专利名称：小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法及系统的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法及系统。
背景技术：
小核菌硬葡聚糖(Scleroglucan)，又名小核菌胶、硬葡聚糖，属于高分子β -葡聚糖，是真菌小核菌代谢产生的一种中性葡聚糖。分子主链由β-1，3-D-吡喃葡萄糖构成，每隔3个葡萄糖单元有一个β-1，6-吡喃葡萄糖侧链。小核菌硬葡聚糖的分子结构决定了其具有以下性质耐高温(最高可耐受到120°C )、抗剪切、粘度高且不受离子浓度影响，在应用中有较强的稳定性。小核菌硬葡聚糖属于胞外多糖，在冷热水中均可溶解，与水的结合性、稳定性、黏稠性和悬浮性很好。并具有与其他生物多糖相同的生物活性，具有免疫刺激、 抗炎症、抗感染、抗微生物、抗肿瘤、降低胆固醇、抗辐射以及治愈创伤等生物学活性和医药特性，因而日益引起人们的关注，目前在国际市场中将小核菌硬葡聚糖普遍应用在化妆品中，多做为保湿、抗炎、增稠成分。小核菌硬葡聚糖在国外已形成产业化，市场售价约为5万美元/吨，并被一些国际知名化妆品品牌所采用，获得较好的经济收益。目前小核菌硬葡聚糖的生产采用传统的间歇式发酵方式，在发酵的中后期由于多糖含量增多从而粘度增大，造成发酵罐内溶氧不足，导致多糖发酵产量下降。在发酵结束后，进行分离提取时由于多糖含量较高，粘度大、分子量高，将其与细胞体分离时产生困难， 常常堵塞分离介质，降低分离效果，提高分离提取成本。同时在将多糖与胞体分离后，由于多糖中还含有小分子的杂质如残留的蔗糖、k+、Ca2+、Mg2+等无机盐分，因此，为了得到纯度较高小核菌硬葡聚糖，还需要采取离子交换树脂法、超滤膜分离过滤方法等进行除残糖及脱盐处理。但是由于小核菌硬葡聚糖含量较高，其粘度大、分子量高，经过离子交换树脂柱时容易被树脂吸附，或者是堵塞超滤膜，存在多糖提取产率低，分离提取成本昂贵的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种产量高、成本低、产品质量好的小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法及系统。本发明解决其技术问题是通过以下技术方案实现的(1).菌种培养在恒温摇床或种子发酵罐中培养小核菌种子液。(2).利用发酵罐对小核菌进行发酵将配制好的发酵培养基通过连续灭菌装置进行灭菌后，进入空消灭菌后的发酵罐中，将培养好的小核菌种子液通过无菌接种管道以2 5%的比例接入发酵培养基中进行发酵培养，发酵条件为初始通风比为0.8 1.2 1，发酵罐搅拌叶转速为200 400rpm， pH控制在3 4，溶氧量控制在20% 50%，温度为25 30°C，罐压为0. 045 0. 055MPa。
(3).在线分离提取发酵培养24小时后将发酵罐内的发酵液泵出至陶瓷微滤膜设备进行微滤分离， 分离条件为温度为25-35°C、进膜压力为0. 15-0. 25MPa、膜的孔径为0. 1-0. 3 μ m，分离出多糖后含菌体的发酵液返回发酵罐继续发酵，分离所得的多糖液泵至陶瓷超滤膜设备进行提取分纯，提取分纯条件为温度为25-35°C、进膜压力为0. 15-0. 25MPa、膜的孔径为 7000-13000道尔顿分子量，提取分纯后的发酵液返回发酵罐继续参与发酵培养，对提取分纯所得的多糖浓缩液进行收集。(4).连续补充发酵培养基，实现连续发酵
向发酵罐内连续补充发酵培养基，进行连续发酵。而且，还包括向发酵罐内补充碱液的步骤，通过补入30% NAOH溶液，控制发酵液 pH为3 4。一种小核菌硬葡聚糖在线发酵提取系统，包括发酵罐、进料系统、供氧系统、蒸汽系统及控制系统，其特征在于还包括陶瓷膜分离提取系统，该陶瓷膜分离提取系统由第一蠕动泵、第二蠕动泵、陶瓷微滤膜及陶瓷超滤膜构成，第一蠕动泵一端连接发酵罐的出料口，另一端连接至陶瓷微滤膜的进料口，陶瓷微滤膜的分离所得液出口与陶瓷超滤膜的进料口连接，陶瓷微滤膜的剩余液出口通过第二蠕动泵连接回发酵罐，陶瓷超滤膜的分离所得液出口连接至回收装置，陶瓷超滤膜的剩余液出口通过第二蠕动泵连接回发酵罐。而且，还包括碱液补充系统，碱液补充系统由蠕动泵及补料管路构成。本发明的优点和有益效果为1.本发明的小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法，在发酵过程中利用陶瓷膜分离提取方式将小核菌葡聚糖产物连续不断从发酵液中提取出来，小核菌葡聚糖不会在发酵液中积累，从而避免了由于发酵液粘度增大、溶氧降低、PH值降低等问题而抑制产物合成，进而大幅度提高发酵生产小核菌葡聚糖的产率。2.本发明的小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法，由于在发酵过程中被连续分离出来的小核菌葡聚糖已经过陶瓷膜的分离及提纯，不再含有残糖和无机盐分子，因此其多糖产物不需再进行分离提取，简化了生产工艺，同时大幅度降低了提取成本。3.本发明的小核菌硬葡聚糖在线发酵提取系统结构设计科学合理，采用陶瓷膜分离提取系统实现了小核菌硬葡聚糖的在线提取，具有设备成本低、运行费用低、产率高、产品质量好等优点。
图1为本发明小核菌硬葡聚糖在线发酵提取系统的流程图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。一种小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法，其特征在于该方法的步骤如下(1).菌种培养利用IOOOml摇瓶在恒温摇床中培养小核菌种子液。菌种培养基的组份及其质量百分比为蔗糖4 %、硝酸钠0.3%、玉米浆0. 075 %、酵母粉0. 075 %、氯化钾0.05%、磷酸二氢钾0. 05%、七水硫酸镁0. 05%，剩余为水，pH 5. 0。摇床温度30°C，摇床转速150rpm，
培养周期48小时。(2).利用30L发酵罐对小核菌进行发酵将配制好的发酵培养基通过连续灭菌装置进行灭菌后，进入空消灭菌后的发酵罐中，灭菌条件121°C，罐压lkg/cm2，时间为20min。发酵培养基的组份及其质量百分比为蔗糖4 %、硝酸钠0. 3 %、玉米浆0. 075 %、酵母粉0. 075 %、氯化钾0.05%、磷酸二氢钾 0. 05%、七水硫酸镁0. 05%，剩余为水，pH 5. 0。摇床温度30°C，摇床转速150rpm。降温至 30°C时将培养好的小核菌种子液通过无菌接种管道以2 5%的比例接入20L发酵培养基中进行发酵培养，发酵条件为初始通风比为1 1，发酵罐搅拌叶转速为300rpm，pH控制在3. 5，溶氧量控制在20% 50%，温度为25 30°C，罐压为0. 045 0. 055MPa。发酵培养周期为24-48小时。
(3).在线分离提取发酵培养24小时后将发酵罐内的发酵液泵出至陶瓷微滤膜设备进行微滤分离， 分离条件为温度为30°C、进膜压力为0. 2MPa、膜的孔径为0. 2 μ m，分离后的发酵液返回发酵罐继续发酵，分离所得的多糖液泵至陶瓷超滤膜设备进行提取分纯，提取分纯条件为温度为30°C、进膜压力为0. 2MPa、膜的孔径为10000道尔顿分子量，提取分纯后的发酵液返回发酵罐继续参与多糖发酵，对提取分纯所得的多糖浓缩液进行收集。(4).在线分离提取过程中向发酵罐内补充发酵培养基的步骤，以保证连续的发酵生产。还包括补充碱液步骤，通过补入30% NAOH溶液，控制发酵液pH为3. 5。一种小核菌硬葡聚糖在线发酵提取系统，包括发酵罐4、进料系统、供氧系统、蒸汽系统、控制系统、碱液补充系统，供氧系统由空气管路1、压缩机2、储气罐3、油水分离器10、 空气初过滤器11、空气细过滤器12及控制阀构成。蒸汽系统由蒸汽发生器6、蒸汽管路5、 汽水分离器13及控制阀构成。碱液补充系统由蠕动泵17及补料管路16构成。发酵罐上部制有进料口，该进料口连接进料系统。发酵罐内部竖直安装有搅拌叶18。控制系统由pH 检测器19、溶氧量检测器20及电脑控制器21构成，pH检测器及溶氧量检测器安装在发酵罐体上。电脑控制器通过PH检测器及溶氧量检测器的检测数据，控制发酵罐的搅拌叶及补料蠕动泵。本在线发酵提取系统的创新之处在于还包括陶瓷膜分离提取系统，该陶瓷膜分离提取系统由料液管路14、第一蠕动泵7、第二蠕动泵15，陶瓷微滤膜8及陶瓷超滤膜9构成，第一蠕动泵通过料液管路一端连接发酵罐的出料口，另一端连接至陶瓷微滤膜的进料口，陶瓷微滤膜的分离所得液出口通过料液管路与陶瓷超滤膜的进料口连接，陶瓷超滤膜的分离所得液连接至回收装置，陶瓷微滤膜的剩余发酵液出口、陶瓷超滤膜的剩余液出口均通过第二蠕动泵连接回发酵罐。采用本发明的小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法可将小核菌硬葡聚糖产量由传统的间歇式发酵产量22g/L提高到28g/L，产率提高27. 3%。生产1公斤小核菌硬葡聚糖， 节约21. 4%培养基原料。而且，采用陶瓷膜分离和提取，提取设备成本和运行费用也降低， 总计每公斤小核菌硬葡聚糖成本价格比传统间歇式发酵方法降低50%。
权利要求
1.一种小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法，其特征在于该方法的步骤如下(1).菌种培养在恒温摇床或种子发酵罐中培养小核菌种子液。(2).利用发酵罐对小核菌进行发酵将配制好的发酵培养基通过连续灭菌装置进行灭菌后，进入空消灭菌后的发酵罐中， 将培养好的小核菌种子液通过无菌接种管道以2 5%的比例接入发酵培养基中进行发酵培养，发酵条件为初始通风比为0.8 1.2 1，发酵罐搅拌叶转速为200 400rpm，pH 控制在3 4，溶氧量控制在20% 50%，温度为25 30°C，罐压为0. 045 0. 055MPa。(3).在线分离提取发酵培养M小时后将发酵罐内的发酵液泵出至陶瓷微滤膜设备进行微滤分离，分离条件为温度为25-35 °C、进膜压力为0. 15-0. 25MPa、膜的孔径为0. 1-0. 3 μ m,分离出多糖后含菌体的发酵液返回发酵罐继续发酵，分离所得的多糖液泵至陶瓷超滤膜设备进行提取分纯，提取分纯条件为温度为25-35°C、进膜压力为0. 15-0. 25MPa、膜的孔径为 7000-13000道尔顿分子量，提取分纯后的发酵液返回发酵罐继续参与发酵培养，对提取分纯所得的多糖浓缩液进行收集。(4).连续补充发酵培养基，实现连续发酵向发酵罐内连续补充发酵培养基，进行连续发酵。
2.根据权利要求1所述的小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法，其特征在于还包括向发酵罐内补充碱液的步骤，通过补入30% NAOH溶液，控制发酵液pH为3 4。
3.一种小核菌硬葡聚糖在线发酵提取系统，包括发酵罐、进料系统、供氧系统、蒸汽系统及控制系统，其特征在于还包括陶瓷膜分离提取系统，该陶瓷膜分离提取系统由第一蠕动泵、第二蠕动泵、陶瓷微滤膜及陶瓷超滤膜构成，第一蠕动泵一端连接发酵罐的出料口， 另一端连接至陶瓷微滤膜的进料口，陶瓷微滤膜的分离所得液出口与陶瓷超滤膜的进料口连接，陶瓷微滤膜的剩余液出口通过第二蠕动泵连接回发酵罐，陶瓷超滤膜的分离所得液出口连接至回收装置，陶瓷超滤膜的剩余液出口通过第二蠕动泵连接回发酵罐。
4.根据权利要求3所述的小核菌硬葡聚糖在线发酵提取系统，其特征在于还包括碱液补充系统，碱液补充系统由蠕动泵及补料管路构成。
全文摘要
本发明涉及一种小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法，包括如下步骤(1)菌种培养，(2)利用发酵罐对小核菌进行发酵，(3)采用陶瓷膜分离方式在线分离提取多糖液。本发明还涉及一种小核菌硬葡聚糖在线发酵提取系统，包括发酵罐、进料系统、供氧系统、蒸汽系统及控制系统，还包括陶瓷膜分离提取系统。本发明的小核菌硬葡聚糖在线发酵提取方法及系统，在发酵过程中利用陶瓷膜分离提取方式将小核菌葡聚糖产物连续不断从发酵液中提取出来，小核菌葡聚糖不会在发酵液中积累，从而避免了由于发酵液粘度增大、溶氧降低、pH值降低等问题而抑制其产物小核菌葡聚糖的合成，同时无需后期再处理，具有产率高，生产工艺简化，设备成本低、运行费用低的优点。
文档编号C12M1/00GK102154408SQ201110006769
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者吕丛潮, 吴頔, 安峰, 张英筠, 王珺, 王祥河, 许勤虎, 魏呐 申请人:天津市工业微生物研究所