而言将是显而易见的。
序列描述(1)一般资料(i)申请人(A)名称Danisco A/S(B)街道Langebrogade1(C)城市Copenhagen(D)州Copenhagen K(E)国家丹麦(F)邮编(编码)DK-1001(ii)发明题目酶(iii)序列号10(iv)计算机可读形式(A)媒体类型Floppy盘(B)计算机IBM PC兼容性(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(v)最近申请资料申请号WO PCT/EP94/03398(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特征(A)长度1066个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Ala Gly Phe Ser Asp Pro Leu Asn Phe Cys Lys Ala Glu Asp Tyr1 5 10 15Tyr Ser Val Ala Leu Asp Trp Lys Gly Pro Gln Lys Ile Ile Gly Val20 25 30Asp Thr Thr Pro Pro Lys Ser Thr Lys Phe Pro Lys Asn Trp His Gly35 40 45Val Asn Leu Arg Phe Asp Asp Gly Thr Leu Gly Val Val Gln Phe Ile50 55 60Arg Pro Cys Val Trp Arg Val Arg Tyr Asp Pro Gly Phe Lys Thr Ser65 70 75 80Asp Glu Tyr Gly Asp Glu Asn Thr Arg Thr Ile Val Gln Asp Tyr Met85 90 95Ser Thr Leu Ser Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Arg Gly Leu Thr Trp Glu100 105 110Thr Lys Cys Glu Asp Ser Gly Asp Phe Phe Thr Phe Ser Ser Lys Val115 120 125Thr Ala Val Glu Lys Ser Glu Arg Thr Arg Asn Lys Val Gly Asp Gly130 135 140Leu Arg Ile 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(D)拓扑线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Gly Leu Ser Asp Pro Leu Asn Phe Cys Lys Ala Glu Asp Tyr1 5 10 15Tyr Ala Ala Ala Lys Gly Trp Ser Gly Pro Gln Lys Ile Ile Arg Tyr20 25 30Asp Gln Thr Pro Pro Gln Gly Thr Lys Asp Pro Lys Ser Trp His Ala35 40 45Val Asn Leu Pro Phe Asp Asp Gly Thr Met Cys Val Val Gln Phe Val50 55 60Arg Pro Cys Val Trp Arg Val Arg Tyr Asp Pro Ser Val Lys Thr Ser65 70 75 80Asp Glu Tyr Gly Asp Glu Asn Thr Arg Thr Ile Val Gln Asp Tyr Met85 90 95Thr Thr Leu Val Gly Asn Leu Asp Ile Phe Arg Gly Leu Thr Trp Val100 105 110Ser Thr Leu Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Tyr Thr Phe Lys Ser Glu Val115 120 125Thr Ala Val Asp Glu Thr Glu Arg Thr Arg Asn Lys Val Gly Asp Gly130 135 140Leu Lys Ile Tyr Leu Trp Lys Asn Pro Phe Arg Ile Gln Val Val Arg145 150 155 160Leu Leu Thr Pro Leu Val Asp Pro Phe Pro Ile Pro Asn Val Ala Asn165 170 175Ala Thr Ala Arg Val Ala Asp Lys Val Val Trp Gln Thr Ser Pro Lys180 185 190Thr Phe Arg Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr195 200 205Val Leu Asp 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GAGGGCCTAA TCCCATCAAG 2700TTCAATATCT ACCCTGGAAA GGACAAGGAG TATGTGACGT ACCTTGATGA TGGTGTTAGC 2760CGCGATAGTG CACCAGATGA CCTCCCGCAG TACCGCGAGG CCTATGAGCA AGCGAAGGTC 2820GAAGGCAAAG ACGTCCAGAA GCAACTTGCG GTCATTCAAG GGAATAAGAC TAATGACTTC 2880TCCGCCTCCG GGATTGATAA GGAGGCAAAG GGTTATCACC GCAAAGTTTC TATCAAACAG 2940GAGTCAAAAG ACAAGACCCG TACTGTCACC ATTGAGCCAA AACACAACGG ATACGACCCC 3000TCTAAGGAAG TTGGTAATTA TTATACCATC ATTCTTTGGT ACGCACCGGG CTTTGACGGC 3060AGCATCGTCG ATGTGAGCCA GGCGACCGTG AACATCGAGG GCGGGGTGGA ATGCGAAATT 3120TTCAAGAACA CCGGCTTGCA TACGGTTGTA GTCAACGTGA AAGAGGTGAT CGGTACCACA 3180AAGTCCGTCA AGATCACTTG CACTACCGCT TAG 3213(2)SEQ ID NO5资料(i)序列特征(A)长度75个氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr Val Leu Asp1 5 10 15Ile Val Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly20 25 30Gly Ile Gln Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe35 40 45Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ser50 55 60Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr65 70 75(2)SEQ ID NO6资料(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(3，″″)(D)其它资料/标准名称＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别
(B)位置取代(6，″″)(D)其它资料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(3，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(9，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(15，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(18，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(21，″″)(D)其它资料/注＝“N是C或T”(xi)序列描述SEQ ID NO6CANCANAANA TGCTNAANGA NAC 23(2)SEQ ID NO7资料(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(3，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(6，″″)(D)其它资料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(9，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(15，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别
(B)位置取代(18，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(21，″″)(D)其它资料/注＝“N是C或T”(xi)序列描述SEQ ID NO7CANCANAANA TGTTNAANGA NAC 23(2)SEQ ID NO8资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(3，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(6，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征
(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(9，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(12，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(15，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(18，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(xi)序列描述SEQ ID NO8TANAANGGNT CNCTNTGNTA 20(2)SEQ ID NO9资料(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)
(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(3，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(6，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(9，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(12，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(15，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名称/键misc_区别(B)位置取代(18，″″)(D)其它资料/注＝“N是G或A”
(xi)序列描述SEQ ID NO9TANAANGGNT CNGANTGNTA 20(2)SEQ ID NO10资料(i)序列特征(A)长度37个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO10AAACTGCAGC TGGCGCGCCA TGGCAGGATT TTCTGAT 3权利要求
1.一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含从真菌培养物中分离该酶，其中的培养物基本上不含任何其它生物体。
2.根据权利要求1的方法，其中使用不会被该酶降解的凝胶分离和/或进一步纯化该酶。
3.根据权利要求2的方法，其中的凝胶以糊精或其衍生物为基础，优选一种环糊精，更优选β-环糊精。
4.一种根据权利要求1至3任意一项的方法，其中的真菌是Morchella costata或普通羊肚菌(Morchella vulgaris)。
5.一种以根据权利要求1至4中任意一项的方法制备的GL酶。
6.一种酶，它包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.I.D.No.2或其任意变异体。
7.一种能编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列。
8.根据权利要求7的核苷酸序列，其中的序列是DNA序列。
9.根据权利要求8的核苷酸序列，其中的DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源，或含任意合适的密码子取代的序列。
10.一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含表达权利要求9的核苷酸序列。
11.β-环糊精在纯化一种酶，优选GL中的应用。
12.一种核苷酸序列，其中的DNA序列由至少一种与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源，或含任意合适的密码子取代的序列组成。
全文摘要
本发明描述了一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，该方法包含从真菌培养物中分离该酶。其中该培养物基本上不含任何其它生物体。也描述了该酶的氨基酸序列及其编码序列。
文档编号C12R1/645GK1133069SQ94193794
公开日1996年10月9日 申请日期1994年10月15日 优先权日1993年10月15日
发明者K·波森, 于书坤, K·M·克拉, T·M·I·E·克里斯滕森, J·马库森 申请人:丹尼斯科有限公司