专利名称：二酰甘油酰基转移酶测定法的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明提供了测量二酰甘油酰基转移酶(DGAT)的生物活性的方法。具体地，本发明提供了一种方法，用于对能够调节DGAT的生物活性的化合物进行快速、大量的筛选。更具体地，本发明提供了测量DGAT活性的测定系统，该系统使用FlashPlateTM技术，基于特定胶束的使用。
背景技术：
甘油三酯代表在真核生物中贮存的能量的主要形式。甘油三酯代谢中的失调或者不平衡与肥胖症、胰岛素抗性综合征和II型糖尿病、非酒精脂肪肝病和冠心病的病理和增加的风险有关(见，Lewis，等人，Endocrine Reviews(2002)23201和Malloy和Kane，Adv Intern Med(2001)47111)。此外，高甘油三酯血症通常是癌症治疗的不良后果(见Bast，等人Cancer Medicine，5th Ed.，(2000)B.C.Decker，Hamilton，Ontario，CA)。
甘油三酯合成中的一种关键酶是酰基辅酶A二酰甘油酰基转移酶，或者DGAT。DGAT是在哺乳动物组织中广泛表达的微粒体(microsomal)酶，其催化内质网中1，2-二酰甘油(DAG)和脂肪酰基辅酶A结合形成甘油三酯(TG)(Chen和Farese，Trends CardiovascMed(2000)10188和Farese，等人，Curr Opin Lipidol(2000)1 1229中综述)。最初认为DGAT在用于甘油三酯合成的两个主要途径——磷酸甘油和单酰甘油途径中唯一地控制二酰甘油向甘油三酯的酰化的最后步骤的催化。因为人们认为甘油三酯对于生存是必需的，并且认为它们的合成通过单一机制发生，所以还没有很好地研究通过抑制DGAT的活性对甘油三酯合成的抑制。
现在已经克隆和分析了编码小鼠DGAT1和相关的人类同源物ARGP1和ARGP2的基因(Cases，等人，Proc Natl Acad Sci(1998)9513018；Oelkers，等人，J.Biol Chem(1998)27326765)。小鼠DGAT1基因已经用于产生DGAT敲除小鼠以更好地阐明DGAT基因的功能。
出人意料地，不能表达功能DGAT酶的小鼠(Dgat-/-小鼠)可以存活并且仍然能够合成甘油三酯，表明多种催化机制促成甘油三酯合成(Smith，等人，Nature Genetics(2000)2587)。也已经鉴定了催化甘油三酯合成的其它酶，例如，DGAT2和二酰甘油转酰酶(Buhman，J.BiolChem，上文和Cases，等人，J.Biol Chem(2001)27638870)。小鼠中的基因敲除研究已经揭示DGAT2在哺乳动物甘油三酯合成中起基础作用并且是存活所需的。DGAT2缺陷小鼠是脂肪减少型的，并且出生后很快死亡，这明显由于用于能量代谢的底物的极大减少和皮肤中透性屏障功能的受损(Farese等人JBC(2004)27911767)。
显而易见地，Dgat-/-小鼠对食物诱导的肥胖症有抗性，其保持消瘦。甚至当喂饲高脂肪食物(21％脂肪)时，Dgat-/-小鼠仍然保持与喂饲常规食物(4％脂肪)的小鼠相当的体重，并且具有较低的全身甘油三酯水平。Dgat-/-小鼠中肥胖抗性不是由于降低的热量摄入导致的，这其实是增加的能量消耗以及对胰岛素和瘦素的耐受性减弱的结果(Smith，等人，Nature Genetics，上文；Chen和Farese，TrendsCardiovasc Med.上文；和Chen，等人，J Clin Invest(2002)1091049)。此外，Dgat-/-小鼠的甘油三酯吸收率降低(Buhman，等人，J.Biol Chem(2002)27725474)。除了提高的甘油三酯代谢之外，与野生型小鼠相比，Dgat-/-小鼠还具有提高的葡萄糖代谢，在葡萄糖负荷后，具有较低的葡萄糖和胰岛素水平(Chen和Farese，Trends Cardiovasc Med.上文)。
多种酶贡献于催化从二酰甘油合成甘油三酯的过程这一发现是重要的，因为它给予了调节该生物化学反应的一种催化机制以便以最小的不利副作用获得个体中的治疗结果的机会。例如，通过特异抑制DGAT1的人类同源物的活性来抑制二酰甘油向甘油三酯的转化的化合物将可以用于降低甘油三酯的肉体浓度和吸收，以治疗性地抵消肥胖症、胰岛素抗性综合征和明显II型糖尿病、充血性心力衰竭和动脉粥样硬化中和作为癌症治疗结果的甘油三酯的异常代谢引起的病理作用。
因为世界上社会中肥胖症、II型糖尿病、心脏病和癌症的不断增加的患病率，人们迫切需要开发有效治疗和预防这些疾病的新的疗法。因此，在开发能有效和特异抑制DGAT的催化活性的化合物方面存在兴趣。然而，由于与这种测定法的建立有关的技术困难，以前还没有建立用于分立特异DGAT抑制剂的大量筛选方法。
常规DGAT测定法对皮摩尔TG/min/mg微粒体蛋白质数量级具有低活性，并且会被其它几种酶促反应的产物污染。此外，DGAT催化的反应的产物通常通过TCL分析分离(Cases S.，等人，PNAS(1998)9513018；Cheng D.，等人，Biochem J.(2001)359707；Erickson S.K.，等人，J.Lipid Res.(1980)21930)或者通过使用繁琐的有机溶剂提取步骤分离(Coleman R.A.，等人，Meth.Enzymology(1992)20998)。考虑到提取过程涉及的多个步骤和TCL分析的低通量，当前可利用的DGAT测定法没有一种可用于高通量筛选形式。
在改进现有DGAT测定法第一种努力中，Ramharack R.R.和Spahr M.A.(EP 1 219 716 & US 2002/0127627)通过使用包含丙酮和氯仿组合的溶剂系统改变了所述过程。使用这种溶剂系统，通常的提取过程可以简化为一步提取过程。然而，本发明的目的是通过消除对耗时的提取步骤的需要，将该测定法进一步简化为更适于高通量筛选的过程，以及提供可以以单孔形式进行的测定法。
发明概述如上面提到，本发明涉及特别适于化合物的快速、大量筛选的DGAT测定法，其使用FlashPlateTM技术，基于特定胶束的使用。
因此，在第一方面，本发明提供了测量DGAT活性的方法，所述方法包括将包含至少一种DGAT底物的胶束与包含DGAT的微粒体接触，并测定所得反应混合物中的甘油三酯产量。
在本发明的特定实施方案中，使用闪烁固相支持体系统(如闪烁平板(flashplate))来测定甘油三酯的生产。
本发明还提供了鉴定测试化合物是否能够调节DGAT活性的方法，所述方法包括将包含至少一种DGAT底物的胶束与包含DGAT的微粒体在所述测试化合物存在和不存在的情况下接触，并测定所得反应混合物中的甘油三酯产量，其中所述测试化合物存在下TG产量的改变表明所述化合物能够调节DGAT活性。
在一种备选的实施方案中，使用闪烁固相支持体系统如(如闪烁平板)来测定前述筛选测定法中甘油三酯产量。
在本发明的一种具体实施方案中，前述筛选测定法用于测定测试化合物抑制DGAT活性的能力，其中测试化合物存在下TG产量的降低表明所述化合物是DGAT抑制剂。
本发明的另一目的是提供包含DGAT底物的胶束在根据本发明的方法中的用途。
本发明还提供了治疗或者预防与DGAT有关的状况或者病症的方法，所述方法包括对需要其的受试者施用治疗有效量的、根据本发明的筛选方法中鉴定的化合物。
序列描述SEQ ID NO1是人DGAT1的核苷酸序列。
SEQ ID NO2是人DGAT1的氨基酸序列。
SEQ ID NO3是人DGAT2的核苷酸序列。
SEQ ID NO4是人DGAT2的氨基酸序列。
附图简述
图1 使用384孔FlashPlateTM筛选测定法，抑制剂对DGAT活性的影响。
图2在FlashPlateTM筛选测定法中，包含DGAT底物的胶束中磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰胆碱(PC)对DGAT活性的影响。在固定浓度的PS(3.5mM)和不同浓度的PC(图2A)和固定浓度的PC(1.3mM)和不同浓度的PS(图2B)下。
发明详述本发明提供了在下述测定法中测量二酰甘油酰基转移酶(DGAT)生物活性的方法，所述测定法允许快速和大量筛选化合物调节DGAT活性的能力。
“DGAT”活性指辅酶A活化的脂肪酸向1，2-二酰甘油的3-位转移，形成甘油三酯分子。
本文使用的术语“甘油三酯”(TG，三酰甘油或者中性脂肪)指甘油的脂肪酸三酯。甘油三酯通常是非极性的和水不溶的。磷酸甘油酯(或者甘油磷酸酯)是生物膜的主要脂类组分。动物中脂肪和油主要包含甘油三酯的混合物。
本文使用的术语“调节”指对功能的增强或者减弱。优选地，调节DGAT活性的化合物调节至少10％，更优选至少25％，最优选至少50％，并且可以定义为DGAT活性的“调节剂(modulator)”。
一般而言，该方法包括下述步骤将包含至少一种DGAT底物的胶束与包含DGAT的微粒体组合，对所得反应混合物进行预定时间的温育，停止反应并测定作为DGAT活性指示剂的、所产生的TG的量。
包含DGAT底物的胶束由磷脂脂质体组成，所述磷脂脂质体典型地包含磷脂酰丝氨酸或者磷脂酰胆碱，更具体地包含磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱，优选地，磷脂酰胆碱浓度小于或等于磷脂酰丝氨酸浓度，进一步更具体地包含3∶1摩尔比的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱，最具体地，包含3.5∶1.3摩尔比的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱。通常用于本发明的方法中的DGAT底物是1，2-二酰甘油(DAG)，如1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油或者1，2-二油酰-sn-甘油和辅酶A活化的脂肪酸，如棕榈酰CoA或油酰-CoA。在本发明的一种具体实施方案中，包含DGAT底物的胶束包含1∶1重量比的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱和作为DGAT底物的1，2-二油酰-sn-甘油。在一种优选的实施方案中，胶束由分别为1.3mM和3.5mM的磷酸卵磷酯和磷脂酰丝氨酸和作为底物的1.6mM DAG组成。所述包含DGAT底物的胶束可以如下文实施例3中提供的制备，并且在-20℃作为胶束保存用于以后使用。
用于本发明方法中的包含DGAT的微粒体可以从昆虫细胞过表达系统得到或者从组织微粒体制备物得到，优选地，从昆虫细胞过表达系统得到用于活性测量的酶来源。
通常如Coleman R所述，从肝脏和肠得到组织微粒体制备物(Coleman R.，Diacylglycerol acyltransferase and monoacylglycerolacyltransferase from liver and intestine.Methods in Enzymology 1992；20998-104)。
在昆虫细胞过表达系统中，使用用包含编码DGAT酶的核酸序列的合适的表达载体(如商购Bac-to-Bac杆状病毒表达系统)转染的昆虫细胞(sf9、sf21或High Five细胞)的膜制备物。使用本领域已知的过程，得到膜制备物，这通常包括裂解和用匀浆装置匀浆细胞，并通过超速离心收集总细胞膜。可以将所得的膜制备物分为小份，并用10％甘油保存在-80℃备用。
通常在辅酶A活化的脂肪酸的存在下，尤其油酰基辅酶A的存在下，通过将包含DGAT的微粒体与胶束接触来起始DGAT与其底物的反应，其中任选地，可检测性地标记所述辅酶A活化的脂肪酸的部分。本文使用的可检测的标记意在包括放射性同位素，如14C或3H或荧光标记，如芘癸酸(pyrene decanoic acid)。因此本发明的目的是提供放射性标记的或者荧光标记的辅酶A活化的脂肪酸在根据本发明的方法中的用途，尤其[14C]-油酰基-CoA或(1-芘-1-基)癸酰基-CoA的用途。在本发明的一种更具体的实施方案中，[14C]-油酰基-CoA的用途。
通常将反应混合物在室温到37℃范围内的温度下温育预定的时间，例如5分钟到180分钟，更具体地，在至少23℃温育至少15分钟，进一步更具体地在37℃温育120分钟。
DGAT与其底物反应的终止可以通过加入DGAT抑制剂如N-乙基马来酰亚胺、N-(7，10-二甲基-11-氧代-10，11-二氢-二苯并[b，f][1，4]oxazepin-2-基)-4-羟基-苯甲酰胺或OT-13540(Masahiko Ikeda，Chinatsu Suzuki，Yasuhide InoueEffects of OT-13540，a potentialantiobesity compound，on plasma triglyceride levels in experimentalhypertriglyceridemia；XIIIth International Symposium onAtherosclerosis(Kyoto，Japan，)Sep-Oct，2003)来完成。备选地，使用变性剂，如包含碱、乙醇的终止溶液(即，12,5％无水乙醇，约10％去离子水，约2.5％1N NaOH和大约75％的包含约78.4％异丙醇、约19.6％正庚烷和约2.0％去离子水或者氯仿-甲醇的溶液)来终止反应。在本发明的一种具体实施方案中，使用N-乙基马来酰亚胺、N-(7，10-二甲基-11-氧代-10，11-二氢-二苯并[b，f][1，4]oxazepin-2-基)-4-羟基-苯甲酰胺或OT-13540，更具体地使用N-乙基马来酰亚胺终止反应。
核酸如本发明的方法中使用的，编码DGAT酶的核酸序列意在包括编码人DGAT1(SEQ ID No.2)或人DGAT2(SEQ ID No.4)的核酸序列，以及编码其它动物，尤其哺乳动物，更具体地其它灵长类的人DGAT1和DGAT2同源物的核酸序列。所述DGAT同源物将通常与SEQ IDNo.2或SEQ ID No.4具有至少50％，例如，60％、70％、80％、90％、95％或98％的序列同一性。本文使用的核酸序列包括DNA(包括基因组DNA和cDNA)和RNA。当根据本发明的核酸包括RNA时，对所附序列表中显示的序列的引用将理解为对RNA等同物的引用，其中用U代替T。
本发明的核酸可以是单链或双链的。本发明的单链核酸包括反义核酸。因此，应当理解，对SEQ ID NO1或者其同源物的引用包括互补序列，除非上下文中明显相反。
使用标准PCR(聚合酶链式反应)克隆技术可以克隆本发明的DGAT的cDNA序列。这涉及制备针对SEQ ID NO1或SEQ ID No.3的相反链上5’和3’末端的引物对，将引物与mRNA或者从哺乳动物cDNA文库得到的cDNA接触，在能导致所希望的区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增片段(例如，通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。可将引物设计为含有合适的限制酶识别位点，从而可以将扩增的DNA克隆到合适的克隆载体中。
可以以多种方法得到与SEQ ID NO1或SEQ ID No.3的序列不是100％同源但是编码SEQ ID NO2或SEQ ID NO4或者本发明的其它多肽的多核苷酸。
例如，可以对SEQ ID NO1或SEQ ID No.3的序列进行定点诱变。当例如需要对序列进行沉默密码子改变以优化多核苷酸序列在其中表达的具体宿主细胞的密码子选择时，定点诱变是有用的。序列的其它改变，以引入限制酶切割位点或者改变多核苷酸编码的多肽的性质或者功能可能是人们想要的。人们可能想要其它改变来代表提供例如保守替代所需的特定编码改变。
本发明的核酸可以在5’或者3’末端包含额外的序列。例如，可以将合成的或者天然5’前导序列附着至编码本发明的多肽的核酸。额外序列还可以包括本发明的核酸在特定宿主细胞中转录所需的5’或者3’非翻译区。
此外可以得到其它动物，尤其哺乳动物(例如大鼠或者兔)，更具体地灵长类(包括小鼠)的DGAT同源物并用于本发明的方法中。可以按下文所述来得到此类序列从其它动物物种的分裂的细胞或者组织或者基因组DNA文库制备cDNA，在中到高严格性条件(例如，0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约50℃到约60℃)下用包含SEQ IDNO1或SEQ ID No.3的全部或者部分的探针探测此类文库。
序列同一性可以使用通过商业途径可获得的算法，来计算核酸和多肽序列的百分数同一性，所述算法比较参考序列与查询序列。下面的程序(由National Center for Biotechnology Information提供)可以用于测定同源性/同一性BLAST、gapped BLAST、BLASTN和PSI-BLAST，其可以以默认参数使用。
算法 GAP(Genetics Computer Group，Madison，WI)使用Needleman和Wunsch算法比对两条完整序列，该算法使匹配数最大并且使缺口数最小。通常，使用默认参数，缺口产生罚分＝12，缺口延伸罚分＝4。
用于确定核酸序列或其部分和查询序列之间的最佳总体匹配的另一算法是使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.，6；237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序。该程序提供了总体序列比对。所述总体序列比对的结果是百分数同一性。用于对DNA序列进行FASTDB检索以计算百分数同一性的合适参数为Matrix(矩阵)＝一元(Unitary)，k-tuple＝4，Mismatch penalty(错配罚分)＝1，JoiningPenalty(结合罚分)＝30，Randomization Group Length(随机化组长)＝0，Cutoff Score(截断得分)＝1，Gap Penalty(缺口罚分)＝5，Gap SizePenalty(缺口大小罚分)＝0.05，和Window Size(窗口大小)＝500或者查询序列长度(核苷酸碱基)中更短者。
载体可以将本发明的核酸序列加入载体，尤其表达载体中。载体可以在相容的宿主细胞中复制核酸。从而在另一实施方案中，本发明提供了制备本发明的多核苷酸的方法，这是通过下述过程实现的将本发明的多核苷酸导入可复制的载体中，将载体导入相容的宿主细胞中，并在能使载体复制的条件下培养宿主细胞。可以从宿主细胞回收载体。在下文描述了与表达载体相关的合适宿主细胞。
优选地，载体中本发明的多核苷酸可操作地连接到控制序列，所述控制序列能够提供宿主细胞对编码序列的序列，即载体是表达载体。
术语“可操作地连接”指并列，其中所描述的元件的关系允许它们以它们预期的方式发挥功能。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以下述方式连接，所述方式使得能在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
可以选择或者构建合适的载体，其含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它合适的序列。载体可以是合适的质粒、病毒，例如，噬菌体、噬菌粒或者杆状病毒、粘粒、YAC、BA或者PAC。载体包括基因治疗载体，例如，基于腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒(如HIV或者MLV)的载体或者α病毒载体。
可以为载体提供复制起点，任选地用于表达所述多核苷酸的启动子和任选地启动子的调节子。载体可以含有一种或多种选择标记基因，例如，对于细菌质粒而言，含有氨苄青霉素抗性基因，或者对于哺乳动物载体而言，含有新霉素抗性基因。载体可以在体外用于例如产生RNA或者用于转染或者转化宿主细胞。载体还可以适于体内使用，例如，用于基因治疗的方法中。用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是本领域公知的。合适的宿主细胞包括细菌、真核细胞，如哺乳动物和酵母，和杆状病毒系统。本领域中可得到的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仑鼠肾细胞、COS细胞和许多其它细胞。
可以对启动子和其它表达调节信号加以选择，选出与为其设计表达载体的宿主细胞相容的那些。例如，酵母启动子包括酿酒酵母(S.cerevisiae)GAL4和ADH启动子、栗酒裂殖酵母(S.pombe)nmt1和adh启动子。哺乳动物启动子包括金属硫蛋白启动子，其可以应答重金属如镉而被诱导。还可以使用病毒启动子，如SV40大T抗原启动子或者腺病毒启动子。所有这些启动子可以在本领域容易地获得。
载体可以包括其它序列，如驱动插入的核酸表达的启动子或者增强子、使得多肽作为融合物产生的核酸序列和/或编码使得宿主细胞中产生的多肽从细胞分泌的分泌信号的核酸。
用于产生的本发明的多肽或用于基因治疗的载体包括携带本发明的微型基因(mini-gene)序列的载体。
关于其它细节，见例如Molecular Cloninga Laboratory Manual2nd edition，Sambrook等人，1989，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。用于操作核酸，例如制备核酸构建体、诱变、测序、向细胞导入DNA和基因表达，和蛋白质分析的许多已知的技术和方案详述描述于Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编著，JohnWiley & Sons，1992。
可以将载体转化进如上文描述的合适的宿主细胞中，以提供本发明的多肽的表达。从而，在另一方面，本发明提供了制备根据本发明的多肽的方法，所述包括在一定条件下培养用如上述的表达载体转化或者转染的宿主细胞，以提供编码所述多肽的编码序列的载体的表达，并回收所表达的多肽。多肽还可以在体外系统，如网织红细胞(reticulocyte)裂解物中表达。
本发明的另一实施方案提供了用载体转化或转染以复制和表达本发明的多核苷酸的宿主细胞。将选择细胞以与所述载体相容，细胞可以是细菌、酵母、昆虫或者哺乳动物细胞。可以在能表达所述基因的条件下培养宿主细胞，从而产生编码的多肽。如果表达与合适的信号前导肽偶联的所述多肽，它可以从细胞分泌到培养基中。通过表达进行生产后，可以从宿主细胞和/或培养基分离和/或纯化多肽，如本案这样，以及随后如人们所希望地，用于例如配制可以包括一种或多种额外的组分的组合物，如药物组合物，其包括一种或多种可药用赋形剂、运载体或者载体。
可以将根据本发明的多核苷酸以反义方向插入上述载体中以便提供反义RNA或者核酶的产生。
膜制备在一些情况下，制备如本发明方法中使用的此类细胞膜的细节可以通过接下来的测定法的性质所决定，并且通常包括收获完整细胞和破坏细胞，例如，通过在冰冷却的缓冲液中进行超声处理(例如，20mMTris HCl，1mM EDTA，pH7.4，4℃)。所得粗细胞裂解物随后通过低速离心，例如，以200xg在4℃下离心5分钟清除细胞碎片。最后使用高速离心步骤，如以40,000xg在4℃下离心20分钟进行进一步清除和膜富集，并通过悬浮在冰预冷的缓冲液中来洗涤所得的膜沉淀物，并重复高速离心步骤。将最终洗涤的膜沉淀物重悬浮在测定缓冲液中。通过Bradford(1976)方法，使用牛血清白蛋白作为标准来测定蛋白质浓度。膜可以立即使用或者冷冻用于以后的使用。
在本发明的方法中，将膜与如前述的DGAT底物在化合物的存在或不存在的情况下温育，以测定它们调节DGAT活性的能力。通过测量TG的产生来测定DGAT活性，其中典型地，使用闪烁固相介质，如可商购的FlashPlateTM技术，通过测量本发明胶束中放射标记的TG的加入情况来测定所述TG的产生。用GraphPad prism将数据拟合为非线性曲线。
以这种方式，可以鉴定调节DGAT活性的激动剂或者拮抗剂。本发明的一个具体目标是在方法中使用膜制备物来鉴定能够抑制DGAT活性的化合物，例如，鉴定DGAT拮抗剂。
治疗性制剂因此而本发明提供了新的调节剂，尤其通过根据本发明的测定法得到的拮抗剂，和包含此类调节剂的组合物。结合受体并且可以具有激动剂或者拮抗剂活性的试剂可以用于治疗病理特征为DGAT酶的作用的疾病(尤其肥胖症和高三酰甘油相关的疾病)的方法中，并且此类用途形成了本发明的另一方面。甘油三酯代谢的紊乱或者不平衡涉及肥胖症、胰岛素抗性综合征和II型糖尿病、非酒精脂肪肝病和冠心病的病理发生和增加的风险(见Lewis，等人，Endocrine Reviews(2002)23201和Malloy和Kane，AdvIntern Med(2001)47111)。此外，高甘油三酯血症通常是癌症治疗的不量后果(见Bast，等人CancerMedicine，5th Ed.，(2000)B.C.Decker，Hamilton，Ontario，CA)。
本发明还提供了治疗或者预防选自下述组的状况或者病症的方法，所述组由肥胖症、糖尿病、神经性厌食症、贪食症(bulimia)、恶病质(cachexia)、X综合征、代谢综合征、胰岛素抗性、高血糖、高尿酸血症、高胰岛素血症、高胆固醇血、高脂血症、血脂障碍、混合型血脂障碍、高甘油三酯血症、非酒精脂肪肝病、动脉粥样硬化、动脉硬化、急性心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌病、心肌梗塞、心绞痛、高血压、低血压、中风、局部缺血、局部缺血性再灌注损伤、动脉瘤、再狭窄、脉管狭窄、实体瘤、皮肤癌、黑素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌和卵巢癌构成，所述方法包括对需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的化合物。对于该方法和下面提供的方法，在一些实施方案中，本发明的化合物将与第二种治疗剂组合施用。
活性剂可以以有效量的本发明的活性剂施用。因为许多上述状况是慢性和通常是不可治愈的，应当理解“治疗”意在包括实现症状在一段时间内(例如几小时、几天或者几周)的减轻，并且包括延缓疾病过程的进展。
此类活性剂可以配制成包含活性剂与可药用载体或者稀释剂的组合物。活性剂可以为生理功能衍生物的形式，如酯或者盐，如酸加成盐或者碱金属盐，或者N或者S氧化物。可以配制组合物用于任何合适的施用途径和方式。可药用载体或者稀释剂包括用于适于经口、直肠、鼻、吸入、局部(包括口含和舌下)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)施用的制剂的那些载体或稀释剂。对载体或稀释剂的选择当然将取决于打算的施用途径，其可以取决于活性剂和其治疗目的。制剂可以方便地以单位剂型存在或者可以通过本领域公知的任一种方法制备。此类方法包括将活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体联结(association)的步骤。一般地，制剂是这样制备的将活性成分与液体载体或者细分的固态载体或者两者均匀和密切地联结，然后如果需要的话，使产物成型。
对于固态组合物，常规的无毒性固态载体包括例如，药物级的甘露醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁、等等。如上定义的活性化合物可以配制为栓剂，这使用例如，聚亚烷基二醇、乙酰化的甘油三酯等等作为载体来进行。液态药学上可施用的组合物可以例如按下文来制备将如上定义的活性化合物和任选的药物佐剂溶解、分散在载体，如水、盐水葡萄糖、甘油、乙醇等等中，以形成溶液或者混悬液。如果希望的话，将施用的药物组合物还可以含有少量无毒辅助物质，如增湿剂或者乳化剂、pH缓冲剂等等，例如，乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺油酸酯等等。制备此类剂型的实际方法是本领域技术人员已知的或者将显而易见的；见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania，15th Edition，1975。
在任何情况下，将施用的组合物或者制剂都将含有有效于减轻所治疗的受试者的症状的量的活性化合物的量。
可以制备含有0.25到95％的活性成分和由无毒性载体组成的余下平衡性组分的剂型或者组合物。
对于经口施用，通过将任一种正常使用的赋形剂掺入，形成可药用的无毒性组合物，所述赋形剂为例如药物级甘露醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、交联羧甲基纤维素钠(sodium crosscarmellose)、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁、等等。此类组合物可以为溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等等的形式。此类组合物可以含有1％-95％活性成分，更优选地2-50％，最优选5-8％。
肠胃外施用的一般特征是皮下、肌内或者静脉内注射。可以以常规形式制备注射剂，作为液体溶液剂或者混悬剂、适于注射前溶剂或者悬浮在液体中的固体形式，或者作为乳剂。合适的赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等。此外，如果希望的话，将施用的药物组合物还可以含有少量无毒性辅助物质，如湿润剂或者乳化剂、pH缓冲剂等等，如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、三乙醇胺乙酸钠，等等。
此类肠胃外组合物中含有的活性化合物的百分数高度取决于其特定性质，以及化合物的活性和受试者的需要。然而，可以使用溶液中0.1％到10％的活性成分百分数，并且如果组合物是固体该百分数将更高，所述组合物将随后稀释到上面的百分数。优选地，组合物将包含溶液中0.2-2％的活性剂。
将参考下面的实验细节更好地理解本发明，但是本领域技术人员将理解这些仅仅用于阐明本发明，本发明在下文的权利要求书中将被更完整地描述。此外，在本申请全文中，引用了多种出版物。通过引用将这些出版物的公开内容并入本文，以更完整地描述本发明所属领域的状态。
实施例下面的实施例阐明本发明。根据这些实施例的启示，本领域技术人员将能想到其它实施方案。
实施例1DGAT的表达DGAT，酰基-CoA二酰甘油酰基转移酶是甘油三酯生物合成中的关键酶。DGAT通过使用二酰甘油(DAG)和脂肪酰基CoA作为它的底物，催化酰基残基从脂肪酰基CoA向二酰甘油转移形成TAG的反应。
将人DGAT1(SEQ ID No.1)克隆进pFastBac载体，该载体在N-末端含有如文献中描述的翻译起始、FLAG-标记和ATG前的病毒Kozak序列(AAX)以提高在昆虫细胞中的表达。因为DGAT是膜蛋白，所以如文献中描述的那样使用SF9细胞进行表达(Cases，S.，Smith，S.J.，Zheng，Y.，Myers H.M.，Lear，S.R.，Sande，E.，Novak，S.，Collins，C.，Welch，C.B.，Lusis，A.J.，Erickson，S.K.和Farese，R.V.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，13018-13023.)。
实施例2DGAT膜的制备通过离心(13000rpm-15分钟-4℃)收集72h转染的SF9细胞，并用2×500ml裂解缓冲液(0.1M蔗糖，50mM KCl，40mM KH2PO4，30mMEDTA pH7.2)裂解。通过细胞破坏器(disruptor)匀浆细胞。1380rpm-15min-4℃离心(丢弃SN)后，将沉淀物重悬浮在500ml裂解缓冲液中，并通过以34000rpm(100000g)超速离心60分钟(4℃)收集总细胞膜。用裂解缓冲液重悬浮收集的细胞膜，分为小份，并用10％甘油在-80℃保存待用。
实施例3胶束的制备材料a)1，2-二油酰基-sn-甘油，10mg/ml(DAG)在氮气下蒸发乙腈溶液并以10mg/ml的终浓度用氯仿重构。
b)L-α-磷脂酰胆碱，1mg/ml(PC)在氯仿中以1mg/ml的终浓度溶解并在4℃保存。
c)L-α-磷脂酰-L-丝氨酸，1mg/ml(PS)
在氯仿中以1mg/ml的终浓度溶解并在4℃保存。
方法向厚玻璃容器中的10ml PC和10ml PS加入1ml DGA。在氮气下蒸发并在冰上放置15分钟。通过在冰上超声处理，在10ml Tris/HCl(10mM，pH7.4)中悬浮所得重构物。超声处理过程由超声浴中10秒接着在冰上冷却10秒的超声循环并重复该超声循环直到得到均匀溶液(耗时约15分钟)组成。所得的胶束在-20℃保存备用并且含有终浓度为1.61mM的DAG。
为了证实包含DGAT底物的胶束中磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的最优的1∶1重量比，我们分析了DGAT FlashPlateTM测定中不同比例的影响。
对于磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的不同组合，制备了分别的混合物。将二油酰基-sn-甘油(10mg/ml)、L-α-磷脂酰胆碱(1mg/ml)和L-α-磷脂酰-L-丝氨酸(1mg/ml)在氯仿中的贮存液的小份在玻璃瓶中合并，在氮气下蒸发，并在冰上放置15分钟。通过在冰上超声处理在10mlTris/HCl(10mM，pH7.4)中进行重构。小份在-20℃保存。
在第一组实验中，改变PC的浓度以改变PC∶PS比例。DGAT活性的磷脂酰胆碱的最佳胶束浓度为0.8mM(图2)，在胶束中具有3.5mM磷脂酰丝氨酸。不幸的是，该浓度导致不稳定的、不可再现的胶束，表明没有达到临界胶束浓度。通常基于它们的可溶性性质定义脂类。它们在非极性溶剂中易溶，在水中几乎不溶。对两亲性分子在水中的可溶性的测量是它们的临界胶束浓度(CMC)。这定义为游离溶液中的分子与聚集形式的分子平衡时的浓度。典型的洗涤液体含有CMC为mM浓度范围(3)的去污剂。另一方面，使用高于0.8mM的浓度降低了DGAT活性。我们推断在该条件下，1.6mM的磷脂酰胆碱对于可再现地形成具有可接受的DGAT活性的胶束是最佳的。
这在第二组实验中得以证实，其中改变PS的浓度以改变PS∶PC比例。在含有1.6mM二酰甘油的胶束中测试胶束磷脂酰丝氨酸的不同浓度揭示了DGAT活性的良好的剂量反应一直达到3.5mM，之后达到几乎最大的DGAT活性(图2B)。使用较少的磷脂酰丝氨酸不仅降低了活性，而且与对于磷脂酰胆碱相似地，导致较不稳定的和不可再现的胶束。通过省略磷脂酰丝氨酸，几乎所有DGAT活性都消失，表明磷脂酰丝氨酸对于活性是关键的。我们推断在该条件下，3.5mM磷脂酰丝氨酸对于可再现地形成具有可接受的DGAT活性的胶束是最佳的。
胶束形成中不仅考虑最大活性，而且考虑稳定性和可再现性，分别对于1.3mM和3.5mM的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸达到最佳浓度。在该设置中，磷脂酰丝氨酸似乎对于DGAT活性是关键的，磷脂酰胆碱对于胶束的稳定性和可再现性是关键的。
实施例4DGAT FlashPlateTM测定法材料a)测定缓冲液50mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM MgCl2，1mM EDTA，0.2％BSA。
b)N-乙基马来酰亚胺，5M溶解5g至最终体积8ml DMSO 100％并以等分试样保存在-20℃备用。
c)底物混合物(对于1个384孔板＝3840μl)612μl分子团母液(5μM终浓度)16.6μl油酰基CoA 9.7mM23μl[3H]-油酰基CoA(49 Ci/mmol，500μCi/ml)3188.4μlTris pH7.4，10mMd)酶混合物(对于1个384孔板＝3520μl)(5μg/ml)加入11.73μlDGAT膜贮存液(1500μg/ml储存液)到3508μl测定缓冲液中。
e)终止混合物(对于1个384孔板＝7.68ml)(250mM)加入384μl N-乙基马来酰亚胺(5M)到3.456ml DMSO100％，并用3.84ml DMSO 10％进一步稀释3.84ml所述溶液。
方法使用红移Basic Image FlashPlateTM(Perkin Elmer Cat.No.SMP400)，以384孔形式在50mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM MgCl2，1mM EDTA和0.2％BSA，含有50μM DAG，32μg/ml PC/PS和8.4μM[3H]-油酰基CoA(以30nCi/孔的比活性)的50μl的终体积中测定膜制备物中的DGAT活性。
详细地说，向30μl测定缓冲液加入10μl酶混合物和10μl底物混合物，任选存在1μl DMSO(空白和对照)或者1μl待测试的化合物。将该反应混合物在37℃温育120分钟并通过加入20μl终止混合物终止酶促反应。封闭平板并允许小泡在室温下过夜静置。将平板以1500rpm离心5分钟并用Leadseeker测量。
讨论当前，不能通过商业途径获得真正的高通量相容的测定法，这可能是由于常规酶促测定法使用小泡制备物模拟酶的天然环境这一事实，其中酶嵌入在膜中。
必须要进行常规的TLC分离或者溶剂萃取，以分离放射标记的DAG或者酰基COA与所形成的放射标记的TG。测量形成的放射标记的TG前该额外的处理步骤使得这些常规方法较不适于高通量筛选，其中每一步不仅增加了测定法的循环时间，而且影响了测定法的可再现性和一致的读出。
本发明的DGAT活性筛选仍然模拟酶的天然环境，因为使用包含DGAT的膜制备物和包含DGAT底物的胶束，但是尤其适于对DGAT活性的大量筛选，因为它是单孔过程，不需要分离所形成的放射性标记的TG与放射性标记的酰基COA。该单孔筛选形式得以实现，因为所观察到的放射荧光仅仅来自与闪烁平板表面密切接触的所形成的放射性三酰基甘油，相反放射性标记的酰基辅酶A保持在溶液中。
总之，本发明通过消除了对耗时的TLC和提取步骤的需要提供了更适于高通量筛选的平台，并且提供了更可再现和可靠的结果。
序列表<110>Janssen Pharmaceutica NV<120>二酰甘油酰基转移酶测定法<130>PRD2405<150>EP04106850.3<151>2004-12-22<160>4<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>1488<212>DNA<213>人<220>
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1.测量DGAT活性的方法，所述方法包括将包含至少一种DGAT底物的胶束与包含DGAT的微粒体接触，并测定所得反应混合物中的甘油三酯产量。
2.根据权利要求1的方法，其中包含DGAT底物的胶束选自-包含磷脂酰丝氨酸或者磷脂酰胆碱的胶束；-包含磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的胶束；或-包含重量比为1∶1的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的胶束。
3.根据权利要求1的方法，其中反应混合物还包含辅酶A活化的脂肪酸。
4.根据权利要求3的方法，其中辅酶A活化的脂肪酸选自棕榈酰-CoA或者油酰基-CoA。
5.根据权利要求3或4的方法，其中所述辅酶A活化的脂肪酸的部分被可检测性地标记。
6.根据权利要求5的方法，其中所述辅酶A活化的脂肪酸的部分被放射性标记。
7.根据权利要求3到6任一项的方法，其中辅酶A活化的脂肪酸是油酰基-CoA，并且所述油酰基-CoA的部分是[3H]-油酰基-CoA。
8.根据权利要求1的方法，其中DGAT底物由硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油或者1，2-二油酰基-sn-甘油组成。
9.根据权利要求1的方法，其中包含DGAT的微粒体是表达人DGAT1(SEQ ID No.2)蛋白质的昆虫细胞的膜制备物。
10.根据权利要求1的方法，其中使用闪烁固相支持体介质测定甘油三酯的生产。
11.鉴定测试化合物是否能够调节DGAT活性的方法，所述方法包括在存在和不存在测试化合物时，将包含至少一种DGAT底物的胶束与包含DGAT的微粒体接触，并测定所得到的反应混合物中的甘油三酯产量，并且其中存在测试化合物时甘油三酯产量的改变表明所述化合物能够调节DGAT活性。
12.根据权利要求11的方法，其中包含DGAT底物的胶束选自-包含磷脂酰丝氨酸或者磷脂酰胆碱的胶束；-包含磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的胶束；-包含的磷脂酰胆碱浓度小于或等于磷脂酰丝氨酸浓度的胶束；-包含3∶1摩尔比的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的胶束；-包含3.5∶1.3摩尔比的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的胶束。
13.根据权利要求11的方法，其中反应混合物还包含辅酶A活化的脂肪酸。
14.根据权利要求13的方法，其中辅酶A活化的脂肪酸选自棕榈酰-CoA或者油酰基-CoA。
15.根据权利要求13或14的方法，其中所述辅酶A活化的脂肪酸的部分被可检测性地标记。
16.根据权利要求15的方法，其中所述辅酶A活化的脂肪酸的部分被放射性标记。
17.根据权利要求13到16任一项的方法，其中辅酶A活化的脂肪酸是油酰基-CoA并且所述油酰基-CoA的部分是[3H]-油酰基-CoA。
18.根据权利要求11的方法，其中DGAT底物由硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油或者1，2-二油酰基-sn-甘油组成。
19.根据权利要求11的方法，其中包含DGAT的微粒体是表达人DGAT1(SEQ ID No.2)蛋白质的昆虫细胞的膜制备物。
20.根据权利要求11的方法，其中使用闪烁固相支持体介质测定甘油三酯产量。
21.治疗病理特征是DGAT酶的作用的疾病，尤其是肥胖症和高三酰甘油相关疾病的方法，所述方法包括对需要其的受试者施用治疗有效量的使用根据权利要求11到20任一项的方法鉴定的化合物。
全文摘要
一般而言，本发明提供了测量二酰甘油酰基转移酶(DGAT)的生物活性的方法。具体地，本发明提供了对能够调节DGAT的生物活性的化合物进行快速、大量筛选的方法。更具体地，本发明提供了测量DGAT活性的测定系统，其使用FlashPlate
文档编号C12Q1/61GK101084319SQ200580042578
公开日2007年12月5日 申请日期2005年12月13日 优先权日2004年12月22日
发明者K·A·G·J·M·德韦佩奈尔特, D·C·G·彼得斯, G·M·R·范赫克, P·G·I·韦尔莫朗, M·J·M·贝韦尔 申请人:詹森药业有限公司