专利名称：二酰甘油酰基转移酶蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶，纯化并获得酶的方法及其相关氨基酸及核酸序列，以及此组合物在遗传工程应用中的使用方法。
导言背景植物油可用于种种工业及食用用途。需要新的植物油组合物和/或从生物合成或天然植物来源中获得油组合物的改良方法。根据油的应用，需要各种不同脂肪酸组合物。例如，在某些情况中具有较高的又与种肉比率的油料种子能用于以廉价而获得所需油。此是高价值油产物的典型，或如此油料种子可构成动物的优良饲料。在某些情况中具有低的油与种肉比率的油料种子将被用于低热量之目的。在其它应用中，具有较高不饱和脂肪酸百分率的可食用植物油为心血管健康之所需。或者，高饱和热带作物油如棕榈油、椰子油、或可可油的适度取代也发现用于各种工业及食用应用。
一种以获得如此油和/或修饰的脂肪酸组合物为目的的方法，是通过植物的遗传工程进行的。但为遗传工程化植物，必须具有适当的将遗传物质以稳定及可遗传的方式转移至植物中的方法。另外，必须具有能产生所需表型结果的核酸序列，能指导这种序列的正确应用的调节区等。另外，需意识到为产生所需表型，要求所谓的用于甘油脂合成之Kennedy途径被修改，以使经过此途径的反应物和代谢流量比率被调节或改变。
高等植物似乎经普通代谢途径合成油。脂肪酸在质体中从乙酰辅酶A经一系列反应，在已知统称为脂肪酸合成酶(FAS)的催化下产生。质体中产生的脂肪酸被输出至细胞的胞质区，并被酯化为辅酶A。这些酰基辅酶A是内质网(ER)中甘油脂合成的底物。甘油脂合成是首先导致磷脂酸(PA)及二酰甘油(DAG)的一系列反应。这些代谢中间物之一或两者可形成膜磷脂如磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)或磷脂酰胆碱(PC)，或者它们可以形成中性三酰甘油(TAG)，三酰甘油是被种子用作在种子萌发期间的能量贮存形式的植物油的主要成分。
二酰甘油(DAG)的合成是由甘油-3-磷酸和脂酰辅酶A经两个步骤经甘油-3-磷酸酰基转移酶(G3PAT)，溶血磷脂酸酰基转移酶(DAGAT)依次催化产生PA，然后经磷脂酸磷酸酶(PAP)催化的水解步骤产生DAG。在大多数细胞中，DAG用于产生膜磷脂，第一个步骤是经CTP-磷酸胆碱胞苷酰转移酶催化合成PC。在产生贮藏油的细胞中，DAG被第三个脂肪酸经二酰甘油酰基转移酶(DAGAT)催化反应酰化。总而言之，此反应构成了通常指作Kennedy途径的一部分。
TAG的结构，特别是脂肪酸的位置特异性经三种酰基转移酶的每种对脂酰辅酶A及甘油主链底物的特异性而确定。这样例如，许多温带物种的种子中的酰基转移酶允许sn-1或sn-3位的饱和或不饱和脂肪酸，但在sn-2位只允许不饱和脂肪酸。sn-2位的不饱和脂肪酸的绝对特异性经DAGAT酶的底物优选而确定。在某些物种如可可中，TAG组合物提示此倾向更进一步即如果sn-1位被酯化为饱和脂肪酸，sn-3位被饱和脂肪酸酰化呈明显优先。这样SUS形式(其中S＝饱和脂肪酸，U＝不饱和脂肪酸)的TAG结构，比基于sn-2位用不饱和脂肪酸固定的全部脂肪酸组合物的随机分布所预期的呈较高百分率。这提示DAGAT在TAG结构的调节中也起重要作用，如果不在TAG合成的控制中起重要作用的话。
经DAGAT催化的反应在甘油脂生物合成中是临界分支点。在此分支点的酶被认为是代谢调节位点的主要候选物。在经二酰甘油的合成的基础上，TAG和膜脂合成共享G3PAT，DAGAT，及PAP。由于所有细胞都具有细胞膜，它们必须具有这些酶。使油合成均一是DAGAT反应所致。DAGAT活性的存在为DAG提供除进入膜内的另一种结局。可推想驱动TAG合成的是DAGAT酶的存在，且不论直接或间接通过调节级联，DAGAT活性和/或二酰甘油浓度在调节进入甘油脂流量中起重要作用。
获得能在脂肪酸掺入甘油主链中以产生一种油过程中产生表型结果的核酸序列与存在各种障碍，包括但不限于感兴趣代谢因子的鉴别，具有有用的动力学性质的蛋白质来源的选择和鉴定，将感兴趣的蛋白质纯化至能进行氨基酸测序的水平，利用氨基酸序列数据获得能用作获得所需DNA序列的探针的核酸序列，构建体的制备，转化和所得植物的分析。
因此，需要鉴别靶酶及能修饰油结构及数量的如此靶酶的核酸序列的有用的组织来源。理想地，靶酶适于一种或多种单独应用或与其它与提高/降低油产生，TAG结构，脂肪酸集合体中饱和与不饱和脂肪酸的比率，和/或对脂肪酸集合体修饰而产生的其它新油组合物相关的核酸序列组合应用。一且靶酶被鉴别并定性，需要蛋白质的量及纯化方案以测序。最终需要具有提供表型修饰的必需元件的有用核酸构建体及含该构建体的植物。
一些DAGAT的推定分离步骤已被公布。Polokoff及Bell(1980)报道了从的大鼠肝微粒体中溶解并部分纯化DAGAT。此制备物不够纯因而不能鉴别负责活性的特殊蛋白质因子。Kwanyuen及Wilson(1986，1990)报道了从大豆子叶中纯化并鉴定该酶。但由分子量(1983kDa)提示此制备物未充分溶解，且在此所含的任何DAGAT蛋白质是许多蛋白质大聚集体的一部分。Little等(1993)报道了从油菜籽微孢子衍生的胚中DAGAT的溶解，但与Kwanyuen和Wilson相同，与活性相关的物质的分子量太高，未完全溶解。Andersson等(1994)报道了利用免疫亲和层析从大鼠肝中溶解并415倍纯化DAGAT。但没有证据表明他们所用的抗体识别DAGAT表位或他们纯化的蛋白质是真的DAGAT。实际上，与Kwanyuen及Wilson相同，在他们的制备物中DAGAT的活性呈现出聚集膜蛋白的典型分子量。最后，Kamisaka等(1993，1994，1996，1997)报道了从拉曼被孢霉中溶解DAGAT，随后纯化至均质。他们示出来自此真菌物种的DAGAT的分子量为53kDa，这是首次公开报道的可能真正已被溶解的DADAT。我们尝试在我们的实验室再复制其研究(见实施例4)，但未能获得均一制备物，或与53kDa多肽相关的酶活性。实际上，我们能示出与Kamisaka等要求的相似的高丰度的53kDa多肽在用他们的方案获得的组分中与DAGAT活性不相关。
相关文献据报道发育的jojoba胚的无细胞匀浆具有酰基辅酶A脂肪醇酰基转移酶活性。此活性与在差异离心形成的浮动蜡层相关(Pollard etal.，(1979)文献同上；Wu et al.，(1981)文献同上)。
具有脂酰-SCoA转酰酶活性的来自细小裸藻的多酶复合体的溶解由Wildner及Hallick(Abstract from the Southwest Consortium FifthAnnual Meeting，April 22-24，1990，Las Cruces，NM.)报道。
Pushnik等报道了jojoba酰基辅酶A醇转酰酶蛋白的10倍纯化(.Abstract from the Southwest Consortium Fourth Annual Meeting，February 7，1989，Riverside，Ca.)。
Garver等报道了jojoba酰基辅酶A醇转酰酶活性的分析(Analytical Biochemistry(1992)207335-340)。
WO 93/10241涉及植物脂酰辅酶A脂肪醇0-酰基转移酶。一种jojoba 57kD蛋白质被鉴定为jojoba脂酰辅酶A脂肪醇0-酰基转移酶(蜡合酶)。本发明人稍后报道了来自jojoba的57kD蛋白是参与非常长长链脂肪酸的生物合成中的一种β-酮脂酰辅酶A合酶，(Lassner et al.(The plant Cell(1996)8281-292))。
Shockey等也报道了推定为酰基辅酶A脂肪醇酰基转移酶的57kDjojoba种子多肽的光亲和标记。(Plant phys.(1995)107155-160)。
Kamisaka及Nakahara“含油真菌脂质体组分中二酰甘油酰基转移酶活性鉴定”J.Biochem.(1994)1161295-1301。
Kamisaka及Nakahara，“由阴离子磷脂去污剂溶解的二酰甘油酰基转移酶的活化”。J.Biochem.(1996)119520-523。
Kamisaka等。“含油真菌脂质体组分中的二酰甘油酰基转移酶活性的纯化及鉴定”J.Biochem.(1997)1211107-1114。
WO93/10241涉及植物脂酰辅酶A脂肪醇0-酰基转移酶。一种jojoba 57kD蛋白质被鉴定为jojoba脂酰辅酶A脂肪醇0-酰基转移酶(蜡合酶)。本发明人稍后报道了来自jojoba的57kD蛋白质是参与非常长长链脂肪酸生物合成中的一种β-酮脂酰辅酶A合酶(Lassner et al.(The Plant Cell(1996)8281-292))。
附图的简要描述
图1代表第一种蜡合酶纯化方案的柱组分中蜡合酶活性的分析结果。图1A提供了Blue A琼脂糖层析的结果。图1B提供了陶瓷羟磷灰石层析的结果。图1C提供了聚丙烯酰胺S-100大小排阻层析的结果。图1D提供了羟磷灰石层析的结果。
图2代表第二种蜡合酶纯化方案的柱组分中蜡合酶活性的分析结果。图2A提供了Blue A琼脂糖层析的结果。图2B提供了羟磷灰石层析的结果。图2C提供了Superdex75大小排阻层析的结果。
图3代表根据图1代表的蜡合酶纯化制备的纯化蜡合酶制备物组分中蜡合酶及DAGAT活性的结果。结果得自羟磷灰石层析步骤后的组分。
图4代表利用Yellow86-琼脂糖层析的DAGAT纯化方案的柱组分中蜡合酶活性的分析结果。
图5代表第二种蜡合酶纯化方案的柱组分中DAGAT活性的分析结果。图5A提供了肝素琼脂糖凝胶CL-6B层析的结果。图5B提供了峰组分的SDS-PAGE分析结果。
图6A代表Yellow86-琼脂糖层析中DAGAT纯化结果。图6B代表Yellow86-琼脂糖层析中峰组分的SDS-PAGE分析。
图7代表利用yellow 86-琼脂糖层析从拉曼被孢霉中纯化DAGAT的结果。
图8代表第二种蜡合酶纯化方案的柱组分中DAGAT活性的分析结果。图8A提供了羟磷灰石层析的结果。图8B提供了峰组分的SDS-PAGE分析结果。
图9代表DAGAT纯化方案的柱组分中DAGAT活性的分析结果。图9A提供了串联Yellow86-琼脂糖/羟磷灰石层析结果。图9B提供了串联层析峰组分的SDS-PAGE分析结果。
发明概要在本发明中，提供了与二酰甘油酰基转移酶(DAGAT)相关的组合物及使用方法。还提供了与生物活性DAAGT(s)相关的氨基酸序列的组合物及方法。
尤其感兴趣的是具有相对高特异性活性的DAGAT蛋白制备物的体内及体外的各种应用。特别涉及具有DAGAT活性的蛋白制备物。特别感兴趣的是可从拉曼被孢霉中获得的DAGAT。
还特别感兴趣的是本发明的jojoba蜡合酶也证实具有二酰甘油(DAGAT)活性这一发现。TAG不是jojoba中天然产生的，因此对DAG底物的蜡合酶的活性提示蜡合酶与DAGAT相关，DAGAT是一种负责在大多数植物物种中尤其种子含高水平贮藏TAG的油料种子作物植物中产生TAG的酶。这样品发明包括jojoba蜡合酶蛋白和/或其编码序列在分离编码DAGAT的植物基因中的应用。
所举例的jojoba及拉曼被孢霉DAGATs纯化自膜(即溶解)，并将溶解的DAGAT制备物进行各种层析分析，以鉴别与DAGAT活性相关的蛋白质。在此方式中具有大约40kDa分子量的蛋白质被鉴定为与DAGAT活性有关。利用进一步纯化方法如柱层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳，以获得足够纯度的DAGAT蛋白进行氨基酸序列分析。
DAGAT蛋白质的肽片段在设计各种可用作获得编码完整或部分DAGAT蛋白质的核酸序列的合成寡核苷酸中被用作模板。利用如此获得的DAGAT编码序列，其也能分离其它编码DAGAT蛋白质的DAGAT基因。
这样，本发明包括DAGAT肽及这些肽的相应氨基酸序列，该序列在制备含DAGAT编码序列的寡核苷酸以分析并回收DAGAT基因序列中发现有特殊作用。根据期望的应用此DAGAT编码序列可编码完整或部分序列。所有或部分基因组序列，或cDNA序列是期望的。
特殊感兴趣的是提供DAGTA序列转录或转录及翻译(表达)的重组DNA构建体。尤其能在植物宿主细胞中转录或转录及翻译的构建体是优选的。该构建体可含有各种调节区，包括得自在植物种子组织中优先表达的基因的转录起始区。
另一方面，本发明涉及通过构建体在细胞中的表达在宿主细胞中或其子代中产生DAGAT的方法。由DAGAT编码序列产生而含有DAGAT的细胞也包括本发明内。
另外，本发明涉及应用编码DAGAT的DNA序列修饰甘油三酯分子，尤其在植物油料种子作物的种子油中的甘油三酯分子的方法。具有如此修饰的甘油三酯的植物细胞也包括于本发明内。
本发明还包括由本发明植物LPAAT蛋白表达而获得的修饰的植物，种子及油。
发明详述本发明的二酰甘油酰基转移酶(DAGAT)包括任何得自细胞来源的氨基酸序列，如蛋白质、多肽或肽，其具有在酶反应条件下从1，2-二酰甘油-3-磷酸及酰基辅酶A底物催化三酰甘油产生的能力。“酶反应条件”是指使酶发挥功能的必需环境条件(即如温度，pH，抑制物缺失等因素)。
“溶解”是指从膜中提取DAGAT酶，其然后以不是膜相关的酶的典型方式起作用。因为膜将DAGAT蛋白与其它也其中存在的蛋白质有效连接，如以下实施例所述，溶解是鉴别及纯化DAGAT蛋白的必需要求。在DAGAT活性的溶解试验中，如在以下实施例中进一步详述的三种溶解的不同指征被考虑到。
1)DAGAT活性不是经非常高速离心沉降的。
2)DAGAT活性在大小排阻层析柱上迁移，仿佛其具有不是膜相关的酶的典型天然分子量。
3)DAGAT制备物中存在的蛋白质至少经柱层析部分互相分离。
由于上述各标准可有不同解释，需确认三种标准全已满足以确认DAGAT溶解。例如，第一种标准，即在非常高g力下不能沉降，如果用于溶解的溶液密度与未溶解膜的密度相似则可以被误导，因而其沉降非常缓慢。此情况在以下实施例中得以例证，其中只根据此标准公布的溶解步骤示出不能获得细胞质膜基本分离的DAGAT。第二种标准，其中经过大小排阻柱的溶解活性迁移比原始膜更慢，如果在暴露于去污剂之后膜自身与柱微弱结合，如此经过其时迁移很慢，这样可被误导。第三种标准，其中溶解的蛋白质是可层析分离的，是最不易被假象或意料之外的情况干扰。但膜可能经溶解步骤部分解离，从而释放各种蛋白质聚集体。该聚集体然后被层析互相解离。因此需满足所有三种标准以保证达到DAGAT溶解。
从jojoba中已获得溶解的蜡合酶蛋白质可以看出，目前可以进行进一步试验由底物特异性、辅因子要求及可能的活性抑制剂而鉴定酶。例如，已发现本发明的jojoba蜡合酶具有包括酰基ACP及酰基辅酶A分子的广谱酰基底物。另外，酰基及脂肪醇底物可具有与碳链长度相关的宽范围大小。例如，用有C12～C24碳链长度的底物试验的活性都显示被酶利用。另外，具有各种不饱和度的脂酰及脂肪醇的活性被显示出。
令人惊奇地，纯化的jojoba蜡合酶在此也示出具有二酰甘油(DAG)及脂酰辅酶A底物活性以产生三酰甘油(TAG)，尽管未报道TAG存在于jojoba植物组织中。这样，蜡合酶至少具有二种酰基转移酶活性，其一酰基辅酶A分子的受体底物是醇(脂肪醇酰基转移酶)，另一种受体底物是二酰甘油(DAG酰基转移酶，或DAGAT)。蜡合酶DAGAT活性的存在提示蜡合酶蛋白与其它植物物种中DAGAT蛋白密切相关。
被孢霉DAGAT的溶解在以下实施例中阐述。DAGAT的溶解经上述每种溶解标准而证实。
被孢霉DAGAT的溶解制备物用于各种层析实验中以鉴别及部分纯化DAGAT蛋白。在此方式中，具有大约40kDa分子量的蛋白质被鉴定为与DAGAT活性相关。如以下实施例中更详尽的阐述，40kDa的蛋白质经yellow 86-琼脂糖及羟磷灰石柱层析而部分纯化。然后经凝胶电泳及将部分纯化的DAGAT制备物印迹到硝酸纤维素而获得基本上纯化形式的蛋白质。经切割硝酸纤维素滤膜上含有鉴别带的部分回收40kDa蛋白质。
然后将纯化的蛋白质用各种酶消化以产生用于确定氨基酸序列的肽。
这样，本文所述40kDa蛋白质的胰酶化肽代表拉曼被孢霉DAGAT的一部分。其它被孢霉DAGAT肽可相似获得且氨基酸序列被测定。
应用DAGAT肽的氨基酸序列以获得编码DAGAT的核酸序列在此阐述。例如，制备相应于DAGAT肽序列的合成寡核苷酸，该寡核苷酸在PCR技术中被用作引物以获得DAGAT基因的部分DNA序列。然后将如此获得的部分序列用作探针以从制备自拉曼被孢霉组织的基因文库中获得DAGAT克隆。或者，低简并的寡核苷酸可制备自特定DAGAT肽，这种探针可用于直接筛选基因文库中的DAGAT基因序列。特殊地，由于背景杂交水平较低所以在此方法中可使用在噬菌体载体中的cDNA文库的筛选。
本发明的DAGAT的核酸序列可以是衍生自基因组DNA，cDNA，mRNA的DNA或RNA序列，或是全部或部分合成的。此基因序列可被克隆，如经从适当来源中分离基因组DNA，并用PCR扩增并克隆感兴趣的序列。或者，基因序列可被合成，全部或是部分合成，尤其当需要提供植物优选的序列时。这样，全部或部分所需结构基因(编码DAGAT蛋白的那部分基因)可用所选宿主优选的密码子合成。宿主优选的密码子可通过如从在所需宿主物种中表达的蛋白质中最常用的密码子确定。
本领域技术人员将易于意识到抗体制备物、核酸探针(DNA及RNA)可被制备，并用于从各种植物来源中筛选及回收“同源的”或“相关的”DAGAT。当有一致性序列时可发现同源序列，其可在对比序列信息(核酸或氨基酸)或通过已知DAGAT与候选来源间的杂交基础上加以检测。如Glu/Asp，Val/Ile，Ser/Thr，Arg/Lys及Gln/Asn的保守变化在检测序列同源性中也被考虑。在两个完整成熟蛋白质间至少25％序列相同的氨基酸序列被认为是同源的。(见Doolittle，R/F.，OFURFS and ORFS(University Science Books.CA.1986.)这样，从本文提供的具体例证的被孢霉蛋白质制备物及序列中可获得其它DAGAT。进一步地，很明显可获得天然及合成DAGAT，包括由例证的DAGAT及经用此例证序列而得的DAGAT模拟的修饰的氨基酸序列及合成蛋白的起始材料。修饰的氨基酸序列包括已被突变、截短、增多等的序列，不论该序列是否是部分或全部合成的。真正纯化自植物制备物或等同于其或编码相同蛋白质的序列，不管用于获得蛋白质或序列的方法如何，均认为是天然衍生的。
典型地，得自使用核酸探针的DAGAT序列示出在靶DAGAT序列与用作探针的编码序列间60-70％序列相同。但也可获得少至50-60％序列相同性的较长的序列。核酸探针可以是核酸序列的长片段，或可以是较短的寡核苷酸探针。当较长的核酸片段用作探针(超过大约100bp)时，可在较低严格性下筛选以从靶样品中获得与用作探针的序列具有20-50％偏差的序列(即50-80％序列同源)。寡核苷酸探针可比编码DAGAT酶的整个核酸序列短很多，但至少应有大约10个，优选至少15个，更优选大约20个核苷酸，当使用与较长区域相反的较短区域时，较高度的序列相同性是所需的。这样需要鉴别高保守氨基酸序列的区域以设计用于检测并回收其它相关DAGAT基因的寡核苷酸探针。较短探针经常特定用于PCR，尤其当高保守序列可被鉴别时(见Gould，et al.，PNAS USA(1989)861934-1938)。
除分离其它DAGAT之外，其它相关的酰基转移酶蛋白的基因经使用DAGAT及相关核酸序列的序列信息也可获得。例如其它包括质体DAGAT、线粒体DAGAT，溶血卵磷脂酰基转移酶(LPCAT)，溶血磷脂酰丝氨酸酰基转移酶(LPSAT)，溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶(LPEAT)。及溶血磷脂酰肌醇酰基转移酶(LPIAT)的酰基转移酶参与植物脂质生物合成中。这些酶都催化涉及溶血磷脂的sn-2位的酰基转移酶反应，且编码这些序列的基因也与本发明的植物酰基辅酶A DAGAT序列相关，并可从中获得。这样如本文所示，其它相关酰基转移酶包括来自jojoba的脂酰辅酶A脂肪醇0-酰基转移酶(蜡合酶)可能与二酰甘油酰基转移酶相关。
DAGAT及蜡合酶是同源蛋白质家族的成员这一事实经由从含油真菌拉曼被孢霉物种中纯化DAGAT而获得的信息而支持(见实施例)。首先，如jojoba蜡合酶，真菌DAGAT活性是膜结合的，且只通过使用去污剂而可被溶解。其次，与jojoba蜡合酶一样需要在溶解后在分析混合物中包括磷脂(如磷脂酸)，以恢复真菌DAGAT的酶活性。第三，真菌DAGAT在纯化层析期间表现非常类似于jojoba蜡合酶。具体地，这两种酶经羟磷灰石柱洗涤只轻微阻滞，而大多数其它在膜制备物中的蛋白质与柱基质结合(见实施例)。事实上，jojoba酶的经验预告，羟磷灰石层析是从拉曼被孢霉中纯化DAGAT的一关键步骤。此步骤的增加证实为真菌DAGAT成功纯化所必需，并推断出Kamisaka等(1997)的方案不足以鉴别与DAGAT活性相关的正确蛋白质。最后，由SDS-PAGE检测的真菌DAGAT多肽的表观分子量(33kDa)与由SDS-PAGE观测到的jojoba蜡合酶的相同(见实施例)。
为检测是否相关基因可用与给定序列杂交而分离，标记序列以典型地用放射活性检测，也可用其它方法。将标记的探针加入杂交溶液中，并用含所需核酸如Northern或Southern印迹的滤膜，或用含待筛选的cDNA或基因组克隆的滤膜温育。杂交和冲洗条件可变化以优化探针与相应序列的杂交。较低温度及较高盐浓度使更远缘相关的序列杂交(低严格性)。如果在低严格性条件下背景杂交是一问题，可在杂交或冲洗步骤提高温度和/或降低盐浓度以改进特异杂交序列的检测。杂交和冲洗温度可基于如Beltz等(Methods in Enzymology(1983)100266-285)所述的探针的估计解链温度而加以调整。有用的探针及适当的杂交及冲洗条件已如上述被鉴定，应用标记序列筛选cDNA或基因组文库，并优化条件。
为免疫筛选，抗椰子DAGAT蛋白质的抗体可经用纯化蛋白质给兔或鼠注射而制备，如此制备抗体的方法已为本领域所熟知。不论单克隆或多克隆抗体均可产生，尽管典型地多克隆抗体对基因分离更有效。可进行Western分析以确定相关蛋白存在于所需植物物种的粗提物中，通过与抗椰子DAGAT的抗体的交叉反应确定。当观测到交叉反应性时，编码相关蛋白质的基因经筛选代表所需植物物种的表达文库而被分离。表达文库可以构建于各种可商购载体包括如Maniatis等所述的λgtll中(Moleaular cloningA Laboratory Manual，SecondEdition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork)。
所有植物都利用DAGAT产生膜磷脂，这样任何植物物种均可被认为是附加DAGAT蛋白的来源。在其种子油中具有显著的中链脂肪酸的植物优选作为获得能将中链脂肪酸掺入TAG的sn-2位的植物DAGAT的候选物。萼距花属的一些物种在其种子中积聚含中链脂肪酸的甘油三酯，如平卧萼距花，lutea，hookeriana，hyssopifolia，wrightii及inflata。另一种中链脂肪酸的天然植物来源是樟科的种子。除例证的California Bay(Umbellularia californica)之外，Pisa(Actinodophnehookeri)，Sweet Bay(Laurus nobilis)及Cinnamomum camphora(camphor)也积聚中链脂肪酸。其它植物来源包括Ulmaceae(榆木)，棕榈科，肉豆蔻科，苦木科，Vochysiaceae，和刺茉莉科。
也特别感兴趣的是在贮藏TAG中掺入非常长长链脂肪酸的植物物种的DAGAT。例如，豆瓣菜属植物及meadowfoam在种子TAG中含有22∶1酰基，且meadowfoam已示出含有能将22∶1(芥子酸)脂酰基团掺入sn-2位的DAGAT。具有此活性的DAGAT发现可用于“三-芥子酸”芥属油的生产中，其在目前未被发现是由于朝向不饱和脂肪酸如18∶1及18∶2的芥属种子DAGAT的选择性所致。
也应指出各种来源的植物DAGAT可被用于研究在各种体内应用中植物脂质生物合成的TAG生物合成事件。因为所有植物都呈经普通代谢途径合成脂质，对一种植物DAGAT对异源植物宿主的研究和/或应用在各种物种中可被轻易达到。在其它应用中，植物DAGAT可被用于DAGAT的天然植物来源之外，以增加产量和/或修饰体外产生或合成的TAG的组合物。
与植物DAGAT蛋白相关的核酸序列将发现有许多用处。例如，可制备重组构建物用作探针，或提供在宿主细胞中的DAGAT蛋白的表达以产生酶的稳定来源和/或修饰其中发现的甘油三酯的组合物。当宿主细胞是植物宿主细胞时，不论体内或体外均可发现其它有效应用。例如，通过提高适用于植物TAG生物合成途径的相应中链优选DAGAT的量，可在TAG中获得百分率增高的中链脂肪酸。在一类似方式中对于某些应用需要经反义技术降低在植物细胞中内源表达的DAGAT量。例如，为使插入的外源DAGAT将中链或非常长长链脂酰基团转移至sn-2位提供更多机会，可需要天然芥属长链优选DAGAT的低表达。
这样根据打算的应用，构建体可含有编码完整DAGAT蛋白或其一部分的序列。例如，当需要DAGAT蛋白的反义抑制时，不需要完整DAGAT序列。进一步地，当打算将DAGAT构建体用作探针时，有利的是制备只含DAGAT编码序列一特定部分，如发现编码高保守DAGAT区的序列的构建体。
如上所述，编码本发明植物DAGAT的核酸序列可包括基因组，cDNA或mRNA序列。“编码”意指不论在有义或反义方向中都相应于特定氨基酸序列的序列。“染色体外”是指序列在天然相关的植物基因组之外。“重组”是指序列含有经诱变、限制性酶等操作遗传工程化的修饰。
cDNA序列可含或不含加工前的序列，如转运肽或定向序列以促进DAGAT蛋白(如线粒体DAGAT)送递给细胞器或膜的一定部位。如此前体DAGAT DNA序列的应用优选用于植物细胞表达中，基因组DAGAT序列可含有植物DAGAT的转录及翻译起始区、内含子，和/或转录终止区，这些序列可与或不与DAGAT结构基因一起用于各种DNA构建体中。这样，相应于本发明植物DAGAT的核酸序列也提供了用于指导蛋白质送递给特定细胞器或膜的一定部位的信号序列，具有有效组织及计时分布图的5’上游非编码调节区(启动子)，用作转录及翻译调节区的3’非编码调节区，并可为洞察此基因的其它特征提供帮助。
一旦获得所需植物DAGAT核酸序列，其可以各种方式应用。当序列包含非编码侧翼区时，其侧翼区可进行切除、诱变等。这样可对天然发生的序列进行转换、颠换、缺失及插入。另外，可合成所有或部分序列。在结构基因中，可修饰一个或多个密码子以提供修饰的氨基酸序列，或导入一个或多个密码子突变以提供合适的限制位点或与构建或表达相关的其它目的。结构基因可经应用合成衔接子、导入一个或多个方便的限制性位点的接头而进一步修饰。
编码本发明植物DAGAT的核酸序列或氨基酸序列可与其它非天然或“异源”序列以各种方式组合。“异源”序列意指一些非天然发现与植物DAGAT连接的序列，包括如不是天然发现连接在一起的相同植物的核酸序列的组合。
编码本发明植物DAGAT的DNA序列可与DAGAT正常相关的全部或部分基因序列联合应用。在其组成部分中，编码DAGAT的DNA序列被组合在一DNA构建体中，其在5’至3’转录方向具有能启动宿主细胞中转录及翻译的转录起始控制区，编码植物DAGAT的DNA序列及转录及翻译终止区。
潜在的宿主细胞包括原核及真核细胞二者。根据使用目的，宿主细胞可以是单细胞的或发现在多细胞分化或未分化的生物体内的细胞。本发明的细胞可经具有野生型细胞外源的植物DAGAT，如具有编码植物DAGAT的重组核酸构建体加以区别。
根据宿主，包括来自病毒、质粒或染色体基因的区域的调节区可以变化。为在真核或原核微生物，尤其是单细胞宿主中表达，可应用各种组成型或可调节启动子。在微生物中表达可提供植物酶的便利来源。在已描述的转录起始区中是包括如β-半乳糖苷酶，T7聚合酶、色氨酸E等基因的来自如E.coli，枯草芽孢杆菌，啤酒糖酵母等细菌及酵母宿主的区域。
大部分构建体包含在植物中有功能的调节区以提供植物DAGAT的修饰产生，并可能修饰脂肪酸组合物。编码植物DAGAT或其功能片段的开放读框将在其5’末端与转录起始调节区连接。在需要在植物宿主中表达DAGAT蛋白质的实施方案中，需要应用全部或部分完整植物DAGAT基因；也就是全部或部分5’上游编码区(启动子)及结构基因序列及3’下游非编码区一起应用。
如果需要不同的启动子，如相应于感兴趣植物宿主的天然启动子或修饰的启动子，即具有衍生自一个基因来源的转录起始区和衍生自另一个不同基因来源的翻译起始区，可获得许多提供各种组成型或可调节如可诱导的结构基因功能的转录的转录起始区。相应于如此结构基因的转录/翻译起始区发现紧邻各自起始密码子的5’上游。用于植物的转录起始区是与T-DNA结构基因相关的区域，如对于胭脂氨酸及甘露氨酸合酶，CaMV的19S及35S启动子，及其它植物基因如napin，ACP，SSU，PG，Zein，云扁豆蛋白E等的5’上游区。加强的启动子如双35S也可为DAGAT序列表达所用。在当5’上游非编码区得自其它在种子成熟期间调节的基因的应用中，需要那些在植物胚组织中优先表达，如ACP及napin衍生的转录起始控制区。根据美国申请07/147,781，申请日1/25/88(现美国申请07/550,804，申请日7/9/90)，及美国申请07/494,722，申请日为或大约1990.3.16，发明名称为“在早期种子发育中优先表达的新序列及其相关方法”中的教导，可获得并使用这种“种子特异性启动子”。在种子组织中优选表达的转录起始区，即在植物其它部分中未检测到的转录起始区被认为为TAG修饰所需，以使基因产物的破坏或不利影响降至最低。
同样在本发明的DNA构建体中可提供调节转录终止区。转录终止区可经编码植物DAGAT的DNA序列或衍生自不同基因来源的适当转录终止区如与转录起始区天然相关的转录终止区提供。来源于不同基因来源的转录终止区，其含有至少大约0.5kb，优选1-3kb终止衍生自其中的结构基因的3’序列。
具有植物DAGAT作为相应DNA序列以提高或降低其表达的植物表达或转录构建体可与各种植物尤其是参与供食用或工业用的植物油生产中的植物一起应用。尤为优选的是温带油料种子作物。相应植物包括但不限于油菜籽(Canola和高芥子酸变种)，向日葵，红花，棉花，大豆，花生，椰子及油棕榈及玉米。根据将重组构建体导入宿主细胞的方法，可需要其它DNA序列。重要地，本发明可应用于双子叶及单子叶物种，并将易用于新的和/或改进的转化及调节技术。
尤为感兴趣的是植物DAGAT构建体在已遗传工程化的植物中的应用以在植物种子油中产生特定脂肪酸，其中工程化物种的未工程化植物种子的TAG中不天然含有特定脂肪酸。这样，植物中新DAGAT的表达可合乎将独特的脂酰基团掺入sn-3位之所需。
本发明DAGAT蛋白之进一步植物遗传工程化应用包括其在制备含具有掺入TAG分子上特定位置的所需要的脂酰基团的TAG分子的结构植物脂类中的应用。
获得如此转基因植物的转化方法不是本发明之关键，且各种植物转化方法是普遍适用的。进一步地，由于较新方法为转化作物所适用，它们也可直接在后文应用。例如，许多对农杆菌感染天然易感的植物物种可经农杆菌介导的转化的三元或二元载体法有效转化。在许多情况中，需要使构建体由T-DNA位于其一侧或两侧，尤其具有左及右边界，更优选右边界。这在当构建体用根癌农杆菌或毛根农杆菌作为转化方式时尤为有效，尽管T-DNA边界可发现与其它转化方式一起应用。另外，已开发了能转化各种单子叶及双子叶植物物种的微注射，DNA粒子轰击及电穿孔技术。
通常DNA构建体包括具有在宿主中表达必需的调节区及提供转化细胞选择性的结构基因。此基因可提供对胞毒剂如抗生素、重金属、毒素等的抗性，补充提供对营养缺陷型宿主的原养性、病毒免疫性等。根据表达构建体或其组分被导入的不同宿主物种，可应用一个或多个标记，其中不同宿主使用不同选择条件。
在农杆菌用于植物细胞转化时，可使用载体，其可被导入农杆菌宿主以与农杆菌宿主中存在的T-DNA或Ti-或Ri-质粒同源重组。含有用于重组的T-DNA的Ti-或Ri-质粒可以是有致瘤性的(能形成菌瘿)或无致瘤性的(不能形成菌瘿)，只要vir基因在转化的农杆菌宿主中存在后者是容许的。有致瘤性的质粒可提供正常植物细胞与菌瘿的混合物。
在一些农杆菌被用作转化宿主植物细胞的载体的情况中，由T-DNA边界区界定的表达或转录构建体将被插入能在E.coli及农杆菌中复制的广泛范围宿主的载体中，此广泛范围宿主的载体见文献所述。通常应用的是pRK2或其衍生物。如见并入参考的Ditta，et.al.，(Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A(1980)777347-7351)及EPA0120515。或者可将欲在植物细胞中表达的序列插入含分离的复制序列的载体中，其一使载体在E.coli中稳定，另一个使载体在农杆菌中稳定。参见McBride andSummerfelt(Plant Mol.Biol.(1990)14269-276)，其中pRiHRI复制起点(Jouanin et al.，Mol.Gen.Genet.(1985)201370-374)被用于提供植物表达载体在宿主农杆菌细胞中增加的稳定性。
包含于表达构建体及T-DNA内是一个或多个标记，其用于转化的农杆菌及转化的植物细胞的选择。许多标记已研制出用于植物细胞，如对氯霉素、卡那霉素、氨基糖苷G418，潮霉素等的抗性。应用的特定标记非本发明关键的，根据特定宿主及构建方式可优选一个或另一个标记。
为应用农杆菌转化植物细胞，外植体可与转化的农杆菌合并温育足够时间以转化，细菌被杀死，并将植物细胞在适当的选择培养基中培养。一旦形成愈伤组织，根据已知方法通过应用适当植物激素促进枝条形成，并将枝条转移至生根培养基以再生植物。然后将此植物培养结种，并将种子用于复制后代及并分离植物油。
至此对本发明做了一般阐述，经以下实施例将更易于了解本发明，实施例只是举例说明而非限制本发明。
实施例1-蜡合酶分析以下所述为分析在微粒体膜制备物或溶解的蛋白质制备物中蜡合酶活性的方法。
A.放射标记材料通常用于蜡合酶分析的底物[1-14C]棕榈酰辅酶A购自Amersham(Arlington Heights，IL)。其它链长底物是合成的以进行链长特异性研究。通过[14C]氰化钾与相应醇甲磺酰酯反应，随后经醇腈碱水解成游离脂肪酸而制备长链[1-14C]脂肪酸(比活性51-56 Ci/mole)，即11-顺二十碳烯酸，13-顺-二十二碳烯酸及15-顺-二十四碳烯酸。用醚重氮甲烷将游离脂肪酸转变为其甲酯，并经制备硝酸银薄层层析(TLC)纯化。此脂肪酸甲酯后被水解为游离脂肪酸。放射化学品纯度经三种TLC方法评价标准相二氧化硅TLC，硝酸银TLC，及C18反相TLC。由这些方法测定的放射化学品纯度为92-98％。用Young及Lynen的方法(J.Bio.Chem(1969)244377)从相应的[1-14C]游离脂肪酸制备比活性为10Ci/mole的长链[1-14C]酰基辅酶A。根据Pletcher及Tate方法的微量修饰法(Tet.Lett.(1978)1601-1602)，经[1-14C]十六-1-醇的重铬酸盐氧化制备[1-14C]十六醛。经制备二氧化硅TLC纯化产物，并在-70℃以己烷溶液贮存至应用。
B.微粒体膜制备物中蜡合酶活性分析微粒体膜制备物中蜡合酶活性经将40μM[1-14C]酰基辅酶A(通常为棕榈酰辅酶A，比活5.1-5.6mCi/mmol)及200mM油醇与待分析的样品以总体积0.25ml温育测定。该温育混合物还含有25mM HEPES(4-[2-羟乙基]-1-哌嗪乙烷磺酸)，pH7.5，与20％w/v甘油，1mMDTT，0.5M NaCl作为缓冲剂，或含有25mM Tricine-NaOH，pH7.8与0.28M NaCl，10％甘油及2mM β-巯基乙醇作为缓冲剂。当pH选择适应调节酰基辅酶A还原酶时，起始研究用第一个缓冲系进行。稍后将膜制备物用第二种缓冲系变换以适合蜡合酶的较高pH。
在玻璃小瓶中制备底物混合物，在即将使用前加入油醇，并加入样品中。在30℃进行温育近一小时。将分析管置于冰上并立即加入0.25ml异丙醇∶乙酸(4∶1v/v)而终止分析。加入未标记的蜡酯(0.1mg)及油醇(0.1mg)作为载体。经Hara及Radin的缩减方案(Anal.Biochem.(1978)90420)提取[14C]脂。将2ml己烷/异丙醇(3∶2，v/v)加入终止的分析中。将样品涡旋，并加入1ml硫酸钠水溶液(6.6％w/v)，并将样品再涡旋。
C.溶解的蜡合酶活性分析溶解的蜡合酶分析是应用近50μl样品在250μl含40μM 1-14C-160辅酶A(5Ci/mol)，200μM 181-OH，0.07％大豆磷脂(Sigma，P-3644)，0.2％CHAPS，280mM NaCl，25mM Tricine-NaOH，pH7.8，2mM β-ME及5.6％甘油的分析液中进行。将磷脂(50mg/ml在0.5％CHAPS中)直接加入在1％CHAPS中的样品中，然后经含剩余分析组分的混合物稀释。在蜡合酶掺入磷脂载体的基础上推定重建活性。蜡合酶对去污剂敏感，并要求磷脂(PL)及去污剂(CHAPS)的量在分析中平衡在2.8/1(CHAPS/PL，W/W)以使活性最大。经超滤浓缩的样品中蜡合酶活性分析由于CHAPS的浓度而需重新校正分析样品的体积。在分析中导入太多CHAPS导致活性的抑制。如果样品经超滤而浓缩，被分析样品的最佳体积可经用少量样品在分析中进行％CHAPS的浓度曲线，并在固定浓度的磷脂及NaCl分析而再确立。蜡合酶对PL浓度变化比对CHAPS浓度变化的敏感性低。
D.分析产物的分析为分析微粒体膜制备物蜡合酶分析或溶解的蜡合酶分析的产物，已研制出二种方案。其一，下述为“深入分析”是较费时的，但产生更定量的结果。另一下述为“快速分析”也提供蜡合酶活性的测定，但较迅速，更便利但定量性较差。
1.深入分析在加入硫酸钠及将样品涡旋后，移出上层有机相并用4ml己烷/异丙醇(7∶2v/v)洗下层水相。将有机相合并且在氮气下蒸发至干燥。将脂类残余物在小体积己烷中再悬浮，并经液闪计数分析一等份的放射性。剩余样品可用于标记类的TLC分析，从而提供产生的总蜡的测定值。
为脂类分析，将样品施用于二氧化硅TLC平板，并将此平板在己烷/二乙醚/甲酸(80∶20∶1或70∶30∶2 v/v/v)中展开。用AMBIS放射分析显象系统(AMBIS Systems Inc.，San Diego，CA)测定脂类，主要是蜡酯，游离脂肪酸，脂肪醇及极性脂之间放射性的分布。如果需要，可从TLC平板中回收单独的脂类进一步分析。使用在甲醇中展开的C18平板的反相TLC系统也已用于此分析。
2、快速分析在加入硫酸钠并将样品涡旋后，移出已知百分比的有机相，并经液体闪烁计数仪计数。此计算结果用于估计有机相中总计数。然后移出有机相另一部分，在氮气中干燥，再溶解于已烷并点滴在TLC平板上，展开，如以上所述分析进行扫描。在此方式中可检测掺入蜡中的总计数的百分率。
实施例2蜡合酶活性鉴定的进一步研究A.种子发育及蜡合酶活性曲线在Davis，CA，跟踪调查二个夏季5个植物中胚胎发育。发现胚胎的鲜重与干重从大约80天至130天以相当稳定比率提高。当胚胎鲜重达到大约300mg(大约80天)时提取脂类呈现出脂重与干重的比率达到50％最高水平。
如实施例1B所述在发育的胚胎中测定蜡合酶活性。由于jojoba种子被膜已确定是抑制因子的来源，因而在液氮中冷冻胚胎以在-70℃贮存之前除去种子被膜。
蜡合酶活性的发育曲线在无细胞匀浆或膜组分中测定，表明在开花后大约110～115天诱导活性最高。进行酶学研究的胚胎在开花后大约90～110天之间收获，此阶段蜡合酶活性较高，脂类沉积未达到最高水平，且种子被膜易于除去。在开花后80～90天之间可见蜡合酶活性增高的最快速率。用于cDNA文库构建的胚胎是在当蜡合酶蛋白质的合酶速率可能最快时的开花后80～80天之间收获。相应地，编码蜡合酶的mRNA的水平在此时期可能最高。
B.微粒体膜制备物在开花后大约90～110天收获jojoba胚胎，测胚胎水含量(45～70％)。除去外壳及种子被膜，在液氮中迅速冷冻子叶并在-70℃贮存至进一步应用。为起始蛋白质制备，将冷冻子叶在钢研钵及研杵中在液氮温度捣碎而成粉末。在一典型实验中，加工70g胚胎。
将粉末以每70g胚胎280ml溶液的比率加入以下高盐溶液中3MNaCl，0.3M蔗糖，100mM HEPES，2mM DTT，及蛋白酶抑制剂，1mMEDTA，0.7mg/ml亮抑蛋白酶肽，0.5mg/ml胃酶抑制剂及17mg/mlPMSF。将粉末胚胎用组织匀浆机(Kinematica，瑞士；model PT 10/35)在缓冲液中分散大约30秒而形成无细胞匀浆(CFH)，然后经Miracloth三层过滤(CalBioChem，La Jolla，CA.)。将滤液以100,000xg离心1小时。
所得样品由粒状沉淀、上清液及漂浮脂肪层组成。除去脂肪层并收集上清液组分，用含1M NaCl，100mM HEPES，2mM DTT及0.5MEDTA的缓冲液透析一夜(换三次缓冲液)。将透析液以200,000xg离心1.5小时以产生粒状沉淀物，DP2。将此粒状沉淀以1/20初始CFH体积悬浮在25mM HEPES及10％甘油中，以产生微粒体膜制备物。
如实施例1所述分析活性。蜡合酶活性在无细胞匀浆中恢复至起始活性的34％。在此制备物中蜡合酶活性当以-70℃贮存时是稳定的。
C.底物特异性将具有不同碳链长度和不饱和度的酰基CoA及醇底物加入如上所述制备的微粒体膜制备物中，以检测由jojoba蜡合酶识别的底物范围，如实施例1B所述测蜡合酶活性，用80mM酰基辅酶A底物及100mM放射标记的油醇测酰基特异性。用100mM醇底物及40mM放射标记的二十碳烯酰辅酶A测醇特异性。这些实验结果示于下表1。
表1酰基及醇底物特异性底物蜡合酶活性(pmoles/min)结构酰基基团 醇基120 12 100140 95 145160 81 107180 51 56200 49 21220 46 17181 22 110182 7 123201 122 72221 39 41241 35 24上述结果表明jojoba蜡合酶可利用众多脂酰辅酶A及脂肪醇底物。
另外，对各种酰基硫酯底物的蜡合酶活性用作为酰基底物的棕榈酰辅酶A，棕榈酰ACP及N-乙酰-S-棕榈酰半胱胺测试，用酰基辅酶A底物观测到最大活性。用酰基ACP观测到明显的活性(为用酰基辅酶A的10％)，而用N-乙酰-S-棕榈酰半胱胺底物未检测到活性。
D.活性的效应子根据对蜡合酶活性的影响筛选各种巯基制剂。有机汞化合物示出明显抑制活性。碘乙酰胺及N-乙基马来酰胺效果较差。观测到对羟基汞苯甲酸酯的抑制，但此抑制可经随后加入DTT而逆转。这些结果表明对羟基汞苯甲酸酯的抑制涉及对关键的巯基基团的封闭。
实施例3jojoba蜡合酶的纯化以下所述的是用于具有蜡合酶活性的jojoba膜制备物的分离、蜡合酶活性的溶解，及蜡合酶蛋白质的进一步纯化的方法。
A.微粒体膜制备物应用实施例2所述方法经如下修饰的方法以提供用于从溶解的膜中纯化的蜡合酶的改良膜组分。
典型地，将100g jojoba胚胎加入400ml提取缓冲液中(40mMTricine-NaOH，pH7.8，200mM KCl，10mM EDTA，5mM β-巯基乙醇)，在捣碎机中磨碎，并用Polytron组织破坏机匀浆。在4℃进行所有接下来的步骤。将捣碎物经Miracloth(CalBioChem)过滤。以20,000xg，20min离心滤液产生漂浮蜡层，混浊的上清液及黑绿色粒状沉淀。收集上清组分并离心(100,000xg，2h)以获得膜粒状沉淀，然后将其再悬浮于含50％(w/v)蔗糖的40ml缓冲液A(25mM Tricine-NaOH，pH7.8，200mM KCl，5mM EDTA，5mM β-巯基乙醇)中，这一匀浆分至4个SW28离心管(Beckman)中，每个管用10ml含20％蔗糖的缓冲液A，然后用13ml缓冲液A覆盖。离心后(28,000rpm，2h)，从20％/50％蔗糖界面中收集膜组分，用4体积缓冲液A稀释，并经离心(200,000xg，1h)收集，然后将膜在10ml贮藏缓冲液[25mMTricine-NaOH，pH7.8，1M NaCl，10％(w/v)甘油，5mM β-巯基乙醇)]中匀浆。经此方案制备的膜的蛋白质浓度典型地在7-9mg/ml之间。如Bradford，1976所述用BSA作蛋白质标准估计蛋白质浓度。
B.蜡合酶蛋白的溶解用贮藏缓冲液(25mM Tricine-NaOH，pH7.8，1M NaCl，10％甘油，5mM β-巯基乙醇)稀释，将膜悬浮液调节至大约0.83mg蛋白质/ml。加入固体3-([3-胆酰氨丙基]-二甲铵)-1-丙磺酸(CHAPS)使终浓度为2％(w/v)及去污剂与蛋白质比率为24∶1。在冰上温育1小时后，将样品离心(200,000xg，1h)，并收集上清液组分。
C.蜡合酶活性的纯化将此200,000g上清液组分稀释(用0.57％CHAPS，25mMTricine-NaOH，pH7.8，20％甘油)，以使NaCl与CHAPS终浓度分别为0.3M及1％。将样品在已用含0.3M NaCl的缓冲液B(25mMTricine-NaOH，pH7.8，1％CHAPS，20％甘油)平衡的BlueA-琼脂糖(Amicon，Ine.，Beverly，MA)柱中上样。在用平衡缓冲液洗后，用含2M NaCl的缓冲液B洗脱蜡合醋活性。将洗脱自BlueA柱的活性组分合并(BluePool)并用于进一步层析。
有两种纯化方案用于蜡合酶蛋白的条带鉴别及进一步纯化。在方案1(图1)中，将Blue Pool在配有YM30膜(Amicon，Inc.，Beverly，MA)的压力容器中经超滤浓缩5.4倍。将浓缩物的一半加至在含2M NaCl的缓冲液B中平衡的陶瓷羟磷灰石(CHT)柱(Bio-Scale CHT-2；Bio-Rad，Hercules，CA)。用6柱体积的平衡缓冲液洗柱，并用含0.1M磷酸氢二钾及2M NaCl的缓冲液B洗脱结合蛋白。在CHT柱的再平衡之后，将另一半Blue Pool浓缩物以相同方式层析。为检测活性，根据用于超滤浓缩的样品的方案分析蜡合酶。在CHT-Run1中测定的蜡合酶活性在流过液及洗涤液中发现。两个CHT的蛋白质的曲线是相同的，因而CHT-Run2不再分析。将两个CHT-Run的活性组分合并并浓缩10倍，并加至在含1.0MNaCl的缓冲液B中平衡的SephacrylS100HR柱(2.5×90cm)。进行蛋白质及活性检测，并从层析保留部分中选择活性最大蛋白质最少的活性组分。将S100 pool(组分号64-70)加至在含1M NaCl的缓冲液B中平衡的结晶体羟磷灰石(HA)柱(Bio-Gel HT；Bio-Rad，Hercules，CA，1×19.3cm)。同样蜡合酶活性的主要部分在流经液及冲洗液中。用含0.1M磷酸二氢钾及1M NaCl的缓冲液B洗脱结合蛋白。经SDS-DAGE检验终HA柱的组分。在SDS-PAGE上以33kD迁移的单一蛋白质与蜡合酶活性的存在相关。
在第二种制备中(方案2，图2)，将Blue Pool不经浓缩直接加至在含1M NaCl缓冲液中平衡的结晶羟磷灰石(HA)柱(1×11.7cm)。选择两种组分以在用25mM Tricine-NaOH，pH7.8，1M NaCl，1％CHAPS，20％甘油，1M NaCl平衡的Superdex 75HR 10/30柱(B-Rad，Hercles，CA；大小范围5000～75000D)上经大小排阻层析进一步纯化。根据实施例1C所述用于溶解的样品的方案测蜡合酶活性。一种组分在流经HA柱时较早洗脱(组分31)，另一种在冲洗时洗脱(组分67)。基于SDS-PAGE分析，两种组分的蛋白质曲线不同。经梯度SDS-PAGE检验这两个Superdex75，大约33kD的蛋白质被鉴别层析具有活性。用在相同缓冲液及柱条件下层析的分子量标准产生校正曲线。对比峰值蜡合酶活性的洗脱体积与此标准曲线得出溶解的酶的48kDa分子量。
代表方案1蜡合酶纯化的表(表2)示出从溶解的蛋白质组分中酶的150倍纯化。
表2 jojoba蜡合酶的纯化
D.SDS-DAGE分析将取自柱组分的样品在SDS-PAGE样品缓冲液(1×缓冲液＝2％SDS，250mM β-巯基惭醇0.0025％溴酚Blue)中稀释，并经电泳分析。根据Laemmli之方法(Nature(1970)227680-685)加以如Delepelaire(Proc.Nat.Acad.Sci.(1979)76111-115)做某些修改来进行聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(10-13％)。将十二烷基硫酸钠以0.1％用于上层液槽缓冲液，但下层液槽缓冲液中不用，堆积及分离凝胶。此堆积凝胶含有5％的30％丙烯酰胺贮存液(29.2％丙烯酰胺，0.8％N，N’-双亚甲基丙烯酰胺，w/v)，0.06％过硫酸铵(w/v)及0.1％TEMED(v/v)。分离胶含有由0-10％蔗糖线性梯度稳定的丙烯酰胺贮存液的10-13％线性梯度。在室温150V恒压进行电泳9-10小时。根据如Blum等(Electrophoresis(1987)893-99的方法用银或用CoomassieBlue(0.1％Coomassie Blue R-250，50％甲醇，10％甲酸)染色将蛋白质显色。鉴定为蜡合酶的33kDa蛋白质未作为活性组分的主要成分显现直至经羟磷灰石柱纯化。经方案1纯化后(实施例3C)，与终柱上活性有关的蛋白质仅是33kDa的蛋白质。
实施例4，制备jojoba蜡合酶蛋白用于凝胶内消化A、经浓缩制备SDS-PAGE样品将终HA柱(方案1)的流经/冲洗的奇数组分合并并在装备YM30膜(Amicon，Inc.，Beverly，MA)的压力池中经超滤而浓缩3倍。将样品用2个Centricon-30元件(Amicon，Inc.，Beverly，MA)进一步浓缩为大约50μl体积。将每个样品用6μlSDS混合物(4μl 20％SDS，1μl 14.3M β-巯基乙醇，1μl 0.1％溴酚蓝)处理。在置于室温15分钟后，将样品加至10-13％丙烯酰胺梯度凝胶中(实施例3D)(16×16cm×1mm厚度)，并将蛋白质在150v，恒压电泳9.5小时。将凝胶在50％甲醇，10％乙酸中用0.1％Coomassie Blue染色15分钟，然后在50％甲醇10％乙酸中脱色2×20分钟。将33kDa蜡合酶条带从凝胶中切下，并在50％乙醇中脱色3×20分钟。一个泳道含有一系列蛋白质，而不用于终消化。
B.经沉淀制备SDS-PAGE样品将终HA柱(方案1)的偶数组分的等份(0.8ml)合并为3组。将合并等份均分入3个1.5ml小瓶中。加入0.2ml 40％TCA将蛋白质沉淀。置于冰上30分钟后，将样品离心(12,000×g，15分钟，4℃)以沉淀蛋白质。除去上清液，并用0.6ml冰冷丙酮将粒状沉淀冲洗二次。将每个集合样品的最终3份粒状沉淀用同一50μl SDS样品缓冲液经将缓冲液从一个小瓶转移至另一个小瓶而重悬浮。将已重悬浮的空的小瓶用10μl样品缓冲液冲洗，使每个集合样品的总重悬浮体积为60μl。将样品加至12％丙烯酰胺Tris/甘氨酸微胶中(Novex，SanDiego，cA，1.5mm×10孔)，在150V，恒压电泳20分钟直至染料从凝胶底部洗脱，从而分离蛋白质。此凝胶用Coomassie Blue染色并用Gel-Clear(Novex，San Diego，CA)脱色。将蜡合酶从代表柱中峰值及拖尾组分的凝胶上的三个非等价泳道中切下。将凝胶切片置于1.5ml小瓶中并用1ml 50％甲醇，10％乙酸脱色2小时。除去脱色溶液，并将凝胶切片在液氮中冷冻，置于干冰上一夜，以在耶鲁大学的W.MKeck Foundation Biotechnology Resouce Laboratory进行凝胶内消化。将一个得自经超滤浓缩的样品的凝胶切片和3个得自经沉淀浓缩的样品的凝胶切片合并，以进行凝胶内胰酶消化。
实施例5氨基酸序列的测定在耶鲁大学W.M Keck Foundation Biotechnology ResourceLaboratory进行蛋白质测序。其程序包括对一部分(10-15％)凝胶切片进行定量及氨基酸成分的分析，用一种蛋白酶(胰蛋白酶或赖氨酰内肽酶)消化蛋白质，及经反相HPLC分级分离产物。从HPLC选择吸收峰，并进行激光解吸质谱以在蛋白质测序前确定肽的存在、数量及质量。选择最长的肽进行微量测序。
经胰蛋白酶消化而得的jojoba蜡合酶肽的氨基酸序列在下表3中以单字母代码代表。
表3 Jojoba蜡合酶胰酶化肽的氨基酸序列WSpep 29 FVPAVApHGGALRWSpep 33 TIDEYPVMFNYTQK以下阐述从cDNA文库或从基因组DNA中分离蜡合酶核酸序列。
A Jojoba cDNA文库的构建应用初始由Jackson及Larkins(Plant Physiol.(1976)575-10)所述，并由Goldberg等(Developmental Biol.(1981)83201-217)加以修改之多核糖体分离法，在开花后80-90天收集的jojoba胚胎中分离RNA。在此程序所有步骤中，除非特别阐明均在4℃进行。将10gm组织在Waring研钵中在液氮下研磨直至组织成为精制粉末。在液氮蒸发后，加入170ml提取缓冲液(200mM Tris pH9.0，160mM KCl，25mM EGTA，70mM MgCl2，1％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，1M亚精胺，10mM β-巯基乙醇及500mM蔗糖)，并将组织匀浆大约2分钟。将匀浆经无菌miracloth过滤并以12,000×g离心20分钟。将上清液倾入500ml无菌烧瓶，并在室温加入1/19体积的20％去污剂溶液(20％Brij35，20％Tween40，20％Noidet p-40w/v)。将此溶液以中等速度在4℃搅拌30分钟，然后将上清液以12,000×g离心30分钟。
将大约30ml上清液等分入无菌Ti60离心管中，并用含40mM TrispH9.0，5mM EGTA，200mM KCl，30mM MgCl2，1.8M蔗糖，5mM β-巯基乙醇的7ml的溶液垫底。用提取缓冲液将管填满，并在Ti60转子中以60,000rpm在4℃旋转4小时。离心之后，吸出上清液并在每个管中加入0.5ml重悬浮缓冲液(40mM Tris pH9.0，5mM EGTA，200mM KCl，30mM MgCl2，5mMβ-巯基乙醇)。将管置于冰上10分钟后，将粒状沉淀充分重悬浮并集合。然后将上清液以120×g离心10分钟以除去不溶物。在上清液中加入1体积的在20mM Tris pH7.6，200mM EDTA，2％N-十二烷基-肌氨酸盐中的1mg/ml自消化的蛋白酶K，并将混合物在室温温育30分钟。
加入1/10体积的乙酸钠及2体积的乙醇沉淀RNA。在20℃几个小时之后，RNA在12,000×g，4℃离心30分钟而粒状沉淀。将此粒状沉淀重悬浮于10mlTE缓冲液中(10mM Tris，1mM EDTA)，并用等体积Tris pH7.5饱和的苯酚提取。在10,000×g4℃离心20分钟以分离各相。取出水相，并将有机相用1体积TE缓冲液再抽提。然后合并水相并用1体积氯仿提取。经离心再分离各相并如上述将水相用乙醇沉淀以获得多核糖体RNA。
多核糖体RNA制备物中的多糖杂质经将RNA经过高盐缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris pH7.5，1mM EDTA，0.1％SDS)中的纤维素柱(Sigma-cell 50)除去。杂质与柱结合，在洗脱液中收集RNA。将洗脱液组分合并并将RNA用乙醇沉淀。然后将沉淀的总RNA以较小体积重悬浮并应用于寡脱氧胸苷纤维素柱以分离聚腺苷酸化RNA。
聚腺苷酸化RNA用于在衍生自商购克隆载体Bluescribe M13-(Stratagene Cloning Systems；San Diego，CA)并如下制备的的质粒克隆载体pCGN1703中构建cDNA文库。将Bluescribe M13-的多接头经用Bam HI消化，绿豆核酸酶处理及平端连接而改变以产生Bam HI缺失的质粒，pCGN1700。将pCGN1700用EcoRI及SstI(相邻限制位点)消化，并与具有BamHI，PstI，XbaI，ApaI及SmaI限制位点，AATT的5’突出端及TCGA的3’突出端的合成接头退火。接头插入pCGN1700可消除EcoRI位点，再产生发现于Bluescribe内的SstI(有时在本文也指作“SacI”)位点，并加入在接头上所含的新限制位点。将所得质粒pCGN1702用HindIII消化并用Klenow酶平端化；将线性DNA用PvuII部分消化并在稀释液中与T4DNA蜡合酶连接。选择具有Lac启动子区缺失的转化子并用作质粒克隆载体。
以下概括地阐述用于cDNA合成的克隆法。将质粒克隆载体用SstI消化，并用末端脱氧核苷酸转移酶在所得3’突出端粘端产生同聚体T-加尾，经寡(dA)-纤维素层析将加尾质粒从未消化或未加尾质粒中分离。所得载体作为引物合成cDNA第一条链其与载体质粒的任一末端共价结合。将cDNA-mRNA-载体复合物在脱氧鸟苷三磷酸存在下用末端转移酶处理，在cDNA链末端产生G-加尾。将与BamHI位点相邻的额外cDNA-mRNA复合物经BamHI消化除去，得到在一个末端具有BamHI粘端及另一末端具有G-加尾的cDNA-mRNA-载体复合物。将此复合物用具有5’BamHI粘端，限制性酶NotI，EcoRI及SstI识别序列，及3’C-加尾末端的退火的合成环化接头环化。连接及修复后，将环形复合物转化入E.coli菌株DH5a(BRL，Gaithersburg，MD)中以产生cDNA文库。jojoba胚胎cDNA库含有具有大约500碱基对的平均cDNA插入大小的约1.5×106个克隆。
另外，jojoba聚腺苷酸化RNA也用于在克隆载体1ZAPII/EcoRI(Stratagene，San Diego，CA)中构建cDNA文库。用厂商提供的方案，DNA及细菌菌株构建文库。根据厂商推荐用Gigapack Gold包装提取物(Stratagene)包装克隆。以此方式构建的cDNA文库含有具有大约400碱基对的平均cDNA插入大小的大约1×106克隆。
B.合成寡核苷酸通常，为了用作从mRNA逆转录的单链DNA模板的PCR引物，制备含有相应于蜡合酶肽编码序列的有义取向序列的寡核苷酸。这些寡核苷酸用作“正向”扩增反应引物以产生有义链DNA。
对于非编码DNA链扩增的“反向”扩增反应，寡核苷酸可被设计成等同于用于制备用于PCR的DNA模板的引物的一部分。或者，含有互补于蜡合酶肽编码序列的序列的寡核苷酸可以与上述“正向”蜡合酶寡核苷酸引物组合应用。
当蜡合酶肽序列含有可由各种不同密码子编码的氨基酸时，正向或反向引物可以是“简并”寡核苷酸，即含有针对特定肽区域的所有或一些可能的编码序列的混合物。为在此混合物中减少各种寡核苷酸存在量，当制备用于PCR引物的合成寡核苷酸时优选选择具有最少量可能编码序列的肽区域。相似地，当合成寡核苷酸直接用于筛选蜡合酶序列文库时，优选较低简并的寡核苷酸。
以下是肽WSpep29(中行)的序列及可编码WSpep29肽的正向(上行)及反向(下行)DNA序列的例子。
5’TTY GTN CCN GCN GTN GCN CCN CAY GGN GGN GCN YTN MGN 3’F V P A V A P H G G A L R3’AAR CAN GGN CGN CAN CGN GGN GTR CCN CCN CGN RAN KCN 5’以下是肽WSpep33(中行)的序列及可编码肽WSpep33的正向(上行)及反向(下行)DNA序列的例子。5’ACN ATH GAY GAR TAY CCN GTN ATG TTY AAY TAY CAN CAR AAR 3′T I D E Y P V M F N Y T Q K3’TGN TAD CTR CTY ATR GGN CAN TAC AAR TTR ATR TGN GTY TTY 5’以下是可用于获得蜡合酶序列的合成寡核苷酸的序列。寡核苷酸名称反映了列于实施例6的特定蜡合酶肽片段数。寡核苷酸名称中字母“F”表示PCR正向反应引物。字母“R”表示PCR反向反应引物。
WSpep29-F1 5’TTYGTNCCNGCNGTNGC3’WSpep29-F2 5’GCNCCNCAYGGNGGNGC3’WSpep29-R1 5’GCNCCNCCRTGNGGNGC3’WSpep29-R2 5’GCNACNGCNGGNACRAA3’WSpep33-F1 5’ACNATHGAYGARTAYCCNGT3’WSpep33-F2 5’CCNGTNATGTTYAAYTAYAC3’WSpep33-R1 5’TTYTGNGTRTARTTRAACAT3’WSpep33-R2 5’AACATNACNGGRTAYTCRTC3’寡核苷酸TSYN用于从聚(A)+或总RNA中逆转录以制备用作PCR模板的单链DNA。除了用于与mRNA聚(A)尾结合的聚(T)区之外，该寡核苷酸还含有HindIII，PstI及SstI的限制性消化序列。TSYN的序列如下TSYN5’CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT3’寡核苷酸TAMP用于蜡合酶编码序列的反义链的PCR扩增的反向反应。应注意当PCR模板是逆转录自mRNA的单链DNA时，反向反应将不发生直至第一个正向反应结束。第一个链反应导致有义链模板的产生，其然后被用于从反向引物扩增反义DNA链。TAMP的序列如下TAMP5’CCAAGCTTCTGCAGGAGCTC 3’以下是根据IUPAC标准，上述寡核苷酸的核苷酸碱基代码。
A＝腺嘌呤，T＝胸腺嘧啶 Y＝胞嘧啶或胸腺嘧啶
C＝胞嘧啶，U＝尿嘧啶 R＝腺嘌呤或鸟嘌呤G＝鸟嘌呤，I＝肌苷， O＝肌苷或胞嘧啶H＝腺嘌呤，胞嘧啶或胸腺嘧啶D＝腺嘌呤，鸟嘌呤或胸腺嘧啶N＝腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤或胸腺嘧啶W＝腺嘌呤或胸腺嘧啶S＝鸟嘌呤或胞嘧啶B＝鸟嘌呤，胞嘧啶或胸腺嘧啶K＝鸟嘌呤或胸腺嘧啶M＝腺嘌呤或胞嘧啶C.PCR反应聚(A)+RNA分离自如上述从jojoba组织中制备的总RNA。用Superscript逆转录酶(BRL)及用TSYN作为寡核苷酸引物经逆转录从聚(A)+或总RNA中制备单链cDNA。根据厂商指示，除反应是在45℃而不是37℃进行之外，进行反应。jojoba单链cDNA用于下述PCR反应1-12。
用逆转录的单链cDNA做模板在Perkin Elmer Cetus GeneAmp PCRSystem 9600PCR仪中进行PCR。根据生产者说明书使用可商购PCR反应及优化试剂。位于引物3’位的cDNA部分可在以下反应中扩增反应 正向引物 反向引物1 WSpep29-F1 TAMP2 WSpep29-F2 TAMP3 WSpep33-F1 TAMP4 WSpep33-F2 TAMP5 WSpep29-F1 WSpep33-R16 WSpep29-F2 WSpep33-R17 WSpep33-F1 WSpep29-R18 WSpep33-F2 WSpep29-R2
9 WSpep29-F1 WSpep33-R210 WSpep29-F2 WSpep33-R211 WSpep33-F1 WSpep29-R212 WSpep33-F2 WSpep33-R2如果需要另外扩增，含有标为F1引物的反应的PCR产物可用作模板用标为F2的引物进行PCR反应的第二轮循环。相似地，含标为R1的引物的反应的PCR产物可用作模板用标为R2的引物进行PCR反应的第二轮循环。
或者，根据生产者的指示利用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboraties Inc.)用5’及3’RACE(Frohman et al.，1988)可以扩增全部cDNA。引物WSpep29-F1，WSpep29-F1，WSpep33-F1及WSpep33-F2被用于3’RACE反应。引物WSpep-R1，WSpep29-R1，WSpep33-R1及WSpep33-R2被用于5’RACE反应。
根据生产者之方案(Invitrogen Corp.)PCR反应中产生的DNA片段被克隆入pCR2.1。测定克隆片段的DNA序列以证实克隆片段编码蜡合酶肽。
D.蜡合酶序列的筛选文库由PCR而获得的蜡合酶DNA片段被标记，并用作探针以从上述cDNA文库中筛选克隆。本领域已知DNA文库筛选技术，并如Maniatis等所述(Molecular CloningA Laboratory Manual，SecondEdition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。在此方式中，可获得蜡合酶核酸序列，其可被分析并用于在各种原核及真核的宿主中表达蜡合酶。
实施例6-用于植物表达的蜡合酶及还原酶构建体可如下制备提供蜡合酶及还原酶在植物细胞中表达的构建体。
含有来自在种子组织优选表达的基因中的5’及3’调节区的表达盒可从如WO92/03564所述的napin，Bce4及ACP基因中制备。
例如，Kridl等(Seed Science Research(1991)1209-219)阐述了用于蜡合酶及还原酶基因构建体表达的napin表达盒，pCGN1808。另一napin表达盒pCGN3223含有氨苄青霉素抗性背景，以及基本等同于pCGN1808中发现的1.725napin5’及1.265 3’调节序列。此调节区两侧有HindIII，NotI及KpnI限制位点，且单一SalI，BglII，PstI及XhoI克隆位点位于5’及3’非编码区之间。
也可应用在来自油质蛋白基因5’及3’区的控制下的转录调节的序列克隆盒。Brassica napus油质蛋白基因的序列由Lee及Huang(PlantPhys.(1991)961395-1397)报道。油质蛋白盒pCGN7636的序列见USPN5,445,947的图4。油质蛋白盒侧翼为BssHII，KpnI及XbaI限制位点，并含有用于在5’及3’油质蛋白区之间插入蜡合酶，还原酶，或其它的相应DNA序列的SalI，BamHI及PstI位点。
蜡合酶及还原酶基因序列可插入如此盒中以提供用于植物转化法的表达构建体。例如，USPN，5,445,947阐述了利用napin基因中5’及3’调节区在植物细胞中表达还原酶的构建体。
应用Holsters等〔Mol.Gen.Genet(1978)163181-187〕的方法及如下述用于植物转化的方法，将二元载体构建体转化入农杆菌细胞，如EHA101菌株(Hood etal.，J.Bacteriol(1986)1681291-1301)。
实施例7二酰甘油酰基转移酶(DAGAT)分析以拉曼被孢霉为例阐述了分析在非溶解的或溶解的蛋白质制备物中DAGAT活性的方法。
A.非溶解样品类似于Kamisaka等(1993，1994)所述，用在含10mM磷酸钾(pH7.0)，100-150mMKCl及0.1％TX-100(w/v)的缓冲液中的3.67μM 1-14C-181 CoA(53.5～54.5 Ci/mole，New EnglandNuclear，Boston，MA)及1.5mM 1，2-181二酰甘油(DAG)(Sigma D-0138，制备作在2-甲氧乙醇中的150mM储液)以总体积100μl分析DAGAT活性。在30℃进行分析5分钟，并加入1.5ml庚烷∶异丙醇∶0.5M H2SO4(10∶40∶1，v/v/v)以终止。如果需要，在分析前可将样品用缓冲液稀释以在分析期间保持产物产生的线性速率。
B.溶解的样品如对非溶解样品所述加以下列变化进行分析1，2-181 DAG量降至0.5mM，Triton X-100量增至0.2％，KCl浓度保持在100～125mM之间。在如Kamisaka等(1996，1997)所述加以轻微修改之方案用去污剂溶解之后，还需加入L-α-磷脂酸(Sigma P-9511，制备作于1％Triton X-100(w/v)中的50mM储液)以回收活性。我们发现在用Triton X-100处理后应用300μM磷脂酸比用500μM提供更高的DAGAT活性的刺激。我们也发现DAGAT活性对导入分析中的KCl量敏感，最佳水平在100-125mM之间。在30℃进行分析5～30分钟，并如非溶解样品所述终止。
C.样品分析的处理在分析终止后，将它们在4℃贮存以在稍后处理，或加入0.1ml 1MNaHCO3，随后加入1ml含15nmoles/ml三油酸甘油酯的庚烷作为提取载体而立即处理。将内容物涡旋并在分离水相及有机相之后，将上层有机相移至一新玻璃小瓶中并用1ml 1M NaCl洗。移出40％有机相进行液体闪烁计数，并将剩余有机相转移至干净小瓶中，在氮气下蒸干。将残余物重悬浮于45μl己烷，并点滴在具有预吸附加样区的硅胶G，玻璃，薄层层析(TLC)平板上(Analtech #31011，Newark，Delaware)。将TLC平板在己烷∶二乙酯∶乙酸(50∶50∶1，v/v/v)中展开至顶部，然后干燥并用放射显象分析仪(AMBIS 3000，San Diego，CA)扫描，以确定掺入三酰甘油中的放射活性部分。活性以pmole/min为单位报道。
实施例8.拉曼被孢霉培养物的生长与收获将拉曼被孢霉1.5～3×106个孢子接种1升Defined GlucoseMedia(30g葡萄糖，1.5g(NH4)2SO4，3g K2HPO4，0.3g MgSO4·7H2O，0.1g NaCl，5gCH3COONa·3H2O，10mg FeSO4·7H2O，1.2mgCaCl2·2H2O，0.2mg CuSO4·5H2O，1.0mg ZnSO4·7H2O，1.0mgMnCl2·4H2O，2mg硫胺素-HCl及0.02mg生物素在1L经反向渗透纯化的水中(pH5.7))，并在30℃以200rpm振荡9～11天温育而培养。通过一层Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)过滤收获培养物。经手挤压除去过量液体。每升收获的包装细胞的平均产量为22.5g。
实施例9梯度凝胶十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)取自柱组分的样品在SDS-PAGE样品缓冲液中稀释(1×缓冲液＝2％SDS，250mM β-巯基乙醇，0.0025％溴酚Blue)并经电泳分析。根据Laemmli(1970)的方法并加以如Delepelaire的修改进行聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(10-13％)。将十二烷基硫酸钠以0.1％用于上层液槽缓冲液，但不用于下层液槽缓冲液，积层并分离凝胶。积层凝胶含有5％的30％丙烯酰胺原液(丙烯酰胺N，N’-亚甲基丙烯酰胺，37.51，Bio-Rad，Hercules，CA)，0.06％过硫酸铵及0.1％TEMED(v/v)。分离凝胶含有由0-10％蔗糖线性梯度稳定的10-13％丙烯酰胺原液线性梯度。在室温，150V，恒压进行电泳7-9小时。将蛋白质根据Blum等(1987)之方法用银或用Coomassie Blue(0.1％ ComassieBlue R-250，50％甲醇(v/v))，10％乙酸(v/v)染色以显色。
实施例10在从拉曼被孢霉中纯化DAGAT中应用如Kamisaka等(1997)的层析之评价A.脂质小体组分的制备以下步骤在4℃进行。
典型地，将70～75g湿包装细胞(贮存于-70℃)用于每个脂质小体制备物。在即将使用之前将细胞在冰上解冻并重悬浮于150ml缓冲液A中(10mM磷酸钾(pH7.0)，0.15M KCl，0.5M蔗糖及1mMEDTA)。加入以下蛋白酶抑制剂以降低蛋白酶解0.1μM抑蛋白酶肽，1μM亮抑蛋白酶肽，及100μM Pefabloc(所有均来自BoehringerMannheim，Germany)。将细胞分入5个50ml试管，并用Polytron组织匀浆机(Kinematic GmbH，Brinkman Instruments，Switzerland)在具有1cm直经探针的#7座上裂解7×1分钟。将所得匀浆转移至离心管(29×104mm)并经在4℃以1500×g(Beckman Instruments，J2-21，JA-20rotor，3500rpm)旋转10分钟使固体碎渣成粒状沉淀。除去上清液并用另外5ml缓冲液A冲洗粒状沉淀。离心后，将上清液体积组合。此组分指作“S1”。将此S1分入6个超离心管(25×89mm，BeckmanInstruments，Fullerton，CA)，并将两个管用5ml缓冲液B(10mM磷酸钾pH7.0，0.15M KCl，0.3M蔗糖及1mM EDTA)覆盖。将样品以100,000xg(Beckman Instruments，L8-M，SW-28 rotor，21000rpm)在4℃离心3小时。用刮勺回收在覆盖物顶部漂浮的脂质小体组分(LBF)，并转至玻璃匀浆机中(Potter-Elyehjem)。残留在离心管中的少量LBF用移液管经移出4ml缓冲液B覆盖物而回收并将其与匀浆机中LBF合并。将终LBF在40ml缓冲液B中匀浆。如下收集剩余组分界面组分(在0.3-0.5M蔗糖缓冲液间界面)，溶解组分(在界面下液体体积)，及膜组分(在每管底棕褐色/褐色粒状沉淀)。所有组分都被冷冻，并在-70℃贮存等待溶解及进一步纯化。
B.从脂质小体组分中溶解DAGAT活性将LBF在冰上解冻，并经加入Triton X-100(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)从10％(w/v)原液至终浓度为1.3％(w/v)而达到溶解。加入固体蔗糖(Mallinckrodt，Paris，Kentucky)以至终浓度为0.5M。将用去污剂处理的样品在4℃轻摇1小时，然后分入6个超离心管(25×89mm，Beckman Instruments)。每个管用5ml缓冲液B覆盖。将样品以100,000×g(Beckman Instruments，L8-M，SW-28rotor，21000rpm)在4℃离心3小时。将指作“Triton X-100提取物”的溶解物经将一细管透过覆盖物插入距每个超离心管底1cm，并轻吸吸出下层0.5M蔗糖层，同时使上层0.3M蔗糖覆盖物(包括漂浮脂肪层)及其下的粒状沉淀不动而回收。
在如Kamisaka等(1979)所述的方案中，脂质小体组分用0.1％TritonX-100溶解，并在100,000xg进一步离心或经0.2μm滤器过滤。他们发现需提高Triton X-100浓度至1.5％使DAGAT活性与第一个柱结合。
C.用于从拉曼被孢霉中纯化DAGAT的层析用于层析的缓冲液C含有10mM磷酸钾(pH7.0)，0.1％TritonX-100(w/v)(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)，10％甘油(w/v)，0.1μM抑蛋白酶肽，1μM亮抑蛋白酶肽，100μM Pefabloc(均获自Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)及各种量的氯化钾〔75～500mM〕。此缓冲液区别于由Kamisaka等(1997)所用的相应柱缓冲液之处在于其中甘油取代了乙二醇，未加入EDTA，DTT及PMSF，同时加入了抑蛋白酶肽，亮抑蛋白酶肽及Pefabloc。根据Kamisaka等(1997)的方案，制备一Yellow86-琼脂糖柱(Sigma R-8504 St.Louis，MO)(1.5cm×5.8cm)，并用具有150mM KCl的缓冲液C平衡。我们试图在这些条件下将Trrtoin X-100提取物中存在的DAGAT活性与Yellow86-琼脂糖柱结合，但发现大多数DAGAT不能与柱结合。我们通过用等体积缓冲液C(没有KCl)将施加样品的KCl浓度稀释至75mM而能将明显部分的DAGAT活性结合于柱。据此，Yellow86-琼脂糖柱也用具有75mM KCl缓冲液C平衡。以0.56ml/分施加样品之后，将柱用4柱体积的平衡缓冲液冲洗。用含500mM KCl的缓冲液C洗脱与柱结合的DAGAT活性及蛋白质(图4)。
将洗脱自Yellow86-琼脂糖柱的DAGAT活性(17-20组分)用缓冲液C稀释为1∶3.33，以将KCl浓度降至150mM。将此稀释的集合(103ml)以0.2ml/分加至用含150mM KCl缓冲液C平衡的肝素-Sepharose CL-6B柱(Pharmacia，Uppasla，Sweden，0.5cm×4.8cm)。将此柱用5体积平衡缓冲液冲洗，并用15ml含150-500mM KCl线性梯度的缓冲液C洗脱DAGAT活性及蛋白质。DAGAT活性以2个重叠峰洗脱，由Kamisaka等(1997)发现的第一峰在梯度中洗脱，未由Kanisaka等发现的第二个峰在梯度末洗脱，其含较少量的蛋白质(图5A)。
肝素柱两峰值组分的一部分(250μl)以0.2ml/分在用含150mMKCl的缓冲液C平衡的Superdex-200柱中(1×30cm，Bio-Rad，Heraules，CA)经大小排阻层析进一步纯化，仅为校正，将柱用含150mM KCl的修改的缓冲液C平衡，其中Triton X-100R(Calbiochem，LaJolla，CA)代替了Triton X-100，将柱用Bio-Rad凝胶过滤标准校正，以99kDa的估计分子量将DAGAT从肝素Sepharose CL-6B中两个峰的每一个中洗脱。
在含有较高DAGAT比活性的肝素柱的稍后洗脱峰上进行其它层析。在此情况下，将肝素柱的第二个峰(组分36-41)用缓冲液C稀释1∶6.6至46.7ml。将此样品以0.5ml/分加至用含75mM KCl的缓冲液C平衡的Yellow86琼脂糖柱(1.0cm×6.4cm)。在用5柱体积的平衡缓冲液冲洗后，用40ml含75～500mM KCl线性梯度的缓冲液C洗脱结合蛋白质及所有DAGAT活性。DAGAT活性以一个单峰洗脱(图6A)。
含来自肝素及第二个Yellow86柱的DAGAT活性的组分的蛋白质组合物根据实施例3的方案经梯度SDS-DAGE加以分析，蛋白质条带经银染色加以检测。将洗脱自这些柱的条带图以组分对组分与各自DAGAT活性曲线加以比较。存在与DAGAT活性存在相关的许多蛋白质候选物。我们认为纯化方案不足以鉴别与DAGAT活性相关的特定蛋白质候选物(图5B、6B)。
实施例11鉴别纯化自拉曼被孢霉的DAGAT蛋白质候选物的新纯化方案A.制备脂质小体组分以下步骤在4℃进行。
典型地，将70-75g湿包装细胞(贮存在-70℃)用于每个脂质小体制备物。在使用前，将细胞在冰上解冻并重悬浮于150ml缓冲液A中(10mM磷酸钾(pH7.0)，0.15M KCl，0.5M蒸糖，1mM EDTA)。加入以下蛋白酶抑制剂以降低蛋白质水解0.1μM抑蛋白酶肽，1μM亮抑蛋白酶肽和100μM Pefabloc(均得自Boehringer MannheimGermany)。将样品经细胞破碎仪(Bead-Beater，Biospec Products，Bartlesville OK)用0.5mm玻珠裂解。用180ml玻珠填充样品室。将湿包装细胞在冰上解冻并重叠浮于150ml缓冲液A中。将细胞匀浆倾入盖过波珠。通常需加入另外40～50ml缓冲液A充填样品室以起作用。此体积用于将残余细胞匀浆从其初始容器中冲洗出，如此其可与其余样品组合。根据样品的粘度将细胞研磨45～90秒。将含玻珠的细胞匀浆分入管中(29×104mm)，并在4℃以500×g离心(BeckmanInstruments，GP Centrifuge，GH 3.7水平转子，1500rpm)。取出上清液，并用另外5ml缓冲液A冲洗粒状沉淀。离心后组合上清液体积。该组分指作“S1”。将此S1分入6个超离心管(25×89mm BeckmanInstruments)，每个都用5ml修改的缓冲液B(10mM磷酸钾pH7.0，0.15M KCl，0.3M蔗糖)覆盖。EDTA由于其干扰羟磷灰石层析而将其从缓冲液B(见实施例4)中除去。在4℃以100,000×g将样品离心3小时(Beckman，Instruments，L8-M，SW-28 rotor，21000rpm)。用刮勺回收漂浮在覆盖物顶层的脂质小体组分(LBF)，并转至玻璃匀浆机中，用吸管吸出4ml缓冲液B覆盖物并将其与匀浆机中的LBF组合而回收少量残余在离心管中的LBF。将终LBF在40ml缓冲液B中匀浆。收集如下剩余组分，界面组分(0.3和0.5M蔗糖缓冲液间界面)，可溶组分(在界面之下的液体体积)及膜组分(在每管底的棕褐色/褐色粒状沉淀)，将所有组分均冷冻并在-70℃贮存等待溶解及进一步纯化。
B.从脂质小体组分中溶解DAGAT活性在溶解前，用等份脂质小体组分经Bradford(Bio-Rad Reagent，Hercules，CA)的方法用牛血清白蛋白作标准进行蛋白质测定。将LBF在冰上解冻，然后稀释至浓度为1mg蛋白质/ml并用Triton X-100以去污剂与蛋白质比率为15∶1(w/w，相当于1.3％Triton X-100)处理。加入固体蔗糖(Mallinckrodt，Paris，Kentucky)以至终浓度为0.5M。将用去污剂处理的样品在4℃轻摇1小时，然后分入6个超离心管(25×89mm，Beckman Instruments)。每个管用5ml修改的缓冲液B覆盖。将样品以100,000×g(Beckman Instruments，L8-M，SW-28rotor，21000rpm)在4℃离心3小时。将指作“Triton X-100提取物”的溶解物经将一细管透过覆盖物插入距每个超离心管底1cm，并轻吸吸出下层0.5M蔗糖层，同时使上层0.3M蔗糖覆盖物(包括漂浮脂肪层)及其下的粒状沉淀不动而回收。
C.DAGAT柱层析。
将我们从前从植物物种中纯化酰基转移酶蛋白质的经验用于从拉曼被孢霉中纯化DAGAT。我们应用羟磷灰石层析从jojoba中纯化蜡合酶(Simnondsia chinensis，WO Publication 95/15387，全部并入参考)，及从椰子(Cocos nucifera)中纯化溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)(美国专利申请08/231,196，全部并入参考)已获得成功，此纯化步骤在Yellow86琼脂糖柱之后介绍。以两种方式进行Yellow 86-琼脂糖及羟磷灰石纯化方案，在方案A，活性与第一柱结合，并在洗脱后分析组分活性。然后将活性组分集合并用于第二柱。我们将这指作顺序层析。在方案B，活性与第一柱结合，然后洗脱并不集合直接流上第二柱，在此之间分析。我们将之指作串联层析。
在方案A，以2ml/分将Triton X-100提取物加至用含75mM KCl的缓冲液C平衡的Yellow86-琼脂糖柱(2.5cm×6.4cm)(实施例4.C)，用5柱体积的平衡缓冲液冲洗柱，然后用含500mM KCl的缓冲液C以0.5ml/分洗脱(图7)。将含93％洗脱活性的两个最大活性组分(64和65)集合，并以0.5ml/分在用含500mM KCl的缓冲液C平衡的羟磷灰石柱上加样。DAGAT活性流经柱，而多数蛋白质与柱结合。用3柱体积的平衡缓冲液冲洗柱。用100mM磷酸氢二钾及含500mM KCl缓冲液C以0.5ml/分将结合蛋白洗脱(图8A)。如实施例3所述，一部分含DAGAT活性峰的组分进行梯度凝胶SDS-DAGE。将蛋白质用银染色并将带型组分对组分与活性曲线加以比较，(图8B)。一些DAGAT蛋白质候选物与活性相关。尤其注意在相应于43kD，36.5kD，33kD，29kD，28kD及27kD位置迁移的条带。在53kD区未显示有与活性相关的候选蛋白质。
在方案B，以1ml/分将Triton X-100提取物加至用有含75mM KCl缓冲液C平衡的Yellow86-琼脂糖柱(1.5cm×5.8cm)。用5柱体积的平衡缓冲液冲洗柱，然后将Yellow86-琼脂糖柱出口与用含500mMKCl缓冲液C平衡的羟磷灰石柱(1.0cm×26.2cm Bio-Rad，Hercules，CA)的入口相接。用110ml含500mM KCl的缓冲液C洗脱与Yellow86柱结合的DAGAT活性，并以0.2ml/分直接通过羟磷灰石柱。最后，将羟磷灰石柱与Yellow86-琼脂糖柱解离，并用100mM磷酸氢二钾及含500mM KCl的缓冲液C洗脱与羟磷灰石柱结合的蛋白质。DAGAT活性在用110ml含500mM KCl的缓冲液冲洗期间从羟磷灰石柱中收集的组分中发现。
Triton x-100提取物中的多数蛋白质不与Yellow86琼脂糖柱结合而被弃去。包括DAGAT的一小部分蛋白质与Yellow86-琼脂糖结合，并用含500mM KCl的缓冲液C洗脱，当将此洗脱物应用于羟磷灰石柱时，DAGAT活性流经此柱同时大多数剩余蛋白质与柱结合，并用含500mM KCL的缓冲液C洗脱，当将此洗脱物应用于羟磷灰石柱时，DAGAT活性流经此柱同时大多数剩余蛋白质与柱结合，并被分离(图9A)。含DAGAT活性峰的组分的一部分进行梯度凝胶SDS-PAGE，并用银染色。将洗脱自这些柱的带型与各自DAGAT活性曲线加以组分对组分对比。染色的蛋白质条带的测试表明33kDa的蛋白质与DAGAT活性最相关(图9B)。
实施例12制备用于凝胶内消化的蛋白质A.经浓缩制备SDS-PAGE样品将终HA柱(方案1)的流经/冲洗液的奇数组分合并并在装备YM30膜(Amicon，Inc.，Beverly，MA)的压力池中经超滤而浓缩3倍。将样品用2个Centricon-30元件(Amicon，Inc.，Beverly，MA)进一步浓缩为大约50μl体积。将每个样品用6μl SDS混合物(4μl 20％SDS，1μl 14.3M β-巯基乙醇，1μl 0.1％溴酚蓝)处理。在置于室温15分钟后，将样品加至10-13％丙烯酰胺梯度凝胶中(实施例3D)(16×16cm×1mm厚度)，并将蛋白质在150v，恒压电泳9.5小时。将凝胶在50％甲醇，10％乙酸中用0.1％Coomassie Blue染色15分钟，然后在50％甲醇10％乙酸中脱色2×20分钟。将33kDa蜡合酶条带从凝胶中切下，并在50％乙醇中脱色3×20分钟。一个泳道含有一系列蛋白质，而不用于终消化。
B.经沉淀制备SDS-PAGE样品将终HA柱(方案1)的偶数组分的等份(0.8ml)合并为3组。将合并等份均分入3个1.5ml小瓶中。加入0.2ml 40％TCA将蛋白质沉淀。置于冰上30分钟后，将样品离心(12,000×g，15分钟，4℃)以沉淀蛋白质。除去上清液，并用0.6ml冰冷丙酮将粒状沉淀冲洗二次。将每个集合样品的最终3份粒状沉淀用同一50μl SDS样品缓冲液经将缓冲液从一个小瓶转移至另一个小瓶而重悬浮。将已重悬浮的空的小瓶用10μl样品缓冲液冲洗，使每个集合样品的总重悬浮体积为60μl。将样品加至12％丙烯酰胺Tris/甘氨酸微胶中(Novex，SanDiego，cA，1.5mm×10孔)，在150V，恒压电泳20分钟直至染料从凝胶底部洗脱，从而分离蛋白质。此凝胶用Coomassie Blue染色并用Gel-Clear(Novex，San Diego，CA)脱色。将蜡合酶从代表柱中峰值及拖尾组分的凝胶上的三个非等价泳道中切下。将凝胶切片置于1.5ml小瓶中并用1ml 50％甲醇，10％乙酸脱色2小时。除去脱色溶液，并将凝胶切片在液氮中冷冻，置于干冰上一夜，以在耶鲁大学的W.MKeck Foundation Biotechnology Resouce Laboratory进行凝胶内消化。将一个得自经超滤浓缩的样品的凝胶切片和3个得自经沉淀浓缩的样品的凝胶切片合并，以进行凝胶内胰酶消化。
实施例13氨基酸序列的测定在耶鲁大学W.M Keck Foundation Biotechnology ResourceLaboratory进行蛋白质测序。其程序包括对一部分(10-15％)凝胶切片进行定量及氨基酸成分的分析，用一种蛋白酶(胰蛋白酶或赖氨酰内肽酶)消化蛋白质，及经反相HPLC分级分离产物。从HPLC选择吸收峰，并进行激光解吸质谱以在蛋白质测序前确定肽的存在、数量及质量。选择最长的肽进行微量测序。
实施例14拉曼被孢霉DAGAT核酸序列的分离通常，为了用作从mRNA逆转录的单链DNA模板的PCR引物，制备含有相应于DAGAT肽编码序列的有义取向序列的寡核苷酸。这些寡核苷酸用作“正向”扩增反应引物以产生有义链DNA。
对于非编码DNA链扩增的“反向”扩增反应，寡核苷酸可被设计成等同于用于制备用于PCR的DNA模板的引物的一部分。或者，含有互补于DAGAT肽编码序列的序列的寡核苷酸可以与上述“正向”DAGAT寡核苷酸引物组合应用。
当DAGAT肽序列含有可由各种不同密码子编码的氨基酸时，正向或反向引物可以是“简并”寡核苷酸，即含有针对特定肽区域的所有或一些可能的编码序列的混合物。为在此混合物中减少各种寡核苷酸存在量，当制备用于PCR引物的合成寡核苷酸时优选选择具有最少量可能编码序列的肽区域。相似地，当合成寡核苷酸直接用于筛选DAGAT序列文库时，优选较低简并的寡核苷酸。
将经PCR获得的DAGAT DNA片段标记，并用作从cDNA文库中筛选克隆的探针。本领域已知互补DNA及DNA构建及文库筛选技术，如例如Maniatis等(Molecular ClomingA Laboratory Manual，SecondEdition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述。在此方式中，获得的DAGAT核酸序列可进行核酸序列分析，并用于在各种宿主(真核及原核细胞)中表达DAGAT。
实施例15用于植物表达的拉曼被孢霉DAGAT构建体可如下制备提供DAGAT序列在植物细胞中表达的构建体。
含有来自在种子组织优选表达的基因中的5’及3’调节区的表达盒可从如WO92/03564所述的napin，Bce4及ACP基因中制备。
例如，Kridl等(Seed Science Research(1991)1209-219)阐述了用于蜡合酶或还原酶基因构建体表达的napin表达盒，pCGN1808。另一napin表达盒pCGN3223含有氨苄青霉素抗性背景，以及基本等同于pCGN1808中发现的1.725napin5’及1.265 3’调节序列。此调节区两侧有HindIII，NotI及KpnI限制位点，且单一SalI，BglII，PstI及XhoI克隆位点位于5’及3’非编码区之间。
也可应用在来自油质蛋白基因5’及3’区的控制下的转录调节的序列克隆盒。Brassica napus油质蛋白基因的序列由Lee及Huang(PlantPhys.(1991)961395-1397)报道。油质蛋白盒pCGN7636的序列见USPN5,445,947的图4。油质蛋白盒侧翼为BssHII，KpnI及XbaI限制位点，并含有用于在5’及3’油质蛋白区之间插入蜡合酶，还原酶，或其它的相应DNA序列的SalI，BamHI及PstI位点。
DAGAT基因序列可插入如此盒中以提供用于植物转化法的表达构建体。例如，USPN，5,445,947阐述了利用napin基因中5’及3’调节区在植物细胞中表达还原酶的构建体。
应用Holsters等〔Mol.Gen.Genet(1978)163181-187〕的方法及如下述用于植物转化的方法，将二元载体构建体转化入农杆菌细胞，如EHA101菌株(Hood etal.，J.Bacteriol(1986)1681291-1301)。
实施例16植物转化法及分析已有许多方法将相应的DNA序列插入植物宿主的基因组中，以获得转录或转录及翻译的序列以实现表型改变。
高芥子酸变种如Brassica napus的栽培种Reston或Canola型变种可用如Radke等(Theor.Appl.Genet.(1988)75685-694；Plant CellReports(1992)11499-505)所述的农杆菌介导的转化法转化。经如Valverkens等(Proc.Nat.Acad.Sci.(1988)855536-5540)所述的农杆菌介导的转化可获得转基因的Arabidopsis thaliana植物。用相关技术可相似地转化其它植物物种。
或者，可使用如Klein等(Bio/Technology 10286-291)所述的微粒轰击法以获得含有本文所述的还原酶及蜡合酶表达构建体的转化的植物。
用实施例1所述DAGAT分析法分析转化植物的种子或其它部位的DAGAT活性。
以上结果表明获得在从脂酰及二酰甘油底物形成三酰甘油中有活性的部分纯化的DAGAT蛋白的能力。并提供了获得DAGAT蛋白及其氨基酸序列的方法。另外，用本文所提供的PCR及文库筛选法从氨基酸序列中也可获得DAGAT核酸序列。可将此核酸序列进行操作以提供序列的转录和/或在宿主细胞中DAGAT蛋白质的表达，该蛋白可用于各种应用中。如此应用包括宿主细胞三酰甘油水平及组成的修饰。
所有本申请所引用的出版物及专利申请都并入参考，每个特异提及的出版物或专利申请都并入参考。
尽管前述发明已以例证或实施例之方式进行了详细阐述，但本领域熟练技术人员根据本发明之教导在未偏离权利要求之精神及范围下，可做某些改变及修改。
权利要求
1.一种基本纯化的酰基转移酶，其中所述酰基转移酶在从二酰甘油及脂酰辅酶A底物形成TAG中是有活性的。
2.权利要求1的酰基转移酶，其活性朝向10/10-DAG。
3.一种酰基转移酶蛋白，其中所述蛋白质在SDS-PAGE上具有大约33kD的表观分子量，所述蛋白质从天然细胞的膜或其它蛋白质中基本纯化，并能催化从1，2-二酰甘油及酰基辅酶A产生甘油三酯。
4.权利要求3的二酰甘油酰基转移酶，具有朝向181脂酰辅酶A底物的活性。
5.权利要求4的二酰甘油酰基转移酶，得自拉曼被孢霉。
全文摘要
本发明提供了能催化从1,2－二酰甘油及酰基辅酶A产生甘油三酯的酰基转移酶。本发明包含部分纯化的二酰甘油酰基转移酶(DAGAT),其中所述的蛋白质在从酰基辅酶A和二酰甘油底物形成三酰甘油中是有活性的。特别感兴趣的是拉曼被孢霉DAGAT,具有约40kD的分子量。本发明还涉及得自DAGAT蛋白的氨基酸和核酸序列以及这种序列在提供具有修饰的三酰甘油水平的转基因宿主细胞中的应用。
文档编号C12N15/82GK1266460SQ98808028
公开日2000年9月13日 申请日期1998年6月5日 优先权日1997年6月5日
发明者凯瑟琳·丹尼斯·拉迪萨瓦尔, 詹姆斯·乔治·梅茨, 迈克尔·W·拉斯纳, 格雷戈里·A·汤普森 申请人:卡尔金有限责任公司