专利名称：交感神经系统功能的诊断方法和评价试剂盒的制作方法
背景技术：
(a)发明领域本发明涉及交感神经系统功能的诊断方法和评价试剂盒，这是基于通过光度测定从酪胺形成的酚乙醇胺来检测多巴胺-β-羟化酶的比活性实现的。(b)在先技术的描述多巴胺-β-羟化酶[DBH3，4-二羟基苯乙胺，抗坏血酸根氧氧化还原酶(β-羟基化)EC 1.14.17.1]作为一混合的铜-依赖酶催化从多巴胺到去甲肾上腺素的羟基化，其在人与动物血液中的存在是由其在含有儿茶酚胺的小泡中的定位引起的，小泡位于中枢与交感神经系统中和肾上腺髓质的嗜铬颗粒中(Stewart LC等，Ann Rev Bioch，1988，57551-592)。
在人和大鼠中血清纯化酶的性质与特征已被很好描述(Ikeno T等，Mol Cell Biochem，1977，18(23)117-123)。血清DBH活性在生物化学上和免疫化学上都与其他组织中的相似，而不管所用的物种是什么。DBH解离二聚体形式的存在已被详细描述为作为糖蛋白和铜-依赖酶的从纯化的人胞浆或嗜铬细胞瘤中来的酶。在对交感神经系统的刺激中，DBH与去甲肾上腺素一起被释放到血液中。DBH、去甲肾上腺素和肾上腺素的分泌也在免疫抑制过程中被抑制。多巴胺-肾上腺素途径在神经变性、神经内分泌、精神易感性和心血管疾病的情况下，和在烧伤、慢性疲劳和紧张的情形如恐慌综合症下受到影响。
在人血液中发现DBH导致一种提议，即血清活性可能提供人交感神经系统功能的一个指示(Geffen LB，生命科学(Life Sci)，1974，14(9)1593-1604)。然而，并不存在诊断性测定方法来直接确定DBH以作为评价交感神经系统功能或下丘脑-垂体-肾上腺轴的工具。下丘脑-垂体-肾上腺轴在人体对付如感染、低血压、免疫缺陷、手术、精神易感性和神经变性紊乱的紧张情况下有着重要的作用。下丘脑-垂体二者是大脑的“外门”。下丘脑自己也受到大脑其他部分特别是mesolimbic系统的调节影响。下丘脑激素促皮质素释放激素和精氨酸后叶加压素都是前垂体分泌促皮质激素的重要刺激物。
当前，临床测定下丘脑-垂体-肾上腺-交感神经(HPAS)轴和下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴都是基于刺激垂体释放促肾上腺皮质激素(ACTH)或肾上腺释放ACTH-依赖的类固醇来评价可疑的肾上腺机能减退。基本上，迄今尚没有可用的检测来评价HPA轴。最常应用的检测HPA轴的检验都是侵害性的，并应用短期ACTH注射实验(SAT)、胰岛素低血糖实验(IHT)、短期甲基双吡啶丙酮实验(SMT)和释放肾上腺皮质激素激素(CRH)实验。当今，在临床实践中的这些实验的可靠性在正常患者或在排除了所有在皮质素和去甲肾上腺素与肾上腺素(包含在其自身的所有HPA和HPAS轴中的)之间的关系的患者中的血浆ACTH和皮质醇之间的剂量-反应关系方面仍有疑问。临床常用的测定HPA轴的方法有不少缺点，例如缺乏与间接检测方法相关的敏感性、花费高、费时、循环抗体、不能敏感地测到中等程度的次级肾上腺机能减退、不适合于肾上腺萎缩。还不存在临床上可靠的实验来检测涉及多巴胺-肾上腺素途径的酶活性。
这些先前在特别临床情形下应用的实验的可靠性在以下几个方面受到怀疑，例如剂量-反应关系、对任何形式的肾上腺机能不全的特异性，如敏感性、并发症和副作用等。直到最近，临床儿茶酚胺神经化学主要用来检测作为效应化合物的儿茶酚胺的释放，以指示外周神经系统的活性。但是基于儿茶酚胺表型改变临床显著性理解的新进展，如在本发明中描述的血清DBH比活性，将要被更多地需求以给诊断、治疗和神经遗传疾病的病生理提供可能重要的线索。在此方面，有必要开发出临床工具，它是基于蛋白参与在儿茶酚胺和所有相关物以及它们的动态平衡或生化平衡涉及的所有相关代谢化合物的合成、贮存、释放、代谢和循环中。
将特别希望能提供诊断交感神经系统功能的临床工具。
将特别希望能提供诊断神经变性、神经内分泌、精神易感性和心血管疾病、烧伤、慢性疲劳和恐慌综合症的临床工具。发明概述本发明的一个目标是提供诊断交感神经系统功能和紧张的临床工具。
本发明的另一个目标是提供诊断神经变性、神经内分泌、精神易感性和心血管疾病、烧伤、慢性疲劳和恐慌综合症的临床工具。
依据本发明的一个实施例，它提供了一种基于通过分光光度检测从酪胺形成的酚乙醇胺来检测多巴胺-β-羟化酶比活性以评价交感神经系统功能的诊断方法。
依据本发明，“患者”包括但不限于人和动物如家养与群牧动物。
依据本发明的一个实施例，它提供了一种从血清样品中通过检测多巴胺-β-羟化酶比活性来评价患者交感神经系统功能的体外诊断方法。它包括以下步骤a)过滤血清样品以基本除去药物和多巴胺-β-羟化酶的内源抑制剂；
b)把由步骤a)得到的过滤样品和多巴胺-β-羟化酶底物温育，以转化为可检测化合物；c)测定可检测化合物的量以评价多巴胺-β-羟化酶活性并与正常样品比较；其中，比正常值低则指示交感神经系统功能降低，比正常值高则指示交感神经系统功能升高。
依据本发明的另一个实施例，它提供了一种从血清样品中通过检测多巴胺-β-羟化酶比活性来评价患者交感神经系统功能的体外诊断方法。它包括以下步骤a)在含有干粉酚乙醇胺的小瓶中，过滤血清样品以基本除去药物和多巴胺-β-羟化酶的内源抑制剂，得到样品溶液；b)将样品溶液和多巴胺-β-羟化酶底物温育，以转化为可检测化合物；c)通过带正电荷树脂测定可检测化合物的量以评价多巴胺-β-羟化酶活性并与正常样品比较；其中，比正常值低则指示交感神经系统功能降低，比正常值高则指示交感神经系统功能升高。
优选地，小瓶有开口，含有可移动滤网，滤网紧紧地放在与酚乙醇胺干粉相隔一段距离的地方。更优选地，滤网放在小瓶的上边沿或在上边沿与酚乙醇胺溶液之间的地方。优选地，滤网的孔径为100μ。
依据本发明的方法，底物优选为酪胺，可检测化合物优选为酚乙醇胺衍生物。更优选地，底物也包括用来结合酚乙醇胺衍生物的正电树脂，以节省操作和时间。
方法进一步优选地包括在b)和c)之间的一个步骤，该步骤为将过氧化氢酶加入以降解过氧化物，它可以抑制酶活或多巴胺-β-羟化酶的酶活。
优选地，通过在温育培养基中进一步加入NaIO4并用分光光度检测对羟基苯甲醛来测定酚乙醇胺衍生物的量。
依据本发明的方法，交感神经系统功能降低就指示着神经变性、神经内分泌、精神易感性和心血管疾病、烧伤、慢性疲劳和恐慌综合症。
依据本发明的方法，交感神经系统功能升高就指示着紧张的效果。
更精确地，以下的病理与交感神经系统功能降低有关·精神分裂症；·精神易感性紊乱；·月经性偏头痛；·低血压；·心力衰竭；和·心肌梗死更精确地，以下的病理与交感神经系统功能升高有关·急性脑血管；·由饥饿、食物限制、工作压力或寒冷带来的紧张；·高血压；·交感性活性过高。
依据本发明的另一个实施例，它提供了体外测定多巴胺-β-羟化酶比活性的试剂盒，该试剂盒包括下列组分a)含有酚乙醇胺溶液的小瓶，有紧紧地安放在离溶液有一段距离的可移动的滤网；b)为转化为可检测化合物的多巴胺-β-羟化酶底物；和
c)过氧化氢酶溶液。
优选地，组分a)也包括醋酸钠缓冲液和N-乙基马来酰亚胺。优选地，组分b)含有酪胺和抗坏血酸根。更优选地，组分b)也包括富马酸根二钠和盐酸帕吉林。附图的简要说明
图1表示在人血清中DBH比活性对pH的依赖；图2表示酶浓度对人DBH比活性的作用；图3表示酪胺浓度对人血清中DBH比活性的作用；图4表示抗坏血酸根浓度对人血清中DBH比活性的作用；图5表示N-乙基马来酰亚胺(NEM)浓度对人血清中DBH比活性的作用；图6表示铜浓度对人血清中DBH比活性的作用。每个方块代表对25个患者至少六次测定；图7表示在EDTA-处理的人血液中测定的DBH活性的生化特性和动力学参数；图8表示在针对不同年龄组的224名正常健康受验者中测定的血清DBH酶活性的分布(％)；和图9表示依据本发明的一个实施例的小瓶，该小瓶具有一个紧紧地放在离溶液有一段距离的可移动滤网。发明的详细描述多巴胺-β-羟化酶活性的生化特性和动力学参数在未纯化的正常人血清中已被测定。酶活性1)抗坏血酸根-依赖性被外源10mM抗坏血酸根饱和；2)独立于加入的外源铜，当浓度高于4μM时，导致显著性地降低；3)被20mM酪胺饱和；4)在少到1到20μL血清中测定；5)发现对抗坏血酸根的亲合力大于对酪胺的亲合力其Km值是比酪胺的低10倍；6)在温育培养基中被15mM N-乙基马来酰亚胺显著增强；7)在年龄为15到85岁的男女受验者之间分布相似，没有显著的性别和年龄差异。
本发明的诊断试剂盒快速、敏感、简单和可重复生产，其临床值的分布范围比文献中报道的要窄，这是因为血液被过滤以避免抑制剂和药物的相互作用，因而预示本技术在临床调查中是一有用工具。并且，本发明的试剂盒可用少量血液样品进行定量的DBH比活性测定，而没有由患者通常服用的药物如β-阻断剂、钙离子阻断剂等的干扰。材料酚乙醇胺、L-酪胺、抗坏血酸、富马酸根二钠、盐酸帕吉林、高碘酸-m-钠、N-乙基马来酰亚胺(NEM)和牛血清白蛋白从SigmaCo.(St-Louis，Mo，U.S.A.)购得。亚硫酸氢钠和亚硫酸钠从FisherScientific(Ste-Foy，Quebec)购得，牛肝脏过氧化氢酶从BDH(Ville St-Laurent，Quebec)购得，DOWEXTM50×4-400从Aldrich ChemicalsCo.(Milwaukee，WI)购得，DIAFLOTM超滤膜，YM100型从AmiconCanada Ltd(Oakville，Ontario)购得，它可被安装到如图9所示的小瓶上。实验过程从224名显然健康没有特别疾病、酗酒和药物滥用历史的男性(78)和女性(146)受验者中得到血清样品。在8点到10点间采集他们的血清样品用于通常的常规临床血液评价。所有血液样品都通过在左臂静脉穿刺得到，然后放置到冰上并在10000克、4℃下离心10分钟。移去血清并贮存在-80℃下，直到进行多巴胺-β-羟化酶(DBH)的活性的测定。酶的制备在25名随机分布的男性和女性受验者组中测定动力学参数和生化特性。在预温育之前，取合适的血清量作为酶源，在去离子的冰冷的水中稀释到终体积400μL。为测定单个DBH酶活性，通常用20μL人血清。对于超过滤方法，把血清样品通过YM100型DIAFLOTM超滤膜，用40μL超滤液来测定酶活(图9)。酶测定用Roberge和Charbonneau(Roberge AG等，Nutr Res，1985，557-63)描述的方法测定DBH的比活性。预温育混合物含有0.2M醋酸钠缓冲液(pH5)、15mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)和酶源(来自血清样品)，在25℃空气的代谢摇床(Dubnoff)中温育10分钟。在预温育酶源中加入如下物质至终体积1mL10mM富马酸、10M抗坏血酸，2500单位过氧化氢酶和作为单氨氧化酶抑制剂的1mM帕吉林。以同样的方式建立空白和内标，但用20mM酚乙醇胺代替酶源。温育开始，用20mM酪胺，在37℃空气的代谢摇床(Dubnoff)中温育30分钟。在冰上，在每个试管中加入300μL 3M三氯乙酸以终止反应，然后立即在4℃、2500克下离心10分钟。把上清液移注到DOWEXTM50×4-400树脂柱上，该酸用3M NH4OH洗脱。形成的酚乙醇胺用高碘酸盐分解转化为对羟基苯甲醛，该对羟基苯甲醛用醚和氨水进行连续的溶剂抽提而分离出来。最后的水相用双波长分光光度计(333-360nm)测量。比活性用每毫升每分钟形成的纳摩尔(nmol)酚乙醇胺表示。加到空白温育混合物中的酚乙醇胺的回收率为90±2％。L-酪胺被用作底物，等分的未被纯化的血清作为酶源，通常为20μL。酶动力学表观米氏常数(Km)和表观最大速度(Vmax)用Woolf图表法和通常的Lineweaver和Burk方法测定。依据Wilkinson的方法来做与酶动力学相关的统计学估计。蛋白质测定用牛血清白蛋白做标准测定蛋白浓度。统计分析通过Duncan实验计算平均值、标准偏差、平均值标准误差(SEM)、Chi方检验、配对-t-检验和单向ANOVA。当p＜0.05时认为平均值之间的差别是显著的。本方法偏差的内部-测定系数(intra-assaycoefficient of variation)小于1％。在4个月的时间内对于相同的受验者，数据的重复性是高度相关的(p＜0.01)。结果从10个不同的贮藏血清中得到的蛋白浓度是72±8mg/mL，通过超过滤得到的为16.5±2mg/mL。保留这些数据以估计用每毫克蛋白形成的酚乙醇胺纳摩尔数来表示的酶活性。对pH的依赖性在图1中，用浓度恒定的抗坏血酸根(10mM)和酪胺(20mM)得到的从4到8的pH范围确定人血清中DBH的比活性。每个方块代表对25个受验者的血清样品至少六次的测定。结果用每毫升每分钟形成的酚乙醇胺nmol数表示(平均值±SEM)。在pH为4.8和5.0附近酶活达到最大活性(p＜0.05)，而在pH大于5.2时有持续的和显著的降低(p＜0.01；p＜0.001)。在pH为5时，酶比活性(平均值±SEM)为每毫升每分钟形成55.5±5nmol酚乙醇胺。此pH被选择用来做进一步的实验。温育时间实验温育时间直到60分钟的长度，温育在pH5下进行。温育混合物含有在以上部分中描述的所有组分。当结果用每毫升血清形成的酚乙醇胺nmol数表达时，在至少60分钟内，DBH比活性与温育时间是成比例的。为所有实验选择的温育时间为在37℃下30分钟。
分别在25℃和37℃下实验预温育的时间。因为没有观察到被测定的酶活性有显著的差异，为预温育时间选择的温度为25℃。酶浓度把不同体积的正常人血清1-200μL在400μL冰冷的水中稀释以测量DBH酶比活性。在图2中显示，应用的血清在50μL之内酶活是线性的，窗口显示血清为少到1-20μL时测定的酶活。每个方块代表对25个受验者的血清样品的至少六次的测定。结果用每30分钟形成的酚乙醇胺nmol数表示(平均值±SEM)。对于一个线性反应，血清对冰水的稀释比例的变化幅度为1∶400到1∶8。图上每个点代表对正常血清至少六次的测定。结果用每30分钟形成的酚乙醇胺nmol数表示(平均值±SEM)。
把大体积血清(从50到100μL)稀释到400μL冰冷的水中所做的实验显示，在温育培养基中NEM从15增加到30mM时，仍能维持线性反应。在100到200μL血清之间，无论培养基中NEM为多少，反应都不是线性的。在任何时间，在培养基中加入铜都能恢复反应的线性或促进酶活。所有进一步的实验都如上述通过把20μL血清稀释到400μL冰冷的水中以在终体积为1毫升的温育混合物中得到1∶20的比率。酪胺浓度在图3中显示当抗坏血酸根恒定为10mM时，酪胺的浓度高达30mM时表现出的对DBH酶比活性的影响。每个方块代表对25个受验者至少六次的测定。结果用每毫升每分钟形成的酚乙醇胺nmol数表示(平均值±SEM)。在人血清中DBH对酪胺的动力学参数，作为底物，依据Woolf图表法从各点的的底物浓度计算Km和Vmax值。
在酚乙醇胺的形成中，显示与应用的酪胺量(高达15mM)相关的持续升高，之后是一个平台(p＜0.05)。图中的每个点代表对正常血清至少六次的测定。结果用每毫升每分钟形成的酚乙醇胺nmol数表示(平均值±SEM)。在酪胺20mM下观察到的饱和点在所有进一步应用20μL血清作为酶源的反应中都得到保持。对抗坏血酸根的依赖性在图4中，显示当酪胺在温育混合物中恒定为20mM时，抗坏血酸根浓度(0到30mM)的作用。酶活被高达10mM的抗坏血酸根所促进(p＜0.01)，接着是一个平台(p＜0.05；p＜0.01)。每个方块代表对25个受验者至少六次的测定。结果用每毫升每分钟形成的酚乙醇胺nmol数表示(平均值±SEM)。在人血清中DBH对抗坏血酸根的动力学参数作为辅助因子。依据Woolf图表法从各点的抗坏血酸根浓度计算Km和Vmax值。在10mM抗坏血酸根下得到的饱和点在所有进一步的实验中都得到保持。表I显示在去掉通常在温育培养基中含有的不同组分时测定的酶活，表明在培养基中没有抗坏血酸根就会导致酶活的显著降低(96％，p＜0.001)。
表I 血清多巴胺-β-羟化酶活性辅助因子的作用去掉的因子＝活性++％对照无(对照) 53.7±0.18 100抗坏血酸根 2.2±0.194过氧化氢酶 5.6±0.4510富马酸根 47.5±1.00 88N-乙基马来酰亚胺(NEM)35.6±0.39 66NEM和富马酸根36.2±0.79 67＝在方法部分描述的在通常情况下(对照)和在反应混合物中某些组分缺失的情况下，25个正常人血清被用来测量DBH酶活。
++结果用37℃下每分钟每毫升形成的酚乙醇胺nmol数表示，每个结果都是至少10个测量的平均值±SEM。过氧化氢酶浓度用不同过氧化氢酶浓度来获得最大酶活性。在温育培养基中过氧化氢酶到达2000单位之前，观察到酶活的持续增加(p＜0.01)，然后是一个平台直到4000单位。在表I中，温育培养基中过氧化氢酶的缺失使酶活降低到10％(p＜0.001)。在所有进一步的实验中过氧化氢酶都是2500单位。富马酸根浓度无论用任何浓度，直到40mM，在温育培养基中加入富马酸根都导致酶活轻微但却显著的增加(12％，p＜0.05；表I)。在温育培养基中同时缺失富马酸根和NEM能显著地增加酶活达33％(p＜0.05，表I)。对于所有进一步的实验，都保持10mM的富马酸根。NEM浓度图5描述了不同浓度的NEM(直到60mM)的作用。每个方块代表对25个受验者至少六次的测定。结果用每毫升每分钟形成的酚乙醇胺nmol数表示(平均值±SEM)。NEM的存在，直到15mM，都能显著增加酶活(p＜0.01)，然后是一个平台直到60mM。表I显示，温育培养基中缺失NEM能使酶活显著降低36％(p＜0.01)。在所有进一步实验的温育培养基中都有15mM的NEM。外源铜与NEM的相互作用在温育培养基中有、无15mM NEM的情况下，分别描述不同铜浓度，从0到20μL，对DBH酶比活性的作用(图6)。结果用每毫升每分钟形成的酚乙醇胺nmol数表示(平均值±SEM)。
结果显示，在培养基中没有NEM的情况下(图6，黑色方块)，与有NEM的情况相比(图6，白色方块)，酶活有显著降低(66％；p＜0.01)。当培养基中有NEM时测量的酶活，在有直到2μM的外源铜浓度时和在铜不存在时并没有显著差别(图6，白色方块)。然而，当外源铜含量高于2μM时则可观察到酶活持续与显著地降低(p＜0.05)，在20μM时观察到最大量的下降(90％，p＜0.001)。
当温育培养基中没有NEM时，与培养基中没有铜时测得的数据相比，加入直到4μM的不同铜浓度并不能显著地改变酶活(图6，黑色方块)。然而，当外源铜含量高于4μM直到20μM时，则可观察到酶活持续与显著的降低(p＜0.001)。当两条曲线相比较时(图6，白色与黑色方块)，在外源铜浓度分别到2和4μM时，可观察到酶活性的显著差别(p＜0.001；p＜0.05)，但在更高铜浓度时却没有任何显著差异。图中每个点都代表对正常血清至少六次的测定。结果用每毫升每分钟形成的酚乙醇胺nmol数表示(平均值±SEM)。在所有进一步实验的温育培养基中都有15mM的NEM但却没有铜。
用通过YM100型DIAFLOTM超滤膜的血清样品研究培养基中铜与NEM的关系，测量超滤液中的酶活性。结果显示酶活性并不被培养基中15mM NEM的存在而增强，在有和没有NEM存在时的活性结果每毫克蛋白每小时形成的酚乙醇胺分别为52±0.7和50±0.6nmol。并且，在培养基中加入铜直到4μM时并不影响酶活性，但高浓度时却导致活性降低，这与图6中显示的结果吻合。在培养基中有和没有铜存在时，酶活性每毫克蛋白每小时形成的酚乙醇胺为51±0.56nmol。动力学参数在图3和图4中，分别用Woolf图表法计算动力学参数，在温育培养基中应用不同浓度的酪胺(底物)和抗坏血酸根(辅助因子)。在人血清中，在pH5.0下，对酪胺的表观米氏常数(Km)是8mM，表观Vmax值是每毫升每分钟形成酚乙醇胺72nmol(图3)，在此计算的对抗坏血酸根的Km值为0.77mM，最大速度为每毫升每分钟形成酚乙醇胺56nmol。铜螯合物在图7中，用一种铜螯合剂EDTA处理人血液，测定DBH酶比活性，分别针对pH依赖性、加到温育培养基中的铜浓度和动力学参数。对pH的依赖性、铜浓度的作用和依据Lineweaver和Burk方法计算得出的Km和Vmax值都分别标出。结果用每分钟每毫升形成的酚乙醇胺nmol数表示(平均值±SEM)。
EDTA抑制被在培养基中加入的0到100μM外源铜持续地逆转，随后当铜浓度高于140μM时有酶活性降低(图7，白色方块)。根据其pH依赖性，对于用EDTA处理的血液，观察到最适酶活是在pH5.8而不是在pH5.0(图7，黑色方块)。在pH5.8处测量的对于底物酪胺的Km和Vmax值分别是2.4mM和38.5nmol每毫升每分钟形成的酚乙醇胺(图7)，与观察到的正常人血清(图3)对底物酪胺的值有显著不同(p＜0.01)。在健康男性和女性受验者中的血清DBH图8针对不同年龄组(在15和85之间)描述了在224个显然健康的男女受验者中测量的人血清DBH酶活。结果用每分钟每毫升形成的酚乙醇胺nmol数表示(平均值±SEM)。对于每一个年龄组，受验者数都在括号中标出。依据用每分钟每毫升形成的酚乙醇胺nmol数(平均值±SEM)表示的酶活(＜20；21-40；41-60；61-80；81-100；＞100)将受验者分组。
酶活通常在20μl血清中测定，方法如方法部分所述。每个样品测三次，偏差的内部-测定系数小于1％。在4个月的时间内对于同一受验者测定的酶活高度相关(p＜0.01)。结果表明对于年龄组有同样的分布，但在组内却没有任何显著性差异。
表II分别描述了在女性(146)和男性(78)受验者中对于不同年龄组血清DBH酶活性的临床值(平均值±SEM；分布范围)。对于整组来说，观察酶活对于性别与年龄的任何显著性差异，数据显示分布范围的变化每毫升每分钟形成的酚乙醇胺nmol数为从2到138。在男性和女性组中，观察任何针对分布范围的显著差异。用来比较男性和女性受验者对于他们相关年龄组的所有统计学分析都显示是不显著的(p＜0.05)。
表II 不同年龄和性别的男女受验者的血清DBH活性临床值*年龄组 女性 男性15-20岁 (35)44.6±2.0 (5)47.4±10.9范围27-7611-7921-30岁 (20)53.4±6.0 (4)64.6±6.1范围13-10852-8131-40岁 (23)51.0±5.6 (12)51.8±6.4范围12-11121-8741-50岁 (22)60.7±5.1 (16)46.3±4.4范围24-11316-7751-60岁 (21)61.9±7.1 (22)56.6±5.7范围17-12215-11460-80岁 (26)65.9±8.6 (19)55.4±6.2范围3-138 19-133*结果用每毫升每分钟形成的酚乙醇胺nmol数(平均值±SEM)表示，分布范围显示在平均值之下。括号中代表的是应用的受验者数。讨论根据本发明，DBH酶活性的生化特点和动力学参数是在未纯化的正常人血清中测得的，血清DBH酶活的临床值是从针对年龄与性别的一组显然健康的男女受验者中测得的，因而能用来定义一个敏感的和可重复的临床检测方法。生化研究从人血清中测得的DBH酶活的生化特点和动力学参数可使我们展示1)DBH活性所依赖的最适pH为5.0；2)对酪胺的饱和点为20mM；3)培养基中有或无NEM，酶都独立于外源铜；4)培养基中有NEM能促进酶活性和稳定反应；5)酶是抗坏血酸根依赖的；6)酶活可用少到1-20μl血清测定，直到血清为50μl反应都呈线性；7)对酪胺和抗坏血酸根的动力学参数不同，显示对抗坏血酸根比对酪胺有更大亲合性。这些结果为此提供了良好的证据，即用未纯化的人血清作为酶源，在作为酶促反应的外源辅助因子的抗坏血酸根和铜之间的关系是不同的，酶是抗坏血酸根-依赖的。并且，正如EDTA螯合反应所显示的，NEM在温育培养基中的存在足能控制所有可溶的内源巯基抑制因子，因而能保证结合在酶活性位点上的作为内源辅助因子的铜在人血清中的角色。动力学研究人血清多巴胺-β-羟化酶(DBH)的结构和功能已被Frigon和Stone广泛研究(Frigon RP等，J.Biol Chem，1978，253(19)6780-6786)，纯酶的动力学参数和生化特点也如此(Ikeno T等，Mol Cell Biochem，1977，18(23)117-123)。对于pH依赖和对酪胺的饱和点，本结果与先前在人血清、大鼠血清、猫和大鼠肾上腺中(Fortin D等，Comp Biochem Physiol，1993，104B(3)567-575)和在牛嗜铬颗粒中(Stewart LC等，Ann RevBioch，1988，57551-592)观察到的数据是相当一致的。根据抗坏血酸根浓度，其Km值比酪胺浓度低10倍，因而提示酶对作为辅助因子的抗坏血酸根在人血清中有更高的亲合力(Ikeno T等，Mol Cell Biochem，1977，18(23)117-123；Frigon RP等，J.Biol Chem，1978，253(19)6780-6786)，在猫和大鼠肾上腺中(Fortin D等，Comp Biochem Physiol，1993，104B(3)567-575)和牛肾上腺髓质中(Stewart LC等，Ann RevBioch，1988，57551-592)也被观察到。并且，对酪胺和抗坏血酸根的Vmax值是处于同一数量级的，与报道的人血清活性相似但却比报道的在其他物种血清中的值要显著地高(Geffen LB，Life Sci，1974，14(9)1593-1604)。根据本结果，显然可以指出，观察到的DBH酶对抗坏血酸根的动力学参数不能被归因于铜的不足，因为外源铜并不能激起酶活性，不管使用的浓度是多少和培养基中是否有NEM。对外源抗坏血酸根的依赖性本研究显示在温育培养基中缺失抗坏血酸根使酶活在人血清中只为文献报道的和在其他不同组织中的4％(Fortin D等，Comp BiochemPhysiol，1993，00(0)305-491)。并且，对于过氧化氢酶的存在来说，必须存在酶-抗坏血酸根复合物以阻止过氧化物在培养基中的形成(Frigon RP等，J.Biol Chem，1978，253(19)6780-6786)与维持最适酶活性。在牛肾上腺中，有报道说外源抗坏血酸根能在羟基化的环境中阻止内在还原的抗坏血酸根的缺失，因而提示在DBH活性水平上抗坏血酸根的调节角色(Menniti F等，J Biol Chem，1986，261(36)16901-16908)。先前的发现也显示富马酸根可作为一调节因素，且与富马酸根无关的阴离子结构如醋酸与氯化物能作为对DBH酶的重要生理角色。在此方面，本研究表明富马酸根轻微但却显著地增加了酶活性，这因而与研究阴离子在反应中的生理角色的文献是一致的，并强调在所有温育培养基中都已存在的阴离子如氯化物能与富马酸根一起促进酶的活性。在NEM和铜之间的联系在人血清中DBH酶抑制剂的自然存在导致系统地添加一种巯基反应试剂NEM到温育培养基中(Geffen LB，Life Sci，1974，14(9)1593-1604)，在其他几个组织中也是一样。依据本数据，巯基化合物不与底物酪胺或辅助因子抗坏血酸根竞争，但却通过与可能是调节酶活性的蛋白-结合铜的配基的半胱氨酸基团竞争来抑制酶活性。在这方面，在温育培养基中有效的NEM浓度是相对高的(15mM)，因而显示配基并不参与化学修饰。并且，在人血清中观察到的本数据与下列通常说法是相当一致的，即内源铜微弱地结合在酶活性位点上，在纯化过程中发生改变、丢失与被螯合剂除去，因而有必要加入外源铜。在此方面，用EDTA处理的血液作为酶源所作的实验清楚地表明铜在酶位点上的活跃角色，因为当在培养基中有过量铜(100μM)时才能观察到逆转的抑制，这因而暗示EDTA在螯合结合酶位点的内源铜时，已诱发了一种只有外源铜才可抵抗的可逆机制。这些结果激起了兴趣，因为当用纯化的或半纯化的酶源时，加外源铜到培养基中对于恢复由纯化步骤导致的丢失是必需的(Ikeno T等，Mol Cell Biochem，1977，18(23)117-123；Frigon RP等，J.Biol Chem，1978，253(19)6780-6786)，并因而常常这样做。并且，为研究在培养基中的外源铜和NEM之间的反应和药物间的反应，用超滤方法去除酶源中分子量小于100,000的可溶分子，揭示出外源铜并不刺激去除其可溶性抑制剂的酶活，如在正常人血清中观察到的那样，这强调了它通过酶活性位点的作用，消除了在生理条件下对外源添加的需求。稳定剂NEM在作为酶源的未纯化的人血清的酶反应中的NEM与铜的关系很少被研究。从临床观点来看，本工作与以前在人血清中得到的数据是一致的，这些数据表明反应的真正最大速度是在培养基中没有铜的情况下得到的，但这些观察分别不适用于大鼠和豚鼠血清，因而分离了酶活性与物种之间的关系。文献中DBH酶活性临床值的差别与不同的因素相联系，如应用的血清体积、培养基中的NEM浓度、培养基中有无外源铜。这些因素导致临床数据的差异和它们的重复性。在这方面，在没有酶的可溶性内源抑制剂时用来测定酶活性的超滤方法使NEM对酶活性的活化作用无效，因此强调了它对正常人血清中存在的可溶性巯基化合物的重要作用。在NEM和在用冰水稀释步骤之前应用的人血清体积之间的关系被认为对于数据的重复性和方法的再现性都是重要的。并且，如果用多于50μL的血清来测量DBH酶活性，就不得不针对培养基中的NEM量或新的最适动力学条件对反应的线性做再定义。可以显明地指出，血清的冰水稀释步骤的比例应至少为1∶8，以考虑反应的线性和已经描述的动力学参数和生化特点。在这些最适条件下，对人血清来说，本方法用少至1-20μL的人血清就可清楚地显示Vmax值比文献中报道的要高出至少20％。临床研究本研究表明在224个显然健康的男女受验者中测量的血清DBH酶活性是1)在男性与女性组中有相似的分布，呈狭窄的分布；2)对于年龄与性别没有显著差异；3)在任何年龄组都没有男性与女性间的显著差异；4)对于单个受验者来讲，数据的重复性是高度相关的。健康的男性和女性受验者开展本临床工作是为了把人血清DBH酶活性定义为一种诊断调查的临床工具，这是基于特别的和有价值的生化研究和统计学可重复的临床数据的文献中的建议(Geffen LB，Life Sci，1974，14(9)1593-1604；Ogihara T等，J Lab Clin Med，1975，85(4)566-575)。已经做了几个临床实验以阐明酶在不同生理状态下的机制，并调查它在不同病理状态下的活性。然而，多数这些临床调查都不得不做得很广泛以便能得出结论和避免临床值的偏差，这些差别与不同的测定方法(LaduronP，Biochem Pharmacol，1975，24(5)557-562)、持续时间、取样程序、受验者的选择、受验者内和受验者间的DBH活性差异相关，其中受验者的差异是由于缺乏有价值的动力学研究而导致要对数据进行广泛解释而造成的(Geffen LB，Life Sci，1974，14(9)1593-1604；Ogihara T等，JLab Clin Med，1975，85(4)566-575)。
对显然健康的受验者的人血清DBH酶活性的测量与已经公布的调查的测量是相似的，用未纯化的血清作为酶源、在培养基中消除外源铜、在饱和点加入NEM和酪胺。预温育步骤与文献中报道的相比可增强20％的酶比活性。其次，本临床实验值比那些公布的在培养基中有过量铜、用处理过的胞浆或大体积血清(100μL和更多)的数据显著地高。在此方面，值得提起的是，用偶联酶苯基-N-甲基-转移酶(PNMT)方法测定人DBH酶活性以评价形成的肾上腺素得到了不同的结果。事实上，此方法涉及两个不同的动力学测量，它们在相同条件下没有必要都是最适的，因为这些原因，偶联酶方法就受到严重地怀疑。
本临床实验值显示DBH酶活性在男性与女性受验者间是相似的，在不同年龄组之间也没有显著差别，这在文献中也有报道。事实上，在对正常人群不同年龄组最广泛的研究中(Ogihara T等，J Lab clinMed，1975，85(4)566-575；Weishilboum RM等，科学(Science)，1973，181(4103)943-945；Sapru MK等，Acta Psychiatr Scand，1989，80474-478；Fujita F等，J Neurochem，1978，301569-1572)，显示DBH酶活性在成年中并没有显著的不同，但在生命的第一年与站立姿势发育相应的阶段中却有随年龄的持续升高(Fujita F等，J Neurochem，1978，301569-1572)。在任何年龄组的男女性别之间都没有显著差别(OgiharaT等，J Lab clin Med，1975，85(4)566-575)。然而，本实验中的分布范围却不象在文献中报道的(从13到1043U/ml)那么宽对于78个男性受验者是从11到130，对于146个女性受验者是从2到138。文献中认为DBH酶活性在受验者间宽泛的差异是遗传控制的(Geffen LB，LifeSci，1974，14(9)1593-1604；Weishilboum RM等，Science，1973，181(4103)943-945；Galvin M等，Psychiatry Res，1991，391-11)，但其任何受验者内的变化也都在本研究中被观察到。可以明显地指出，在小鼠、大鼠、豚鼠、猫、牛和不同灵长类中测出的血清DBH酶比活性都在每毫升每分钟pmol范围间，显著地低于在人血清中观察到的值。并且，针对年龄测定的酶活显示，在灵长类中从出生到生命周期的生长有一持续的增长，然而在猫中，在雌性中的酶活就显著地高于在雄性中的酶活，结果显示，在出生后开始的几天里酶活很低，但在40天时则达到持续的升高，并维持于终生。
在本研究中，样品收集得到技术上的控制，操作也较好地考虑到通常的临床程序，因而保证了数据对时间的可重复性，避免了内部技术误差。改善的本方法简单、快速、特异、可重复、比先前的技术更加敏感，可以被方便地介绍到工作台上用于临床检验。在此方面，本技术可以被认为是可用于不同诊断的临床工具和交感神经系统活性的指示。
尽管本发明与其特别的实施例被相联系地描述，但应该理解为它可以进行进一步的修正。本申请希望覆盖本发明的任何变化、应用或适应，一般地，覆盖本发明的原理和包括从本发明公开得到的外延，例如与本发明相关联的技术领域中已知的和习惯的做法，和在此之前公开的必要特点的应用和在所附的权利要求书的范围之内的应用。
权利要求
1.一种体外诊断方法，该方法能从血清样品中测出多巴胺-β-羟化酶活性以评价患者的交感神经系统功能；该方法包括以下步骤a)过滤血清样品以基本除去药物和多巴胺-β-羟化酶的内源抑制剂；b)把由步骤a)得到的过滤样品和多巴胺-β-羟化酶的底物温育以转化为可检测化合物；c)测定可检测化合物的量以评价多巴胺-β-羟化酶活性并与正常样品比较；其中比正常样品值低则指示交感神经系统功能降低，比正常样品值高则指示交感神经系统功能升高。
2.权利要求1的方法，其中所说的底物是酪胺，所说的可检测化合物是酚乙醇胺衍生物。
3.权利要求2的方法，其中所说的底物也包括结合酚乙醇胺衍生物的带正电荷的树脂。
4.权利要求3的方法，该方法也包括步骤b)和c)之间的步骤，该步骤为将过氧化氢酶加入以进行过氧化物的降解。
5.权利要求4的方法，其中所说的酚乙醇胺衍生物的量通过进一步与NaIO4温育和分光光度测定对羟基苯甲醛而确定。
6.权利要求5的方法，其中当交感神经系统功能降低时指示神经变性、神经内分泌、精神易感性和心血管疾病、烧伤、慢性疲劳、紧张和恐慌综合症。
7.权利要求5的方法，其中当交感神经系统功能升高时指示紧张的效果。
8.一种体外诊断方法，该方法能从血清样品中测出多巴胺-β-羟化酶比活性以评价患者的交感神经系统功能；该方法包括以下步骤a)在含有干粉酚乙醇胺的小瓶中，过滤血清样品以基本除去药物和多巴胺-β-羟化酶的内源抑制剂，得到样品溶液；b)将样品溶液和多巴胺-β-羟化酶底物温育，以转化为可检测化合物；c)通过正电荷树脂测定可检测化合物的量以评价多巴胺-β-羟化酶活性并与正常样品比较；其中，比正常样品值低则指示交感神经系统功能降低，比正常样品值高则指示交感神经系统功能升高。
9.权利要求8的方法，其中所说的小瓶有开口并含有紧紧地放在与所说的酚乙醇胺溶液相隔一段距离的可移动滤网。
10.权利要求9的方法，其中所说的滤网放在所说小瓶的上边沿或在上边沿与酚乙醇胺干粉之间的地方。
11.权利要求10的方法，其中所说的滤网是YM100TM膜或有可以让分子量低于100000的分子通过的膜孔。
12.权利要求11的方法，其中所说的底物是酪胺，所说的可检测化合物是酚乙醇胺衍生物。
13.权利要求12的方法，其中所说的底物也包括结合酚乙醇胺衍生物的带正电荷的树脂。
14.权利要求13的方法，该方法也包括步骤b)和c)之间的步骤，该步骤为将过氧化氢酶加入以进行过氧化物的降解。
15.权利要求14的方法，其中所说的酚乙醇胺衍生物的量通过进一步与NaIO4温育和分光光度测定对羟基苯甲醛而确定。
16.权利要求15的方法，其中当交感神经系统功能降低时指示神经变性、神经内分泌、精神易感性和心血管疾病、烧伤、慢性疲劳、紧张和恐慌综合症。
17.权利要求15的方法，其中当交感神经系统功能升高时指示紧张的效果。
18.依据权利要求8在体外测定多巴胺-β-羟化酶比活性的试剂盒，该试剂盒包括以下组分a)含有酚乙醇胺溶液的小瓶，该小瓶有紧紧地安放在离所说的溶液有一段距离的可移动滤网；b)为转化为可检测化合物的多巴胺-β-羟化酶底物；和c)过氧化氢酶溶液。
19.权利要求18的试剂盒，其中组分a)也包括醋酸钠缓冲液。
20.权利要求18的试剂盒，其中组分b)也包括酪胺和抗坏血酸根。
21.权利要求19的试剂盒，其中组分b)也包括富马酸二钠和盐酸帕吉林。
全文摘要
本发明涉及一种在体外通过测定血清样品的多巴胺－β－羟化酶比活性以评价患者的交感神经系统功能的诊断方法;该方法包括以下步骤:a)过滤血清样品以基本除去药物和多巴胺－β－羟化酶的内源抑制剂;b)把由步骤a)得到的过滤样品和多巴胺－β－羟化酶的底物温育以转化为可检测化合物;c)测定可检测化合物的量以评价多巴胺－β－羟化酶活性并与正常样品比较;其中,比正常样品值低则指示交感神经系统功能降低,比正常样品值高则指示交感神经系统功能升高。交感神经系统功能的降低是神经变性、神经内分泌、精神易感性和心血管疾病、烧伤、慢性疲劳、紧张和恐慌综合症的表示。交感神经系统功能升高时指示紧张的效果。
文档编号C12Q1/26GK1267335SQ98808195
公开日2000年9月20日 申请日期1998年5月28日 优先权日1997年6月16日
发明者安德烈·G·勒贝格, 米歇尔·沙瑞斯特 申请人:神经－生物技术公司