专利名称：哺乳动物细胞大规模生产SDF-1-Fc的方法
技术领域：
本发明涉及一种哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-1与人免疫球蛋 IgG的Fc段融合基因(SDF-I-Fc)的方法。
背景技术：
基质细胞衍生因子-I(SDF-I)又称为CXCL12，是一种小分子的细胞因子(约70氨基酸)，属于趋化因子蛋白家族。其可以高效、高灵敏度地检测SDF-I靶蛋白的特异性生物指标，用于肿瘤，炎症和其他的恶性病变临床诊断。SDF-I在造血、发育、肿瘤的发生与迁移、介导炎症和免疫反应等很多方面具有重要的生物学功能。SDF-I与其受体CXCR4在胚胎发育的过程对于胚胎的存活至关重要；在骨髓造血功能的形成，淋巴细胞生成及心室间隔的形成等过程也发挥着重要作用。SDF-I自身可以作为药物用于与发育缺陷相关疾病的治疗。另外，SDF-I是一种高效的淋巴细胞、核细胞及树突状细胞的趋化因子，能介导T 淋巴细胞紧密粘附并过内皮细胞，发生免疫反应。SDF-I还具有抗炎效应，可以逆转抗原诱导的T细胞向炎症部位的趋化运动。类风湿关节炎滑膜高水平表达SDF-1，在滑膜内表达 CXCR4的记忆T细胞大量聚集。SDF-I能刺激滑膜迁移，并且抑制激活诱导的T细胞凋亡， 作为一个重要的调节因子发挥抗炎作用。SDF-I蛋白产品作为免疫调节和抗炎类药物是另一有广阔前景的领域。默克、辉瑞等多家大型跨国药物公司已展开以SDF-I蛋白作为药物分子的技术和产品开发。SDF-I在某些原位肿瘤如宫颈癌病人体内表达明显升高，SDF-I可作为一种特异性的分子标记能够用于早期的诊断；在对肿瘤迁移的很多研究中发现，某些肿瘤如前列腺癌或乳腺癌，SDF-I在某器官的高浓度表达代表了肿瘤细胞首先转移的目的地。存在多部位浸润的血液肿瘤患者，其血清中SDF-I的浓度明显高于未出现浸润患者。因此，将SDF-I 作为肿瘤治疗上的新靶点，阻断SDF-I的产生或其与CXCR4的相互作用，可能有助于阻断肿瘤细胞向周围组织的扩散转移。Millipore和R&D system等研究机构和生物技术公司已在大力研发以SDF-I作为诊断指标用于早期疾病诊断的配套产品。除此之外，SDF-I还与许多疾病，如HIV感染、心肌梗死、移植肾排异、急性缺血性肾损伤等密切相关。以SDF-1/CXCR4为靶分子的研究将可能为许多疾病的早期诊断和治疗提供新的方向，在药物研究及临床检验中具有极大的市场潜力。免疫球蛋白IgG的Fc融合蛋白是指在基因水平将目的基因同IgG的Fc片段基因相连而表达的重组蛋白，同时具有目的蛋白及免疫球蛋白的结构域，从而赋予了重组蛋白获得许多新的特性，拓展了蛋白在科研、制药及临床等方面的应用。在重组蛋白表达的过程中，Fc重组蛋白易于结合ftOteinA，从而简化了蛋白的纯化过程；Fc片段可以方便地进行流式、免疫组化和免疫共沉淀等方法检测，可用于感兴趣的基因研究；体外实验中，Fc融合蛋白可用于拮抗或激活细胞表面受体用来研究受体-配体反应和信号通路；此外，Fc重组蛋白还能应用于噬菌体展示技术，如作为抗原制备人类全抗体库。另外，Fc片段还赋予了重组蛋白一些其它特性，增加了其在在制药和临床方面的应用价值。融合蛋白中加入重链的恒定区，其半衰期明显延长，增加了其在体内的作用时间；Fc段能穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用等；重组蛋白含有的铰链区结构域使其形成二聚体或多聚体，增强了其抗原结合力。以上这些特点拓展了融合蛋白在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反应的治疗方面的临床应用前景。目前全球仅有少数几个公司采用大肠杆菌或其它表达系统生产SDF-I-Fc重组蛋白，质量参差不齐，总体水平不高。蛋白的表达体系和翻译后修饰(糖基化程度)低限制了产品的纯度和活性，难以满足临床诊断和治疗的目的。用哺乳动物细胞生产SDF-I-Fc重组蛋白是生产科研和临床用SDF-I的重要途径，对于推动临床诊断环节的新型生物技术发展和临床药物开发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于实现用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的SDF-I-Fc蛋白的方法。在工业生产中满足降低生产成本、简化工艺流程、提高产品产量和质量的总体要求。本发明提供一种哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-1与人免疫球蛋 IgG的Fc段融合基因(SDF-I-Fc)的方法，其特性在于该方法通过如下步骤实现哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-1与人免疫球蛋IgG的Fc段融合基因(SDF-I-Fc)(1)制备转染用质粒；(2)制备PEI转染溶剂；(3)用质粒转染细胞；(4)进行表达产物收集及纯化。用PEI作为转染试剂，其作为“质子海绵”可以高效地结合双链DNA，把其带入目的细胞中，蛋白产物可在短暂的时间(一般可以表达一周的时间)内获得一过性表达从而获得大量的蛋白。本发明所用的CHO细胞是工业生产人临床用蛋白最为常见的一种细胞。不仅表达水平高，蛋白翻译后加工方式如糖基化等与体内天然蛋白相似，而且无潜在的生物危害性， 自身分泌的蛋白很少从而简化了后续的纯化过程，特别适于分泌型细胞因子或趋化因子等产物的大规模生产。而且这种细胞可以通过驯化在无血清培养基中生产，对于降低工业生产的成本是必需的；细胞密度能够提高数十倍甚至数千倍，大大提高了蛋白产量。采用本方法，可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高纯度高生物活性的 SDF-I-Fc蛋白。本项技术应用于SDF-I-Fc蛋白的大规模生产，能够明显降低成本、简化工艺流程，提高产品产量和质量。本发明中Fc重组蛋白易于结合ftOteinA，从而可简化蛋白的纯化过程。本发明纯化得到的高纯度SDF-I-Fc的Fc片段还赋予了重组蛋白一些其它特性， 从而可以增加其在在制药和临床方面的应用价值。
具体实施例方式实施例
1、制备转染用质粒用去除内毒素的质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)制备转染所需连有 SDF-I-Fc基因的表达质粒pR-SDF-la-Fc-EGFP。用200 μ 1 TE缓冲液溶解质粒，紫外分光光度计测其浓度。2、制备PEI转染溶剂(1)在500ml的烧杯中倒入450ml Milli-Q制备的超纯水；(2)称量500mg线性PEI (购自Poly Science公司)，加入烧杯中，磁力搅拌器不断搅动；(3)逐滴加入预先配好的12M浓HCl使其pH < 2. 0，搅动PEI溶液约2-3小时；(5)加入预先配制的IOM NaOH溶液将pH调至7. OL用Milli-Q超纯水将PEI溶液定容至500ml ；(6)利用0. 22 μ m滤膜过滤PEI溶液，分装成Iml/管，于_20°C保存。3、用质粒转染细胞(1)在转染前2天将细胞用无抗、含10%胎牛血清的DMEM完全培养基重悬， 按照1. 5 X 105/mL铺入T15tl培养瓶中，每瓶加入30mL，5% C02，在培养箱中培养过夜；(2)转染当天，将所需的Opti MEM培养基(或磷酸盐缓冲液)预热到25° _37°C， 溶解连接SDF-I-Fc基因的表达质粒和PEI ；(3)在 5mL Ep 管中加入!ML Opti MEM/PBS,加入 60 μ g 连有 SDF-la-Fc 基因的质粒DNA pR-SDF-Ia-Fc-EGFP (紫外分光光度计测其浓度后，加入Elution Buffer调整浓度至1 μ g/ μ L)，在振荡器上轻轻涡旋；(4)加入120L lmg/mL的PEI，立即在振荡器上振荡3次，每次3秒钟；室温下将混合液孵育15分钟；(5)取出预先铺入培养瓶的细胞，将DNA/PEI混合液加入细胞培养液中，将瓶体竖起，轻轻摇晃培养瓶混勻；将细胞放入培养箱中继续培养。细胞转染效果见附
图1。4、表达产物收集及纯化(I)CHO细胞转染6hr后，将细胞培养瓶完全中培养基吸出，加入30mL无血清培养基(SFM)。同时加入2mM谷氨酰胺和ImM丙酮酸钠后继续培养；(2)转染后M小时后就可用荧光显微镜观察细胞的转染效率；2天、4天和6天分别收集细胞上清(注意不要把细胞去掉)，并且加入新鲜的SFM及谷氨酰胺和ImM丙酮酸钠 (6天除外)；收集的上清4000rpm/min离心IOmin去死细胞和细胞碎片；(3)将上清吸入透析袋中，用PEG 20，000进行浓缩，使其体积缩小至IOmL左右； 与此同时，用20mL超纯水洗涤2mL Protein A的预装柱；(4)洗涤后，20mL PBS (pH 7. 3)平衡柱子；(5)将浓缩后的细胞上清上柱，并收集流下的液体，将其重新上柱；重复两次；(6)用 20mLPBS (pH 7. 3)洗柱；(7)最后用8X0. 5ml IOOmM柠檬酸缓冲液(pH 3. 0)洗脱蛋白产物，用预先加入 170 μ 1 IMTris pH 9. 0的1. 5mL离心管收集液体并中和。紫外分光光度计及SDS-PAGE测蛋白浓度及纯度。SDF-Ia-Fc重组蛋白的纯化结果见附图2。
权利要求
1. 一种哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-1与人免疫球蛋IgG的Fc段融合基因(SDF-I-Fc)的方法，其特性在于该方法通过如下步骤实现哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-1与人免疫球蛋IgG的Fc段融合基因(SDF-I-Fc)(1)制备转染用质粒；(2)制备PEI转染溶剂；(3)用质粒转染细胞；(4)进行表达产物收集及纯化。
全文摘要
本发明涉及一种哺乳动物细胞大规模生产人基质细胞衍生因子-1与人免疫球蛋IgG的Fc段融合基因(SDF-1-Fc)的方法。采用本方法，可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高纯度高生物活性的SDF-1-Fc蛋白。在工业生产中满足降低生产成本、简化工艺流程、提高产品产量和质量的总体要求。Figure 1转染72h后细胞照片(×100)Figure 2 SDS-PAGE鉴定纯化后的SDF-1a-Fc重组蛋白(Lane 1SDF-1a-Fc；2Prestained Marker；3SDF-1a-Fcwith DTT)
文档编号C12N15/85GK102154346SQ20111000658
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者吴咪佳, 周慧芳, 朱月珍, 杨宣武, 柴笑梅, 江永海 申请人:江苏普罗赛生物技术有限公司