专利名称：脂酰辅酶a∶脂肪醇酰基转移酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶，纯化和得到该酶的方法，有关该酶的氨基酸和核酸序列，以及将这种组合物用于基因工程的方法。
引言背景通过植物基因工程技术的发展，可以转化和再生多种植物以提供具有新的和所需特性的植物。这种植物基因工程技术的一个有价值的领域是在植物组织中生产有利可图的产物。该应用需要在转化事件中使用多种DNA构建体和核酸序列以产生能生产所需产物的植物。例如，基因序列的适当表达需要植物功能性的启动子，所述表达可在整个植物或选定植物组织中进行。另外，经常使用选择性的标记序列来鉴定转化的植物材料。这种植物启动子和可选择的标记提供了有价值的工具，该工具可用于得到新的植物。
涉及这种基因工程技术的所需目标是能提供具有方便的蜡酯来源的谷类植物。包括药品，化妆品，去污剂，塑料和润滑剂的多种工业应用都需要蜡酯。蜡酯，尤其是长链蜡酯以前得自危险的物种鲸，最近得自沙漠灌木jojoba。这些来源都无法便利地提供蜡酯，因此，为了得到可靠来源的该化合物，需要转化谷类植物，其在培养，收获和产物提取方面易于操作。
然而，为了得到这种转化植物，必需首先得到负责所需蜡酯产物之生物合成的基因。至少两种酶活性的作用会导致蜡酯生产，它们是脂酰还原酶和脂酰脂肪醇酰基转移酶，或蜡合酶。另外，β-酮脂酰-ACP合酶通过为还原酶和蜡合酶的酶促反应提供很长链的脂酰辅酶A底物也参与蜡的生物合成。初步研究这些酶和深入分析并纯化脂酰还原酶，结果表明这些蛋白质与膜有关，然而，仍未确切表征负责蜡生物合成中脂酰脂肪醇连接反应的酶。因此，需要进一步研究并最终纯化此酶以得到编码酶活性的基因序列。
因此，需要设计纯化方案，籍此得到蜡合酶蛋白和测定其氨基酸序列和/或得到特异于蜡合酶的抗体。在此方法中，可使用文库筛选，聚合酶链反应(PCR)或免疫学技术来鉴定表达蜡合酶蛋白的克隆。分析以此方法得到的克隆以鉴定对应于蜡合酶活性的核酸序列。然后将蜡合酶核酸序列与脂酰还原酶蛋白联合使用以在宿主细胞中生产蜡酯，所述脂酰还原酶蛋白对转基因宿主细胞而言是天然的或是由重组技术提供的。
相关文献据报道处于发育中的jojoba胚的无细胞匀浆物具有酰基辅酶A脂肪醇酰基转移酶活性。此活性与通过差速离心形成的漂浮的蜡层有关(Pollard等(1979)文献同上；Wu等(1981)文献同上)。
Wildner和Hallick(The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting,1990-4-22至24,Las Cruces,NM.)报道了得自具有脂酰S辅酶A转酰基酶活性之Euglena Gracilis的多酶复合物的溶解。
Pushnik等(The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting,1989-2-7,Riverside,Ca)报道了jojoba乙酰辅酶A醇转酰基酶蛋白的10倍纯化。
Garver等(分析生物化学(1992)207:335-340)报道了测定jojoba酰基辅酶A醇转酰基酶活性的方法。
WO93/10241涉及植物脂酰辅酶A脂肪醇O-酰基转移酶。jojoba57KD的蛋白质被鉴定为jojoba脂酰辅酶A脂肪醇O-酰基转移酶(蜡合酶)。本申请人后来报道了jojoba 57KD的蛋白质是参与很长链的脂肪酸生物合成的β-酮脂酰-辅酶A合酶(Lassner等，植物细胞(1996)8:281-292)。
Shockey等(植物生理学(1995)107:155-160)还报道了被假定为酰基辅酶A脂肪醇酰基转移酶的57KD jojoba种子多肽的光亲和性标记。
附图简述
图1提供了得自第一种蜡合酶纯化方案的柱组分中蜡合酶活性的分析结果，图1A为Blue A琼脂糖层析的结果，图1B为陶瓷羟基磷灰石层析的结果，图1C为sephracryl S-100大小排阻层析的结果，图1D为羟基磷灰石层析的结果。
图2提供了得自第二种蜡合酶纯化方案的柱组分中蜡合酶活性的分析结果，图2A为Blue A琼脂糖层析的结果，图2B为羟基磷灰石层析的结果，图2C为Superdex 75大小排阻层析的结果。
图3提供了由引物WSPEP14-F1和WSPEP33-R2(图3A)所得PCR产物的核苷酸序列和由5’和3’RACE产物(图3B)推定的jojoba脂酰辅酶A脂肪醇O-酰基转移酶的完整核苷酸序列。
图4提供了在由经pCGN8559转化的拟南芥的发育种子制备的沉淀物组分检测试验中，显示1-14C 16:0辅酶A掺入蜡的TLC板放射影像。
发明简述本发明提供了编码脂酰辅酶A脂肪醇O-酰基转移酶蛋白(脂肪醇酰基转移酶，E.C.2.3.1.75)的核苷酸序列，其中所述蛋白质在由脂肪醇和脂酰底物形成蜡酯时是有活性的。本文也将这种脂酰辅酶A脂肪醇O-酰基转移酶称为“蜡合酶”。本发明的蜡合酶对多种脂酰和脂肪醇底物，包括酰基辅酶A和酰基-ACP都是有活性的。尽管给定的蜡合酶对具有特定链长度的酰基和醇底物更有偏好，或者给定的蜡合酶对具有宽范围碳链长度的酰基和醇底物都是有活性的，但这些底物的碳链长度可以不同。
通常，尽管可检测其它酰基或醇底物并发现其进一步的活性，但本发明的蜡合酶至少对链长度为8至26个碳的哪些酰基和醇底物是有活性的。另外，得到本发明的蜡合酶之后，其进一步的操作将在下文中详细描述。这些操作可导致其它相关蜡合酶的产生或发现。
在本发明的一个重要的方面，提供了编码蜡合酶的核酸序列。描述了由本发明蜡合酶蛋白的氨基酸序列得到上述核酸序列并对其进行鉴定的方法。描述了使用结构基因序列分离其它蜡合酶序列，以及在重组构建体中使用结构基因序列以在宿主细胞中转录蜡合酶核酸序列和/或表达蜡合酶蛋白。也考虑使用与蜡合酶蛋白相关的其它核酸序列，如使用5’和3’非编码区。
因此，本发明包括植物蜡合酶核酸序列和相应的氨基酸序列，以及使用这些核酸序列制备含有蜡合酶编码序列的寡核苷酸以分析和回收植物蜡合酶基因序列。根据想要的用途，植物蜡合酶编码序列可编码完整的或部分的序列。全部或部分的基因组序列，或cDNA序列也包括在本发明中。
特别令人感兴趣的是可转录或转录和翻译(表达)植物蜡合酶序列的重组DNA构建体。特别优选能在植物宿主细胞中转录或转录和翻译的构建体。对于一些应用而言，需要减少植物的蜡合酶，因此，可设计具有反向植物蜡合酶序列的重组构建体以表达反义序列，或者，使用共抑制，也称为“transwitch”构建体也是有用的。该构建体可含有多种调控区域，包括得自在植物种子组织中优先表达的基因的转录起始区域。对于一些应用而言，需要将蜡合酶基因的转录和翻译起始区域与蜡合酶编码序列一起使用或使用该区域介导异源序列的转录和翻译。
在不同的方面，本发明涉及通过在宿主细胞或其后代中表达构建体而在细胞中生产蜡合酶的方法。本文也包括因产生植物蜡合酶编码序列而含有蜡合酶的细胞。该构建体可使用其它核酸序列，所述核酸序列编码的蛋白质参与蜡酯和/或多种脂酰类的生产。
另外，可以认为本发明的蜡合酶可用于在含有蜡合酶之脂酰和脂肪醇底物的宿主细胞中生产蜡酯。这种宿主细胞可天然存在，或通过用编码脂酰还原酶的核酸构建体转化得到。脂酰还原酶，或“还原酶”具有催化脂酰基还原成相应的醇的活性。共同待审的美国专利申请07/659,975(2/22/91 提交)，07/767,251(9/27/91 提交)和07/920,430(7/31/92 提交)(皆列入本文作为参考)涉及这种还原酶蛋白。公开的PCT专利申请WO92/14816中也提供了此信息。另外，本文描述的其它来源的蜡合酶蛋白也是还原酶蛋白合乎需要的来源。
本发明的此方面特别地包括含有本文所述的jojoba蜡合酶的优选醇底物的植物细胞。还包括提供具有这种醇底物的植物细胞的方法，其中所述细胞被编码脂酰还原酶核酸序列的重组核酸构建体转化。因此，可用还原酶构建体转化通常不含大量被蜡合酶利用的醇底物的植物宿主以生产醇。在此方法中，宿主细胞中存在的脂酰基也提供了在蜡酯合成过程中被蜡合酶利用的脂肪醇底物的来源。根据蜡合酶和还原酶蛋白的特异性，可以认为在此方法中可得到产生多种所需蜡酯产物的植物细胞。根据链长度和脂肪醇及脂酰基的饱和程度，该产物可具有不同的特性。因此，可从宿主细胞中回收根据本文方法产生的蜡酯产物，所述产物也包括在本发明中。
本发明中还包括通过表达本发明的植物蜡合酶序列和蛋白质得到的经修饰的植物，种子和蜡酯。
发明详述根据本发明，提供了编码具有催化脂酰基酯化脂肪醇以产生蜡酯之活性的氨基酸，如蛋白质，多肽或肽片断的核酸序列。已知这种蛋白质是脂酰辅酶A脂肪醇酰基转移酶(E.C.2.3.1.75)，下文中也将本发明的酰基辅酶A醇酰基转移酶称为“蜡合酶”。
尽管一般被称为酰基辅酶A醇酰基转移酶，但本发明的蜡合酶显示出对多种酰基底物的活性，所述底物包括脂酰辅酶A和脂酰-ACP分子。另外，通过蜡合酶发生作用的酰基和醇底物可具有不同的碳链长度和饱和程度，但蜡合酶对某些分子的活性更强。
很多不同的生物由醇和酰基底物产生蜡酯，这些生物是本发明蜡合酶蛋白的合乎需要的来源。例如，植物产生表皮蜡或角质蜡(Kolattukudy(1980)，植物生物化学(Stumpf,P.K.和Conn,E.E编)Vol.4,p.571-645)，沙漠灌木jojoba产生种子储存蜡(Ohlrogge等(脂质(1978)13:203-210))。在多种细菌中也观察到蜡的合成，如不动杆菌属(Fixter等(1986)，普通微生物学杂志，132:3147-3157)和微球菌属(Lloyd(1987)Microbios 52:29-37)，单细胞生物Euglena也可合成蜡(Khan和Kolattukudy(1975)Arch.Biochem.Biophys.170:400-408)。另外，据报道牛睑板腺(Kolattukudy等(1986)J.Lipid Res.27:404-411)，禽尾脂腺和多种昆虫和海洋生物的微粒体制品中也有蜡产生并存在蜡合酶活性。结果，通过本发明的蜡合酶可生产很多具有多种特性的不同的蜡酯，酶活性和产生的蜡酯的类型取决于所用的底物或感兴趣的特定蜡合酶的底物特异性。
为了得到可靠来源的蜡合酶蛋白用于酯化反应，需要分离与蜡合酶相关的核酸序列以将这些序列克隆至宿主细胞中用于生产蜡合酶。例如，可将编码蜡合酶蛋白的核酸序列克隆至大肠杆菌细胞表达载体中以提供便于使用的蜡合酶蛋白来源。也可将如此产生的蜡合酶蛋白用于产生抗蜡合酶蛋白的抗体，该抗体可用于鉴定和纯化多种来源，尤其是植物中的相关蜡合酶蛋白。另外，对蜡合酶蛋白的进一步研究可导致位点特异性诱变反应，该反应可进一步鉴定和改善其催化特性或改变其脂肪醇或脂酰底物的特异性。底物特异性有所改变的蜡合酶可与其它FAS酶联合使用。
在本发明之前，蜡合酶蛋白的核酸和氨基酸序列是未知的。因此，为了得到与蜡合酶相关的核酸序列，首先必需从可利用的来源中纯化蛋白质并至少确定其部分氨基酸序列以制备可用于分离蜡合酶核酸序列的适当探针。
沙漠灌木Simmondsia chinensis(jojoba)被认为是候选蜡合酶蛋白的来源。最初的研究揭示出jojoba蜡合酶是膜内在蛋白质，其天然状态是疏水的。一般说来，难以纯化膜相关蛋白，因为当它们为溶解状态，即分离自其正常发挥功能的膜环境中时，它们趋向于失去酶活性。用于溶解膜内在蛋白的技术包括在适当膜组分的制品中加入去污剂或有机溶剂。假如使用特异性酶测定法测出所需的蛋白质仍保留功能活性，也可再利用其它常规的纯化技术，如沉淀，离子交换，凝胶过滤和亲和层析。
一般说来，得到溶解的膜蛋白质的第一个步骤中需要含有蜡合酶活性的微粒体膜制品。标准的微粒体膜制品利用无细胞匀浆物(CFH)的差速离心以产生不含完整细胞，核和可溶性蛋白质的膜组分(例见Moore等(1987)生物膜操作方法，p37-72,Finalay和Evans编)。对油性种子而言，最初的离心步骤一般产生沉淀物，上清液和飘浮的脂肪层，然后通过进一步离心上清液以回收微粒体膜。
美国专利5,403,918中描述了一个方法，通过此方法得到的jojoba膜组分较好地保留了与脂酰还原酶相关的酶活性，所述脂酰还原酶是参与jojoba中的蜡酯形成的另一种酶。此方法也提供了具有蜡合酶活性的膜组分，这一点将在随后的实施例中被详细描述。另外，Lassner等(文献同上)也描述了得自jojoba的微粒体膜制品。其它方法是本领域技术人员已知的，可使用这些方法得到类似的膜制品。另外，实施例1中描述了检测该制品中的蜡合酶活性的方法。
进一步鉴定和纯化酶的必需步骤是得到溶解的蜡合酶蛋白，该蛋白制备自其天然的脂质双层膜环境，但保留了大量可测的蜡合酶活性。一般使用水溶液中的两亲性去污剂从脂质双层中除去膜内在蛋白质，但有些情况下也可使用有机溶剂。很多不同的溶解膜蛋白质的去污剂和方法是本领域技术人员已知的，也可参见Neugebauer(酶学方法(1990)182:239-253)和Hjelmiland(酶学方法(1990)182:253-264)。
经常发现用于溶解膜蛋白质的去污剂可抑制所需蛋白质的酶活性。检测了几种去污剂溶解jojoba蜡合酶的能力，其中包括CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲铵]-1-丙磺酸)，美国专利5,403,918中证明该去污剂可用于从jojoba中纯化脂酰还原酶。发现这几种去污剂都可抑制蜡合酶的活性。尽管在浓度高于CMC时观察到CHAPS的强烈抑制作用，但加入磷脂，如L-磷脂酰胆碱，并将CHAPS的浓度从1.0％调节为0.2％，即低于CMC会导致蜡合酶活性部分的重建。重建蜡合酶活性的主要需求是在除去或稀释去污剂的过程中存在磷脂以使蜡合酶蛋白掺入磷脂载体。这与重建jojoba还原酶活性的方法不同，因为后者无需加入磷脂。因此，如果蜡合酶制品中存在磷脂，如得自微粒体膜组分的磷脂，可简单地通过除去或稀释去污剂来检测活性。然而，在进一步纯化的蜡合酶制品中，检测活性时必需加入磷脂。检测中，当CHAPS与PL的比例为2.8/1(w/w)时可得到最佳活性回收率。实施例1中描述了重建和检测溶解的蜡合酶制品中的蜡合酶活性的方法。
得到溶解的蜡合酶蛋白之后，可进行进一步的实验以鉴定酶的底物特异性，辅因子需求和可能的活性抑制剂。例如，已发现本发明的jojoba蜡合酶具有宽范围的酰基底物，包括酰基-ACP和酰基-辅酶A分子。另外，酰基和脂肪醇底物的碳链长度大小也是宽范围的。例如，使用碳链长度为C12至C24的底物检测活性，全都显示出可被酶利用。另外，用具有不同程度之不饱和度的脂酰和脂肪醇也显示出活性。
可利用层析技术提供富集的植物蜡合酶制品。一个纯化步骤包括在固定化的活性染料基质上进行层析，例如，本发明中使用的基质是Cibacron Blue F3GA(Blue A)。当在约含有0.3M NaCl的缓冲液中上样时，jojoba蜡合酶活性与该柱结合，而约85％以上的其它蛋白质穿过柱或在随后的洗涤中被除去。如美国专利5,403,918中所述，在这种条件下，还原酶活性也与Blue A柱结合。本文中阐明通过用2.0M NaCl缓冲液洗脱可回收上样于Blue A柱上的约70％的蜡合酶活性。jojoba还原酶和β-酮脂酰-辅酶A合酶(KCS)蛋白也存在于该Blue A洗脱物中。
通过将样品上样于结晶羟基磷灰石(HA)柱，可进一步纯化Blue A洗脱物。蜡合酶活性不与柱结合，在流过液和洗柱液中可发现该活性。大多数还原酶和KCS活性与柱结合，样品中的大多数蛋白质也是如此。在使用Superdex 75大小排阻柱的大小排阻层析中可使用蜡合酶活性被富集的HA组分，据估计jojoba蜡合酶蛋白的分子量为48KD。
使用这种纯化技术，可将jojoba蜡合酶蛋白回收为基本上纯的蛋白质制品，并可测定其氨基酸序列。类似地，由于蜡合酶之脂肪醇底物的疏水特性，经预测，其它蜡合酶在其天然细胞中也与膜相关，因此，也可使用本文所述的纯化jojoba蜡合酶的技术回收其它蜡合酶蛋白的纯化制品。
例如，Euglena gracillis通过脂酰辅酶A还原酶和脂酰辅酶A醇转酰基酶，或蜡合酶来产生蜡。通常，在此生物体中可检测到碳链长度范围为24-32的蜡。如上文提及jojoba时所述，使用CHAPS/NaCl溶液可溶解Euglena蜡合酶，通过染料-配体，HA和大小排阻层析可得到部分纯化的蜡合酶制品。
已知不动杆菌可产生蜡酯组合物，但其机制尚不完全清楚。如本文所述，在不动杆菌中检测到脂酰辅酶A醇转酰基酶或蜡合酶活性。蜡合酶活性溶解于CHAPS/NaCl中，被Blue A柱层析富集，使用如大小排阻层析的技术可进一步纯化之。
为了得到编码本发明蜡合酶的核酸序列，从SDS凝胶上切下含有纯化蛋白质的带，并用于氨基酸测序反应。使用了凝胶内消化而不是更加方便的方法，如将蛋白质转移至硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，因为jojoba蜡合酶蛋白印迹和结合于该膜的条件尚未被发现。给商业实验室W.M.Keck Foundation/Yale University提供含有纯化的jojoba蜡合酶蛋白的凝胶切片以通过凝胶内消化和随后的蛋白质测序测定jojoba蛋白质的氨基酸序列。以此方法产生的肽序列可用于PCR基因分离技术和cDNA文库筛选，这一点将在下文实施例中详细描述。
需要进行进一步的实验以证实蜡合酶的特性，所述实验如在大肠杆菌中表达蛋白质。然后，蜡合酶可对该细胞中的脂酰和脂肪醇底物起作用以产生通过多种分析方法可检测到的蜡酯。如果宿主细胞不含蜡合酶的醇底物，通过检测细胞提取物即可检验活性。或者，通过使用蜡合酶的核酸序列和商购的翻译试剂盒经体外翻译可制备蜡合酶蛋白。如果膜插入对活性而言是至关重要的，要想得到活性的蜡合酶蛋白，必需在体外翻译样品中加入微粒体膜制品。其它检测方法包括免疫测定法，通过此方法可制备特异于候选蛋白质的抗体，并发现此抗体可抑制蛋白质制品中的蜡合酶活性。
因此，如下文实施例详述，使用与蜡合酶活性相关的蛋白质的氨基酸序列分离出核酸序列，以证实蜡合酶蛋白的特性并在原核或真核宿主细胞中转录序列和/或表达蛋白质。
由于蜡合酶是膜结合蛋白，因此需要在植物细胞中表达候选蛋白质以证实活性。电穿孔或轰击植物组织以瞬时表达对此目的是有用的。最后，需要在能产生被此酶识别之底物的植物中进行稳定地植物表达。如果用蜡合酶序列转化的靶向植物通常不含此酶的脂肪醇和脂酰酯底物，可制备植物提取物，并通过在提取物中加入蜡合酶的底物来检测蜡合酶活性。下文将更详细地讨论用蜡合酶序列转化植物宿主的构建体和方法。
本发明的蜡合酶核酸可以是基因组的或cDNA，可分离自cDNA或基因组文库或直接得自分离的植物DNA。如下文实施例之详述，本文提供了由特异于公开的jojoba蜡合酶肽的引物，通过PCR得到jojoba蜡合酶之核酸序列的方法。
本发明的蜡合酶核酸序列包括那些对应于jojoba蜡合酶蛋白的序列，以及可得自jojoba蛋白质或核酸序列的序列。“对应于”指的是DNA或RNA核酸序列，包括编码jojoba蜡合酶蛋白或其部分的序列，存在于所述编码序列的5’或3’端，介导蜡合酶在jojoba胚中的转录或转录和翻译(表达)的调节序列，不存在于cDNA中的内含子序列，以及编码蜡合酶蛋白前体之任何前导或信号肽的序列，所述肽是插入内质网膜所必需的，但在成熟的蜡合酶中未发现此肽。
“可得自”jojoba序列或蛋白质的序列指的是与所需蜡合酶蛋白相关的任何核酸序列，该核酸序列可由jojoba蜡合酶的氨基酸序列合成，或者鉴定自不同的生物体，和使用jojoba蜡合酶核酸序列作为探针或jojoba蜡合酶蛋白的抗体进行分离。在此方法中，其它蜡合酶的序列也类似地可用于分离与其它来源的蜡合酶蛋白相关的核酸序列。
为了分离核酸序列，可使用质粒或病毒载体和本领域技术人员众所周知的技术制备cDNA或基因组文库。可用于筛选所需序列的有用的核酸杂交和免疫学方法也是本领域技术人员众所周知的，可参见例如Maniatis等(分子克隆实验室手册，第2版(1989)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。
一般而言，使用核酸探针可得到的序列在靶序列和编码所需蜡合酶之给定序列之间显示出60-70％的序列相同性。然而，也可得到具有少至50-60％序列相同性的长序列。核酸探针可以是核酸序列的长片断，或者也可以是较短的寡核苷酸探针。当较长的核酸片断被用作探针时(大于约100bp)，可以较低的严紧性筛选以从靶样品中得到与用作探针的序列具有20-50％偏差(即50-80％序列同源性)的序列。寡核苷酸探针可以比编码蜡合酶的整个核酸序列短很多，但至少应为约10，优选至少约为15，更优选至少约为20个核苷酸长。当使用的是较短的区域而不是较长的区域时，需要较高程度的序列相同性。因此，需要鉴定氨基酸序列相同性高的酶活性位点以设计寡核苷酸探针用于检测同源基因。
为了测定通过与给定序列杂交是否可分离相关基因，一般使用放射性来标记序列以用于检测，但也可使用其它方法。在杂交溶液中加入经标记的探针，与含有或为Northern印迹或为Southern印迹的所需核酸的滤膜一起保温(以筛选所需的同源性来源)，或者与含有待筛选的cDNA或基因组克隆的滤膜一起保温。杂交和洗涤条件可以不同，以使探针与所需序列的杂交最优化。较低的温度和较高的盐浓度允许杂交更密切相关的序列(低严紧性)。如果在低严紧性的条件下背景杂交是个问题，可以在杂交或洗涤步骤中升高温度，和/或降低盐的含量以改善特异性杂交序列的检测。可按Beltz等(酶学方法(1983)100:266-285)所述，根据估计的探针解链温度调整杂交和洗涤温度。
按上述鉴定出有用的探针和适当的杂交和洗涤条件之后，使用经标记的序列和最优化的条件筛选cDNA或基因组文库。首先将文库铺于固体琼脂培养基上，将DNA吸附至适当的膜上，通常是硝酸纤维素膜或尼龙滤膜。然后按上述使这些滤膜与经标记的探针杂交并进行洗涤以鉴定含有相关序列的克隆。
为了进行免疫学筛选，可通过用纯化的蛋白质注射兔或小鼠来制备jojoba蜡合酶的抗体。制备抗体的方法是本领域技术人员已知的。也可从专门制备抗体的公司得到抗体。可生产单克隆或多克隆的抗体，但一般来说，多克隆抗体对基因分离更加有用。
为了筛选所需的植物种，可进行Western分析以测定相关蛋白质存在于所需植物种的粗提取物中，所述蛋白质可与jojoba蜡合酶的抗体交叉杂交。具体实施方法是将植物提取物中的蛋白质固定在膜上，通常是硝酸纤维素膜上，接着进行电泳并与抗体保温。很多不同的检测硝酸纤维素滤膜上的抗体/蛋白质复合物的系统都可以使用，其中包括放射性标记抗体和第二抗体/酶缀合物系统。一些可用的系统描述于Oberfelder(Focus(1989)BRL/Life Technologies公司，11:1-5)。如果最初的实验无法检测相关的蛋白质，可使用其它检测系统和封闭剂。当观察到交叉反应性时，通过筛选代表所需植物种的表达文库即可分离编码相关蛋白质的基因。可按Maniatis等(文献同上)所述，在多种可商购的载体，包括λgtll中构建表达文库。
然后纯化使用DNA杂交或免疫学筛选技术按上述鉴定的克隆，使用已知技术分离DNA并分析之。凭此方法证实克隆编码相关的蜡合酶蛋白质。按与使用jojoba蜡合酶的方法相同的方法，通过使用“新”的蜡合酶可得到其它蜡合酶。
本领域技术人员应理解使用标准的位点特异性突变或PCR的技术可修饰本发明的蜡合酶核酸序列，或序列修饰善于产生合成的核酸序列。这些经修饰的序列也被认为是本发明的蜡合酶核酸序列。例如，可改变密码子中的摆动位置以使核酸序列编码相同的氨基酸序列，或者可改变密码子以产生保守的氨基酸取代。在每种情况下，肽或蛋白质保持所需的酶活性，因此，它们也被认为是本发明的一部分。
本发明蜡合酶的核酸序列可以是得自基因组DNA,cDNA,mRNA的DNA或RNA序列，或者可以全部地或部分地被合成。可通过例如从适当来源分离基因组DNA，使用聚合酶链反应(PCR)扩增并克隆所需序列来克隆基因序列。或者，尤其是需要提供植物优选的序列时，也可以全部地或部分地合成基因序列。因此，可使用选定宿主优选的密码子合成全部或部分的所需结构基因(部分基因也编码蜡合酶蛋白)。例如，由所需宿主种类所表达蛋白质最常使用的密码子可确定宿主优选的密码子。
与蜡合酶蛋白相关的核酸序列有很多用途。例如，可制备重组构建体，该构建体可用作探针或在宿主细胞中提供蜡合酶蛋白的表达。根据想要达到的用途，构建体可含有编码整个蜡合酶的序列或其部分。例如，可鉴定蜡合酶的必需区域，如活性位点。因此，也可制备其它构建体，它仅含有蜡合酶的部分序列，该序列编码所需蜡合酶活性所必需的氨基酸。
表达本发明蜡合酶序列的有用系统包括如大肠杆菌的原核细胞，酵母细胞和植物细胞，有维管和无维管的植物细胞都是合乎需要的宿主。以此方法，可产生蜡合酶蛋白以用于进一步的研究，如对编码序列进行位点特异性诱变以分析特异性突变对蜡合酶蛋白反应特性的影响。
可以多种方式使编码本发明蜡合酶的DNA序列与外源DNA序列联合。“外源”DNA序列指的是不与蜡合酶序列天然相连的任何DNA序列，包括相同生物体中不与蜡合酶序列天然相连的DNA序列。利用蜡合酶编码序列的有义和反义构建体被考虑在内，其中可在宿主细胞中使用有义序列表达蜡合酶，使用反义序列降低靶生物体天然产生的同源蜡合酶蛋白的内源性水平。另外，可在外源宿主中将本发明的蜡合酶基因序列与和蜡合酶天然相关之序列的全部或部分，如调节或膜靶向序列联合使用。
在其组成部分中，编码蜡合酶的DNA序列被插入重组构建体中，该构建体在5’至3’转录方向具有能促进宿主细胞中的转录和翻译的转录起始控制区域，编码蜡合酶的核酸序列和转录终止区域。调节区域随宿主的不同而不同，它可包括得自病毒，质粒或染色体基因等的区域。为了在原核或真核微生物，尤其是单细胞宿主中表达，可使用多种组成型或可调节的启动子。在微生物中的表达可提供便利的植物酶来源。已被描述的转录起始区域是细菌和酵母宿主，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酿酒酵母，包括如β-半乳糖苷酶，T7聚合酶，色氨酸E等的基因的区域。
大部分重组构建体包括在植物中起作用的调节区域，该区域可提供蜡合酶基因的表达以产生功能性的蜡合酶蛋白。编码植物蜡合酶或其功能性片断的开放阅读框的5’末端与转录起始调节区域，如蜡合酶结构基因5’上游的天然野生型序列连接。也可以使用多种得自天然植物基因的其它启动子区域，所述区域可为结构基因序列提供多种组成型或可调节的表达。
除了天然植物基因的序列外，其它序列也可在植物中提供组成型基因表达，例如与农杆菌属基因相关的调节区域，包括与胭脂氨酸合酶(Nos)，甘露氨酸合酶(Mas)或章鱼氨酸合酶(Ocs)基因相关的区域。控制病毒基因表达的区域也是有用的，如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S区域。本文所用术语“组成型”不必表示基因在所有细胞类型中以相同的水平表达，而是指基因可在广泛的细胞类型中表达，但是经常可检测到一些丰度的变化。其它有用的转录起始区域优先提供在某些组织中或在某些生长条件下的转录，如得自napin，种子或叶ACP,RUBISCO之小亚单位等的区域。
在需要在植物宿主中表达蜡合酶蛋白的实施方案中，需要使用完整的植物蜡合酶基因的全部或部分，即可使用5’上游非编码区(启动子)与结构基因序列和3’下游非编码区。如果需要不同的启动子，如对所需植物宿主而言为天然的启动子，或经修饰的启动子，即具有得自一个基因来源的转录起始区域和得自不同基因来源的翻译起始区域的启动子，或增强的启动子，如两个35S CaMV启动子，可以使用标准技术将序列连接在一起。另外，高表达植物基因的5’非翻译区域可用于增加本文所述蜡合酶蛋白的表达。
多种植物，尤其是生产蜡合酶之脂酰辅酶A底物的植物，如芥属可以使用能在植物中表达蜡合酶的DNA构建体。其它令人感兴趣的植物产生合乎需要的脂酰底物，如中长或长链脂酰分子，这些植物包括但不限于油菜(Canola品种)，向日葵，红花，棉花，萼距花，大豆，花生，椰子和油棕榈和玉米。特别令人感兴趣的是在芥菜的高芥子酸品种(HEAR)中使用这种构建体以生产长链液体蜡。HEAR植物其它预想的用途包括产生含有水平大大增加的芥子酸的品种，这是为芥子酸提供额外的蜡“库”的结果，而蜡一般储存于种子TAG中。
至于蜡合酶的脂肪醇底物，除了jojoba外，已知种子植物都不能产生大量的脂肪醇，但少量脂肪醇底物可为蜡合酶所用。因此，为了与本发明的蜡合酶构建体联合，需要提供能由宿主细胞中存在的脂酰分子生产脂肪醇的靶宿主细胞。例如，美国专利5370996中描述了植物脂酰还原酶和在植物细胞中表达还原酶的方法。该专利的图1中提供了jojoba还原酶的核酸序列和翻译的氨基酸序列。因此，通过给宿主植物细胞提供蜡合酶和还原酶蛋白，可由脂肪醇和脂酰底物生产蜡酯。另外，本发明也考虑将β-酮脂酰辅酶A合酶的表达与蜡合酶和还原酶蛋白的表达联合。凭此方法，靶植物种中这些酶的很长链的脂肪酸底物的产量会增加。
除了jojoba还原酶外，其它生物的还原酶也可用于与本发明的蜡合酶联合。还原酶其它可能的来源包括Euglena，不动杆菌，微球菌，某些昆虫和海生生物，已知含有蜡酯的专门的哺乳动物或禽组织，如牛睑板腺或禽尾脂腺。通过其产生脂肪醇的能力，或如果同时存在蜡合酶时，通过其产生蜡酯的能力可鉴定还原酶蛋白其它可能的来源。
在同一转化事件过程中可提供蜡合酶和还原酶序列，或通过用不同构建体转化可产生两个不同的转基因植物品系，一个具有蜡合酶构建体，另一个具有还原酶构建体。然后使用已知的植物繁殖技术使这些植物品系杂交以提供含有蜡合酶和还原酶的植物，所述植物可用于生产蜡酯产物。
另外，其它编码参与很长链的脂肪酸形成之酶的核酸序列也可用于本发明的DNA构建体中，从而在植物宿主中生产蜡酯。这种核酸序列是本领域已知的，也描述于美国专利5679881中。例如，如下列实施例所述，在植物表达构建体中联合使用了本发明的蜡合酶以及编码脂肪酸延长酶(描述于美国专利5679881中，其全文列入本文作为参考)和酰基辅酶A还原酶(描述于美国专利5403918中，其全文列入本文作为参考)的核酸序列。这种植物表达构建体可在转基因的拟南芥植物中产生蜡酯。
为了导致蜡酯产生的应用，需要得自在种子成熟过程中被调节之基因的5’上游非编码区，尤其是在植物胚组织中优先表达的区域，如得自ACP，油质蛋白(Lee和Huang(1991)植物生理学，96:1395-1397)和napin调节区域的区域。为了使基因产物对其它植物部分的任何破坏性的或有害的影响最小化，优先在种子组织中表达，即在其它植物部分检测不到的转录起始区域对蜡酯生产而言是合乎需要的。另外，可收获这种植物的种子，回收这些种子的液体储备物即可提供便利的蜡酯来源。因此，可在油料种子植物中生产新的种子产物，该植物未经本文所述的蜡合酶构建体转化，人们不知道它可产生蜡酯作为其种子液体储备物的成分。
根据美国专利5420034和5430194的教导，可得到和使用这种“种子-特异性的启动子”。另外，当表达植物基因，如jojoba还原酶和蜡合酶时，需要使用完整的植物基因，包括5’和3’调节区域和编码序列中存在的任何内含子以在经转化的植物种中表达jojoba基因，所述植物如拟南芥属或芥属。
本发明的重组构建体也可提供调节转录终止区域。编码植物蜡合酶的DNA序列或得自不同基因来源的方便的转录终止区域，尤其是与转录起始区域天然相关的转录终止区域都可提供转录终止区域。转录终止区域可含有至少约0.5kb，优选约1-3kb的序列，该序列位于衍生得到终止区域的结构基因的3’端。
也可使用其它的植物基因区域使植物组织中蜡合酶和还原酶基因的表达最优化。例如，插入DNA编码序列5’端的高表达基因，如RuBP-羧化酶小亚单位(SSU)的5’非翻译区域可使翻译效力增强。在此构建体中也可使用SSU前导蛋白的部分编码区(如编码前6个氨基酸的区域)。另外，对于需要靶向植物质体细胞器的应用而言，可将得自SSU或其它核-编码的叶绿体蛋白的转运肽编码序列与蜡合酶和还原酶序列联合使用。
根据将DNA表达构建体导入宿主细胞的方法，也需要其它DNA序列。重要的是，本发明适用于双子叶和单子叶的种，也易于适用于新的和/或改善的转化和再生技术。
在研制重组构建体时，一般将构建体的多种组分或其片断插入能在细菌宿主，如大肠杆菌中复制的方便的克隆载体中。文献中已描述了多种此类载体。每次克隆之后，分离质粒并对其进行进一步的操作，如限制性酶切，插入新片断，连接，缺失，插入，再切割等以制作所需序列的组分。一旦构建体完成之后，根据转化宿主细胞的方法将其转移至适当的载体中以进行进一步的操作。
重组构建体一般包括结构基因，该基因具有在宿主中表达所必需的调节区域，并为转化子细胞提供选择。该基因可提供对细胞毒性剂，如抗生素，重金属，毒素等的抗性，为营养缺陷型宿主提供原养型的互补作用，病毒免疫力等。类似地，能产生可通过颜色改变(如GUS)或发光(如萤光素酶)而被鉴定之化合物的酶的编码基因是有用的。根据不同宿主种的数目，导入表达构建体或其组分，可使用一个或多个标记，其中对不同的宿主使用不同的选择条件。
除了用于转录蜡合酶序列的序列外，本发明的DNA构建体也可表达一个或多个其它基因，其蛋白质产物可与蜡合酶联合作用以产生有价值的末端产物。例如，如上文所讨论，本发明也包括能表达蜡合酶和脂酰还原酶从而在转化宿主中产生蜡酯的DNA构建体。另外，需要产生具有不同碳链长度和饱和程度的不同的蜡酯，通过转化具有不同链长度之脂肪醇或脂酰底物的宿主植物即可实现这一目的。公开的国际专利申请PCT WO91/16421中所述的方法可提供这种植物，该专利申请中描述了多种硫酯酶和在转化的植物宿主中使用这种基因产生具有不同链长度的脂酰底物的方法。
另外，为了使油料植物宿主中的蜡酯生产最优化，人们希望能降低一般由此类植物的种子产生的三酰甘油的量。实现此目的的一个方法是使基因成为反义基因，该基因对此过程是至关重要的，但对蜡酯生产而言为非必需的。这种基因靶包括二酰甘油酰基转移酶，和催化三酰甘油合成的其它酶。另外，需要为油料植物提供可用于降解作为营养源的蜡酯的酶，例如，所述酶可分离自jojoba或能产生蜡的多种其它生物。凭此方法，可在种子植物宿主中产生最大量的蜡酯。
可使用从jojoba中提取蜡的技术或通过从多种油料作物中得到油产物所用的多种生产方法，收获本文所述的方法中产生的蜡酯。如此得到的蜡可用于很多工业中，包括药品，化妆品，去污剂，塑料和润滑剂。根据蜡酯成分的链长度和饱和程度的不同，其应用也有所不同。例如，每个碳链具有双带的长链蜡在室温下为液体，而具有饱和碳链成分的蜡在室温下为固体，尤其是如果饱和碳链是较长的碳链时更是如此。
本发明对转化方法的要求并不严格；目前可以使用多种植物转化方法。由于可使用较新的方法转化作物，下文中可直接使用这些方法。例如，通过农杆菌介导之转化的三联或二元载体法可成功地转化很多对农杆菌感染天然易感的植物种。其它可用于将核酸序列转移至宿主植物细胞的序列可得自植物病原体病毒或植物转座因子。另外，已研制出微量注射，DNA颗粒轰击，电穿孔技术，这些技术可转化多种单子叶和双子叶植物的种。
本文一般性地描述了本发明，参照下列实施例将更易于理解本发明，除非特别说明，本文的实施例只是为了阐明本发明，而不想限制本发明的范围。
在玻璃管中制备底物混合物，使用前即时加入油醇，再加至样品中，于30℃保温达1小时。通过将检测管置于冰上并立即加入0.25ml异丙醇∶醋酸(4∶1v/v)以终止检测。加入未经标记的蜡酯(0.1mg)和油醇(0.1mg)作为载体。通过Hara和Radin(分析生物化学(1978)90:420)的小规模方法提取[14C]脂质。在终止反应的检测管中加入2ml己烷/异丙醇(3∶2,v/v)，旋动样品，加入1ml硫酸钠水溶液(6.6％w/v)，再次旋动样品。C．检测溶解的蜡合酶的活性在250μl含有40μM 1-14C-16:0辅酶A(5Ci/mol),200μM 18:1-OH,0.07％大豆磷脂(Sigma,P-3644),0.2％CHAPS,280mM NaCl,25mM Tricine-NaOH,pH7.8,2mM β-ME和5.6％甘油的检测溶液中使用达50μl的样品检测溶解的蜡合酶。直接在溶于1％CHAPS的样品中加入磷脂(溶于0.5％CHAPS中，浓度为50mg/ml)，然后用含有其余检测组分的混合物稀释。根据蜡合酶掺入磷脂载体这一现象足以推定活性的重建。蜡合酶对去污剂敏感，需要检测溶液中磷脂(PL)和去污剂(CHAPS)的量平衡于2.8/l(CHAPS/PL,w/w)才能达到最大的活性。由于CHAPS的浓度，检测经超滤浓缩的样品中的蜡合酶活性需要再次调整所测样品的体积。在检测溶液中导入太多的CHAPS会导致活性受抑制。如果样品是通过超滤浓缩的，通过使用少量样品，以固定浓度的磷脂和NaCl检测，绘制检测溶液中％CHAPS的浓度曲线，即可重新确定待测样品的最适体积。相对于CHAPS浓度的变化而言，蜡合酶对PL浓度的变化较不敏感。D．分析检测产物为了分析微粒体膜制品蜡合酶检测产物或溶解的蜡合酶检测产物，研制出两种方案。一个方案(下文称之为“深入检测法”)较费时，但能产生高度定量的结果。另一种方案(下文称之为“快速检测法”)也可测定蜡合酶的活性，但该方法较迅速，更加方便和定量性较差。
1．深入分析加入硫酸钠并旋动样品之后，除去上层的有机相，用4ml己烷/异丙醇(7∶2v/v)洗涤下层的水相。集中有机相，在氮气中蒸发至干。将脂质残留物重新悬浮于少量己烷中，通过液体闪烁计数检测等分试样中的放射性。其余的样品可用于标记类别的TLC分析，从而测定所产生蜡的总量。
为了进行脂质类别的分析，将样品上样于二氧化硅TLC板上，将板置于己烷/二乙酯/醋酸(80∶20∶1或70∶30∶2v/v/v)中展开。使用AMBIS放射性分析成像系统(AMBIS Systems公司，San Diego,CA)测定脂质类，大的蜡酯，游离的脂肪酸，脂肪醇和极性脂质之间的放射性分布。必要时，从TLC板上回收各个脂质类别以进一步分析。此分析中还使用了反相TLC系统，该系统使用的是在甲醇中展开的C18板。
2．快速分析加入硫酸钠并旋动样品之后，除去已知百分比的有机相，并通过液体闪烁计数器进行计数。使用此计算估计有机相中的总数。然后，除去有机相的另一部分，在氮气中干燥，重新溶解于己烷中，并点在TLC板上，展开，按详细检测法中所述进行扫描。凭此方法测定掺入蜡中的总数的百分比。实施例2进一步研究以鉴定蜡合酶的活性A．种子发育和蜡合酶活性的分布图对Davis,CA5种植物的胚发育追踪研究2个夏天。约从第80天至约第130天，观察到胚的湿重和干重以完全不变的速率增加。脂质提取表明当胚的湿重达约300mg时(约第80天)，脂质重量对干重的比例达到最高水平的50％。
按实施例1B所述测定发育的胚中的蜡合酶活性。对jojoba而言，种皮被确定为抑制因子的来源，应先除去种皮，再在液氮中冷冻胚，置于-70℃下保存。
在无细胞匀浆物或膜组分中测定的蜡合酶活性的发育分布图显示出开花后约110-115天对活性的诱导最大。因此，收获开花后约90至110天的胚用于酶学研究，其间蜡合酶活性高，脂质储备未达到最高水平，易于除去种皮。开花后80至90天之间观察到蜡合酶活性以最高的速率增加。因此，收获开花后约80至90天的胚用于构建cDNA文库，其间蜡合酶蛋白的合成速率可能最高。相应地，在此阶段，编码蜡合酶的mRNA的水平也可能最高。B．微粒体膜制品通过测定胚中的水含量(45-70％)，收获开花后约90至110天的jojoba胚。除去外壳和种皮，在液氮中快速冷冻子叶，储存于-70℃中待用。为了初步制备蛋白质，通过在液氮温度下用钢制碾钵和碾槌研磨使冷冻的胚变为粉末。在典型的实验中，需加工70g胚。
在下列高盐溶液中以280ml溶液70g胚的比例加入粉末3MNaCl,0.3M蔗糖，100mM HEPES,2mM DTT和蛋白酶抑制剂，1mMEDTA,0.7mg/ml亮抑蛋白酶肽，0.5mg/ml抑胃酶肽和17mg/mlPMSF。用组织匀浆器(Kinematica,Switzerland；PT10/35型)使粉末状的胚分散于缓冲液中约30秒，然后穿过3层Miracloth(CalBioChem,LaJolla,CA)进行过滤以形成无细胞的匀浆物(CFH)。100,000×g离心滤出物达1小时。
所得样品由沉淀物，上清液和飘浮的脂肪层组成。除去脂肪层，收集上清液部分，对含有1M NaCl,100mM HEPES,2mM DTT和0.5MEDTA的溶液透析过夜(3次改变缓冲溶液)。200,000×g离心透析物达1个半小时以产生沉淀物DP2。以原始CFH体积的1/20，将沉淀物悬浮于25mM HEPES和10％甘油中，产生微粒体膜制品。
按实施例1所述检测活性，据估计蜡合酶活性的回收率为无细胞匀浆物原始活性的34％。当储存于-70℃时，此制品中的蜡合酶活性是稳定的。C．底物特异性在按上述制备的微粒体膜组分中加入具有不同碳链长度和不饱和程度的酰基辅酶A和醇底物以测定jojoba蜡合酶所识别底物的范围。按实施例1B所述测定蜡合酶活性，使用80mM酰基辅酶A底物和100mM经放射性标记的油醇测定酰基特异性。使用100mM醇底物和40mM经放射性标记的eicosenoyl-辅酶A测定醇特异性。这些实验的结果示于下表1。表1jojoba蜡合酶的酰基和醇底物特异性底物 蜡合酶活性(pmol/min)结构 酰基 醇基12:0 12 10014:0 95 14516:0 81 10718:0 51 5620:0 49 2122:0 46 1718:1 22 11018:2 712320:1 122 7222:1 39 4124:1 35 24上述结果表明jojoba蜡合酶利用宽范围的脂酰辅酶A和脂肪醇底物。
另外，使用棕榈酰辅酶A，棕榈酰ACP和N-乙酰基-S-棕榈酰半胱胺作为酰基底物，类似地检测针对多种酰基-硫酯底物的蜡合酶活性。用酰基辅酶A底物观察到最大活性。用酰基ACP观察到显著活性(为酰基辅酶A的约10％)，但用N-乙酰基-S-棕榈酰半胱胺底物检测不到活性。D．活性的效应物筛选多种sulphydryl试剂对蜡合酶活性的影响。有机汞化合物可强烈地抑制活性。碘乙酰胺和N-乙基马来酰胺不太有效。观察到对羟基汞基苯甲酸的抑制作用，但随后加入DTT可逆转这种抑制作用。这些结果表明对羟基汞基苯甲酸的抑制作用涉及必需sulphydryl基团的封闭。实施例3纯化jojoba蜡合酶下文描述了分离具有蜡合酶活性的jojoba膜制品，溶解蜡合酶活性和进一步纯化蜡合酶蛋白所用的方法。A．微粒体膜制品使用经以下改动后的实施例2所述方法，该方法提供改良的膜组分，可用于从溶解的膜中纯化蜡合酶。
一般在400ml提取缓冲液(40mM Tricine-NaOH,pH7.8,200mMKCl,10mM EDTA,5mMβ-巯基乙醇)中加入100g jojoba胚，在捣碎机中研磨，用Polytron组织粉碎机匀浆。随后的所有步骤都在4℃中进行，将粉碎的材料通过Miracloth(CalBioChem)进行过滤，离心(20,000×g；20分钟)滤出物产生飘浮的蜡层，混浊的上清液组分和深绿色的沉淀物。收集上清液组分，离心(100,000×g；2小时)得到膜沉淀物，然后将沉淀物重新悬浮于40ml含有50％(w/v)蔗糖的缓冲液A(25mMTricine-NaOH,pH7.8,200mM KCl,5mM EDTA,5mMβ-巯基乙醇)中。将匀浆物分布于4个SW28离心管(Beckman)中，各用10ml含有20％蔗糖的缓冲液A覆盖，然后用13ml缓冲液A覆盖。离心(28,000rpm；2小时)之后，从20％/50％蔗糖界面处收集膜组分，用4倍体积的缓冲液A稀释，离心(200,000×g；1小时)收集膜组分。然后用10ml储存缓冲液[25mM Tricine-NaOH,pH7.8,1M NaCl,10％(w/v)甘油，5mMβ-巯基乙醇]使膜成为匀浆。通过此方法制备之膜的蛋白质浓度一般为7至9mg/ml。按文献(Bradford,1976)所述，使用BSA作为蛋白质标准估计蛋白质浓度。B．溶解蜡合酶蛋白通过用储存缓冲液(25mM Tricine-NaOH,pH7.8,1M NaCl,10％甘油，5mM β-巯基乙醇)稀释将膜悬浮液调整为每ml约0.83mg蛋白质。加入固体的3-([3-胆酰胺丙基]二乙铵)-1-丙磺酸(CHAPS)使终浓度为2％(w/v)，去污剂与蛋白质的比例为24∶1。在冰上保温1小时之后，离心(200,000g；1小时)样品，收集上清液组分。C．纯化蜡合酶活性(用0.57％CHAPS,25mM Tricine-NaOH,pH7.8,20％甘油)稀释200,000g上清液组分，使NaCl和CHAPS的终浓度分别为0.3M和1％。将样品上样于预先用含有0.3M NaCl的缓冲液B(25mM Tricine-NaOH,pH7.8,1％CHAPS,20％甘油)平衡过的Blue A-琼脂糖(Amicon公司，Beverly,MA)柱上。用平衡缓冲液洗涤之后，用含有2M NaCl的缓冲液B洗脱蜡合酶活性。收集从Blue A柱上洗脱的活性组分(BluePool)，用于进一步的层析。
使用两个纯化方案进行带鉴定并进一步纯化蜡合酶蛋白。在方案1(图1)中，通过在装配有YM 30膜的压力室(Amicon公司，Beverly,MA)中进行超滤将Blue Pool浓缩5.4倍。将一半浓缩物上样于用含有2M NaCl的缓冲液B平衡过的陶瓷羟基磷灰石(CHT)柱(Bio-ScaleCHT-2；Bio-Rad,Hercules,CA)。用6倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱，用含有0.1M磷酸二钾和2M NaCl的缓冲液B洗脱结合的蛋白质。再次平衡CHT柱之后，以相同的方法层析另一半Blue Pool浓缩物。为了检测活性，根据超滤浓缩之样品所用的方法检测蜡合酶。在流过液和洗涤液中观察到在CHT-Run 1上测定的蜡合酶活性。两次CHT层析的蛋白质分布图相同，因此未检测CHT-run 2。收集两次CHT层析的活性组分，浓缩10倍，上样于用含有1.0M NaCl的缓冲液B平衡过的Sephacryl S100 HR柱(2.5×90cm)。进行蛋白质和活性测定，从活性最大蛋白质最少的层析保留部分中选择活性组分。将S100集中物(组分64-70)上样于用含有1M NaCl的缓冲液B平衡过的晶体羟基磷灰石(HA)柱(Bio-Gel HT；Bio-Rad,Hercules,CA,1×19.3cm)。大多数蜡合酶活性又存在于流过液和洗涤液中。用含有0.1M磷酸二钾和1M NaCl的缓冲液B洗脱结合的蛋白质。通过SDS-PAGE检查最终HA层析的组分。在SDS-PAGE上迁移至33KD的单个蛋白质与蜡合酶活性的存在相关。
在第二次制备(方案2，图2)中，将Blue Pool不经浓缩直接上样于用含有1M NaCl的缓冲液B平衡过的晶体HA柱(1×11.7cm)。选择两个组分，通过在用25mM Tricine-NaOH,pH7.8,1％CHAPS,20％甘油，1M NaCl平衡过的Superdex75 HR 10/30柱(Bio-Rad,Hercules,CA；大小范围5000-75,000道尔顿)上进行大小排阻层析以进一步纯化之。根据实施例1C中的溶解样品所用的方法测定蜡合酶活性。一个组分较早地在HA柱的流过液中被洗脱下来(组分31)，另一个组分在洗涤液中被洗脱下来(组分67)。根据SDS-PAGE分析，两个组分的蛋白质分布图是不同的。通过梯度SDS-PAGE检查两个Superdex 75层析，经鉴定，约33KD的蛋白质与活性一起被层析。使用在相同缓冲液和柱条件下层析的分子量标准绘制校正曲线。将蜡合酶活性峰值的洗脱体积与此标准曲线相比较，得出溶解酶的分子量为48KD。
描述了方案1的蜡合酶纯化的表(表2)显示出将溶解的蛋白质组分中的酶纯化了150倍。表2纯化jojoba蜡合酶纯化步骤酶活 性产量％ 蛋白质比活(nmol/纯 化(nmol/min) (mg) min/mg) (倍数)溶解的组分 274.4100 415 0.71Blue A琼脂糖214.778.2 1514.3 22陶瓷羟基磷灰石 176.664.3 6.4 27.6 42Sephacryl S-100(大小)41.3 15.1 1.2 33.1 50羟基磷灰石(晶体) 18.8 6.9 0.2 99.2 150D.SDS PAGE分析用SDS PAGE缓冲液(1×缓冲液=2％SDS,250mM β-巯基乙醇，0.0025％溴酚蓝)稀释得自柱组分的样品，通过电泳进行分析。根据Laemmli(自然(1970)227:680-685)的方法，经Delepelaire(Proc.Nat.Acad.Sci(1979)76:111-115)稍加改动后进行聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(10-13％)。上方储液槽缓冲液所用十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度为0.1％，但下方储液槽缓冲液，积层和分离胶中却不含SDS。积层胶含有5％ 30％的丙烯酰胺储液(29.2％丙烯酰胺，0.8％N,N’-双-亚甲丙烯酰胺，w/v),0.06％过硫酸铵(w/v)和0.1％TEMED(v/v)。分离胶含有10-13％线性梯度的丙烯酰胺储液，该储液是通过0-10％线性梯度的蔗糖稳定化的。室温下，以150V的恒定电压电泳9至10小时。通过根据Blum等(电泳(1987)8:93-99)的银染法或考马斯蓝(0.1％考马斯蓝R-250,50％甲醇，10％醋酸)染色法观察蛋白质。直至通过羟基磷灰石柱进行纯化，被鉴定为蜡合酶的33KD蛋白质似乎才是活性组分的主要成分。纯化方案1(实施例3C)之后，与最终柱上的活性相关的唯一蛋白质是33KD的蛋白质。实施例4制备蛋白质用于凝胶内消化A．离心制备样品用于SDS-PAGE
收集最终HA柱(方案1)之流过液/洗涤液中的奇数组分，在装配有YM 30膜的压力室(Amicon公司，Beverly,MA)中进行超滤将收集物浓缩3倍。使用两个Centricon-30装置(Amicon公司，Beverly,MA)将样品进一步浓缩至约50μl的体积。用6μl SDS混合物(4μl 20％ SDS,1μl 14.3M β-巯基乙醇和1μl 0.1％溴酚蓝)处理各个样品。室温下放置15分钟之后，将样品上样于10-13％丙烯酰胺梯度凝胶(实施例3D)(16×16cm×1mm厚)，通过以150V的恒定电压电泳9.5小时以分离蛋白质。用50％甲醇和10％醋酸中的0.1％考马斯蓝将凝胶染色15分钟，然后用50％甲醇和10％醋酸去染色2×20分钟。从凝胶上切下33KD的蜡合酶带，用50％乙醇去染色3×20分钟。一个泳道含有一系列蛋白质，最终的消化不使用该泳道。B．沉淀制各样品用于SDS-PAGE贯穿柱分布图，分3组收集最终HA柱(方案1)之偶数组分的等分试样(0.8ml)。将收集物等分于3个1.5ml的小管中。加入0.2ml 40％TCA沉淀蛋白质，置于冰上放置30分钟之后，离心(12,000×g,15分钟，4℃)样品以沉淀沉淀的蛋白质。除去上清液，用0.6ml冰冷的丙酮将沉淀物洗涤两次。通过将缓冲液从一个小管中转移至另一个小管中，用相同的50μl SDS样品缓冲液重新悬浮各个收集样品系列的最终3个沉淀物。用10μl样品缓冲液洗涤已经重新悬浮过的空管，使各个收集样品的总的重悬浮体积为60μl。将样品上样于12％丙烯酰胺Tris/Glycine微量凝胶(Novex,San Diego,CA,1.5mm×10孔)，从凝胶底部洗脱染料之后，通过以150V的恒定电压电泳20分钟以分离蛋白质。用考马斯蓝染色凝胶，使用Gel-Clear(Novex,San Diego,CA)去染色。从凝胶上代表柱峰和尾组分的3个不等泳道上切下蜡合酶，将凝胶切片置于1.5ml小管中，用1ml 50％甲醇和10％醋酸去染色2小时。除去去染色溶液，用液氮冷冻凝胶切片并置于干冰上过夜，送至耶鲁大学W M Keck Foundaion Biotechnology Resource Laboratory进行凝胶内消化。收集超滤浓缩样品的一个凝胶切片和沉淀浓缩样品的3个凝胶切片用于凝胶内的胰蛋白酶消化。实施例5测定氨基酸序列在耶鲁大学W M Keck Foundation Biotechnology ResourceLaboratory进行蛋白质测序。方法包括对部分凝胶切片(10-15％)进行氨基酸分析以定量和确定氨基酸组成，用一种蛋白酶(胰蛋白酶或赖氨酰内肽酶)消化蛋白质，并通过反相HPLC分组分离产物。从HPLC层析中选择吸收峰，对其进行激光解吸质谱分析法以在进行蛋白质测序之前测定肽的存在，量和质。选择最长的肽进行微量测序。
使用单字母密码，将经胰蛋白酶消化所得的jojoba蜡合酶肽的氨基酸序列示于下表3。表3 jojoba蜡合酶胰蛋白酶肽的氨基酸序列WSpep29FVPAVAPHGGALRWSpep33TIDEYPVMFNYTQK实施例6纯化其它的蜡合酶和还原酶A．下文描述了改变jojoba蜡合酶的溶解和纯化方法以从其它生物体中得到部分纯化的蜡合酶制品。不动杆菌在ECLB(大肠杆菌luria肉汤)上培养醋酸钙不动杆菌菌株BD413(ATCC#33305)的细胞，在对数生长期收集细胞并使用于0.1MNaCl,1mM DTT和蛋白酶抑制剂中的含有HEPES-NaOH,pH7.5或Tricine-NaOH pH7.8的缓冲液洗涤细胞。将经洗涤的细胞重新悬浮于新鲜缓冲液中，穿过French压力室以破碎细胞(以约16,000p.s.i.穿过两次)。5000×g离心10分钟以除去未破碎的细胞，100,000×g离心1小时以收集膜。用储存缓冲液(25mM HEPES-NaOH,pH7.5或25mMTricine-NaOH,pH7.8于10％(w/v)甘油，100mM NaCl中)匀浆膜沉淀物。使用实施例1B中jojoba酶的检测条件，使用[1-14C]棕榈酰辅酶A和18∶1的醇作为底物检测这些膜中的蜡合酶活性。
通过在0.5M NaCl的存在下，使去污剂与蛋白质的比例为5∶1，将膜与2％CHAPS保温以溶解蜡合酶活性。200,000g离心1小时，进行大小排阻层析，然后通过检测上清液组分中的蜡合酶活性来阐明活性的溶解(即从柱中洗脱下来的活性在残留的组分中为对称的峰)。只需将CHAPS的浓度稀释为约0.3％(即低于其CMC)即可检测溶解酶的活性。检测溶解的活性无需将酶掺入磷脂载体中。
为了进行纯化，按类似于jojoba蜡合酶的层析方法，对溶解的不动杆菌蜡合酶活性进行层析。在一个方案中，将溶解的蛋白质制品上样于低盐条件(100mM NaCl，于含有0.75％CHAPS,10％甘油，25mMHEPES-NaOH,pH7.5的柱缓冲液中)下的Blue A琼脂糖柱，使用含1.0M NaCl的柱缓冲液从柱上洗脱蛋白质。
在Superose 12(Pharmacia；Piscataway,NJ)介质上进行大小排阻层析，估计出天然酶的大小。与在相同条件下进行层析的分子量标准进行比较，得出溶解的蜡合酶的表观分子量约为40KD。
在另一个方案中，将溶解的蛋白质上样于用含有0.1M NaCl的25mM Tricine-NaOH,pH7.8,1％CHAPS,20％甘油平衡过的Blue A柱，并用含有1.0M NaCl的相同缓冲液洗脱。然后将洗脱下来的物质上样于用含有1.0M NaCl的柱缓冲液平衡过的羟基磷灰石柱，与jojoba蜡合酶不同，不动杆菌蜡合酶活性与柱结合，用1-100mM磷酸二钾的梯度洗脱之。当通过SDS-PAGE检查时，几个候选蛋白质与蜡合酶活性相关。Euglena于26℃左右，在黑暗中中度振荡以异养培养Euglena gracilis菌株Z(ATCC 12716)(Tani等，1987，农业生物化学，51:225-230)。收集细胞，用含有25mM Bis-Tris-Propane,pH7.0,0.25M NaCl和1mM EDTA的缓冲液洗涤细胞。将经洗涤的细胞重新悬浮于新鲜缓冲液中，穿过French压力室以破碎细胞(以约16,000p.s.i.穿过两次)。20,000×g离心20分钟以除去未破碎的细胞，细胞碎片和核，200,000×g离心1小时以收集微粒体膜。用储存缓冲液(25mM Bis-Tris-Propane,pH7.0,0.25MNaCl,10％(w/v)甘油和1mM EDTA)匀浆膜沉淀物。使用jojoba酶的检测条件检测这些膜中的蜡合酶活性，经放射性标记的底物与jojoba实施例中的相同(即[1-14C]棕榈酰辅酶A)，但16:0而不是18:1被用作醇受体，使用了pH7.0的Bis-Tris-Propane缓冲液。
通过在0.5M NaCl的存在下，将膜与2％CHAPS保温以溶解Euglena蜡合酶活性。200,000g离心1小时之后，通过检测上清液组分中的酶活性来阐明蛋白质的溶解。只需将CHAPS的浓度稀释为约0.3％(即低于其CMC)即可检测溶解酶的活性。无需象溶解的jojoba蜡合酶一样将酶掺入磷脂载体中。
为了进行部分纯化，在Blue A琼脂糖介质上对溶解的Euglena蜡合酶活性进行层析分离，此柱用含有0.1M NaCl的柱缓冲液平衡过，所述缓冲液含有25mM Bis-Tris-Propane,pH7.0,20％(w/v)甘油，0.75％CHAPS和1mM EDTA。将含有溶解的蜡合酶活性的样品稀释至0.1MNaCl，并上样于1×7cm柱(5.5ml床体积)。用平衡缓冲液洗涤柱，并用柱缓冲液中的线性NaCl梯度(0.1M至1.0M NaCl)洗涤柱。在后一半盐梯度中，蜡合酶活性被洗脱为宽峰。
柱组分的SDS-PAGE分析结果揭示出从柱上洗脱下来的活性的多肽复杂度相对于上样的物质而言大大降低。据观察，表观分子量约为41KD的多肽与柱组分中的蜡合酶活性一起出现。进行与jojoba和不动杆菌相同的进一步的纯化技术以证实蜡合酶活性与约41KD肽的相关性。
为了进一步分析Euglena的蜡合酶活性，按下述进行大小排阻层析。由在黑暗中生长于液体异养培养基(Tani等，文献同上)上的Euglena细胞得到微粒体膜制品。在冰上用缓冲溶液(25mM Bis-Tris,pH7.0,1mM EDTA和10％(w/v)甘油)中的2％(w/v)CHAPS和500mMNaCl将膜处理1小时，籍此溶解蜡合酶活性。加入稀释缓冲液将CHAPS稀释至0.75％,NaCl稀释至200mM之后，以约200,000×g将样品离心1.5小时。将上清液组分上样于用也含有200mM NaCl的柱缓冲液(25mM Bis-Tris,pH7.0,1mM EDTA,10％甘油，0.75％CHAPS)预平衡过的Blue A染料柱。用含有200mM NaCl的柱缓冲液洗涤柱直至流出液的A280回复至上样前的值。通过将柱缓冲液中的NaCl浓度增加至1.5M以释放与柱结合的蜡合酶活性。收集含有用1.5MNaCl释放的蜡合酶活性的Blue A柱组分(总体积约为20ml)，经(装配有YM30膜的Amicon压力室)超滤浓缩约30倍。将得自Blue A柱的浓缩物质用作样品，通过在Superose12介质(Pharmacia)上的大小排阻层析进行分离。将约200μl样品上样于预先用含有0.5M NaCl的柱缓冲液平衡过的Superose 12柱(HR 10/30)，以0.1ml/min的流速展开。从柱上洗脱作为平滑峰存在的蜡合酶活性。将蜡合酶活性的洗脱体积与分子量标准蛋白质的洗脱分布图相比较，得到表观分子量约为166KD的酶。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着进行银染以分析含有蜡合酶活性的组分。对多个组分多肽分布图的初步分析未显示出任何染色强度似乎与活性分布图匹配的分子量为100KD或以上的蛋白质。蜡合酶多肽以样品混合物中的少量组分存在，在银染的凝胶上不容易检测到。或者，酶是由在SDS-PAGE的过程中解离的亚单位组成。B．除了jojoba还原酶，如由图1提供的序列编码的还原酶外，也需要其它来源的还原酶蛋白以与本发明的蜡合酶蛋白联合使用。可从已知可由醇和酰基底物产生蜡酯的生物体中鉴定和得到这种蛋白质。
例如，可从分离自Euglena gracilis的微粒体膜中得到依赖于NADH的脂酰辅酶A还原酶活性。用于分离微粒体膜的方法描述于例如公开的PCT专利申请WO 92/14816(1992年2月21日提交的申请号PCT/US92/03164)。使用与jojoba还原酶和蜡合酶所用相同的方法，从这些膜中溶解还原酶活性。于冰上，在由25mM BisTris,pH6.9,250mM NaCl,10％甘油和1mM EDTA组成的缓冲溶液中将膜与不同量的去污剂CHAPS保温1小时。然后以200,000×g离心样品1小时，使用经放射性标记的棕榈酰辅酶A和NADH作为底物，检测上清液和沉淀物组分的依赖于NADH的还原酶活性。还原酶活性方便的检测方法描述于PCT专利申请WO 92/14816中。将膜与0.3,0.5或0.7％(w/v)CHAPS一起保温，导致上清液组分中保留了还原酶活性，这显示出酶的溶解。如果在保温和离心的过程中省去CHAPS，所有还原酶活性都发现于沉淀物组分中。检测前用相同的缓冲溶液将所有样品稀释10倍以稀释保温过程中存在的CHAPS。检测时CHAPS的存在水平大于CMC(约0.5％(w/v))会抑制酶活性。通过将缓冲溶液中的甘油浓度增加至20％可改善高达2％的CHAPS中的还原酶活性的稳定性。通过将CHAPS稀释至CMC以下以回收还原酶活性。实施例7分离蜡合酶核酸序列使用由蜡合酶肽序列设计的合成寡核苷酸，从jojoba得到编码蜡合酶肽的DNA序列。使用寡核苷酸作为引物，经聚合酶链反应(PCR)扩增DNA可得到蜡合酶的核酸序列，或者，通过放射性标记寡核苷酸或先前分离的序列用作探针，筛选cDNA或基因组DNA文库也可得到蜡合酶核酸序列。A．构建jojoba cDNA文库使用多核糖体分离法从开花后80至90天收集的jojoba胚中分离RNA，所述方法起初是由Jackson和Larkins描述的(植物生理学(1976)57:5-10)，后经Goldberg等改良(发育生物学(1981)83:201-217)。在此方法中，除非特别说明，所有步骤都在4℃下进行。在液氮中，将10gm组织置于Waring捣碎机中研磨直至组织变成细粉末。蒸发液氮之后，加入170ml提取缓冲液(200mM Tris pH9.0,160mM KCl,25mM EGTA,70mM MgCl2,1％Triton X-100,0.5％脱氧胆酸钠，1mM亚精胺，10mMβ-巯基乙醇和500mM蔗糖)，将组织匀浆约2分钟。使匀浆物穿过无菌的miracloth过滤，12,000×g离心20分钟。将上清液倾析至500ml的无菌烧瓶中，室温下加入1/19体积的20％去污剂溶液(20％ Brij35,20％吐温40,20％Noidet p-40 w/v)。4℃下以中等速度将溶液搅拌30分钟，12,000×g离心上清液30分钟。
将约30ml上清液等分至无菌的Ti 60离心管中，覆盖7ml含有40mM Tris pH9.0,5mM EGTA,200mM KCl,30mM MgCl2,1.8M蔗糖，5mM β-巯基乙醇的溶液。用提取缓冲液将管充满至顶端，4℃下，在Ti 60转子中，以60,000rpm离心4小时。离心之后，吸出上清液，在各个管中加入0.5ml重新悬浮缓冲液(40mM Tris pH9.0,5mM EGTA,200mM KCl,30mM MgCl2,5mM β-巯基乙醇)。将管置于冰上10分钟，然后彻底重新悬浮和收集沉淀物。以120×g离心上清液10分钟以除去不溶解的物质，在上清液中加入1倍体积溶于20mM Tris pH7.6,200mM EDTA,2％N-十二烷基-肌氨酸盐中的自身消化的1mg/ml蛋白酶K，室温下保温混合物30分钟。
加入1/10体积的醋酸钠和2倍体积的乙醇以沉淀RNA，-20℃放置几个小时之后，于4℃，以12,000×g离心30分钟以沉淀RNA,将沉淀物重新悬浮于10ml TE缓冲液(10mM Tris,1mM EDTA)中，用等体积的经Tris pH7.5饱和的苯酚提取RNA。于4℃，以10,000×g离心20分钟以分离相。除去水相，用1倍体积的TE缓冲液重新提取有机相。然后收集水相，用1倍体积的氯仿提取水相。按前述通过离心再次分离相，用乙醇沉淀水相，产生多核糖体RNA。
通过将RNA穿过高盐缓冲液(0.5M NaCl,20mM Tris pH7.5,1mMEDTA,0.1％SDS)中的纤维素柱(Sigma-cell 50)以除去多核糖体RNA制品中的多糖污染物。污染物与柱结合，RNA集中于洗脱物中。集中洗脱物组分，用乙醇沉淀RNA。然后将沉淀的总RNA重新悬浮于较小的体积中，并上样于寡d(T)纤维素柱中以分离聚腺苷酸化的RNA。
使用聚腺苷酸化的RNA在质粒克隆载体pCGN1703中构建cDNA文库，所述载体衍生自商购的克隆载体Bluescribe M13-(Stratagene Cloning Systems；San Diego,CA)，是按下述制备的。通过用BamHⅠ消化改变Bluescribe M13-的多接头，用绿豆内切核酸酶处理，平端连接以产生缺失BamHⅠ的质粒pCGN1700。用EcoRⅠ和SstⅠ(邻接的限制性位点)消化pCGN1700，并与合成的接头退火，该接头具有限制性位点BamHⅠ,PstⅠ,XbaⅠ,ApaⅠ和SmaⅠ,5’突出端AATT和3’突出端TCGA。将接头插入pCGN1700消除了EcoRⅠ位点，重新产生了Bluescribe中具有的SstⅠ(本文中有时也称之为“SacⅠ”)位点，增加了接头中所含的新的限制性位点。用HindⅢ消化所得质粒pCGN1702，用Klenow酶使其成为平端；用PvuⅡ部分消化线性DNA，在稀释溶液中与T4 DNA蜡合酶连接。选择lac启动子区域缺失的转化子(pCGN1703)，将其用作质粒克隆载体。
简单地说，cDNA合成的克隆方法如下所述。用SstⅠ消化质粒克隆载体，使用末端脱氧核苷酸转移酶在所得的3’-突出粘端产生同聚物T-尾。通过寡(dA)-纤维素层析从未经消化或未加尾的质粒中分离加尾的质粒。将所得载体用作引物以合成与载体质粒的任一端共价结合的cDNA第一条链。在脱氧鸟苷三磷酸的存在下，用末端转移酶处理cDNA-mRNA-载体复合物，在cDNA链的末端产生G-尾。通过BamHⅠ消化除去与BamHⅠ位点邻接的多余的cDNA-mRNA-复合物，剩下一端具有BamHⅠ粘端，另一端具有G-尾的cDNA-mRNA-载体复合物。使用具有5’BamHⅠ粘端，限制性酶NotⅠ,EcoRⅠ和SstⅠ的识别序列和3’C-尾末端的退火的合成环化接头环化此复合物。连接和修复之后，用环化的复合物转化大肠杆菌菌株DH5α(BRL,Gaithersburg,MD)以产生cDNA文库。jojoba胚cDNA库含有约1.5×106个克隆，平均cDNA插入物的大小约为500个碱基对。
另外，还使用jojoba聚腺苷酸化的RNA在克隆载体IZAPⅡ/EcoRⅠ(Stratagene,San Diego,CA)中构建cDNA文库。使用厂商提供的方法，DNA和细菌菌株构建文库。根据厂商的推荐，使用GigapackGold包装提取物(Stratagene)包装克隆。按此方法构建的cDNA文库含有约1×106个克隆，平均cDNA插入物的大小约为400个碱基对。B．合成的寡核苷酸一般说来，为了用作由mRNA逆转录的单链DNA模板的PCR引物，制备含有对应于蜡合酶肽编码序列之有义序列的寡核苷酸。这些寡核苷酸被用作“正向”扩增反应的引物以产生有义链DNA。
为了进行扩增非编码DNA链的“反向”反应，可设计寡核苷酸，使其与制备PCR之DNA模板所用引物的一部分相同。或者，可将含有蜡合酶肽编码序列之互补序列的寡核苷酸与上述“正向”蜡合酶寡核苷酸引物联合使用。
当蜡合酶肽序列含有可由大量不同密码子编码的氨基酸时，正向或反向的引物可以是“简并”的寡核苷酸，即含有特定肽区域之全部或一些可能的编码序列的混合物。当制备合成的寡核苷酸用作PCR引物时，为了减少这种混合物中存在的不同寡核苷酸的数目，优选选择具有最少数目可能的编码序列的肽区域。类似地，当使用合成的寡核苷酸直接筛选蜡合酶序列文库时，优选较低简并性的寡核苷酸。
下文是肽WSPEP33的序列(中线)和编码肽WSPEP33的正向(上线)和反向(下线)DNA序列的例子。
5’TTY GTN CCN GCN GTN GCN CCN CAY GGN GGN GCN YTN MGN 3’F V P A V AP H G G A L R3’AAR CAN GGN CGN CAN CGN GGN GTR CCN CCN CGN RAN KCN 5’下文是肽WSPEP29的序列(中线)和编码肽WSPEP29的正向(上线)和反向(下线)DNA序列的例子。5’ACN ATH GAY GAR TAY CCN GTN ATG TTY AAY TAY CAN CAR AAR 3’T I D E Y P V M F N Y T Q K3’TGN TAD CTR CTY ATR GGN CAN TAC AAR TTR ATR TGN GTY TTY 5’下文是肽WSPEP14的序列(中线)和编码肽WSPEP14的正向(上线)和反向(下线)DNA序列的例子。5＇TTY MGN GAY GAY CCN WSN AAY GAY CAY 3＇F R D D P S N D H3＇AAR KCN CTR CTR GGN WSN TTR CTR GTR 5′下文是可用于得到蜡合酶序列的合成寡核苷酸序列。寡核苷酸的名称反映了实施例5所示的特定蜡合酶肽片断数目。寡核苷酸名称中的字母“F”表示PCR正向反应引物，字母“R”表示PCR反向反应引物。
WSPEP29-F15’TTYGTNCCNGCNGTNGC3’WSPEP29-F25’GCNCCNCAYGGNGGNGC3’WSPEP29-R15’GCNCCNCCRTGNGGNGC3’WSPEP29-R25’GCNACNGCNGGNACRAA3’WSPEP33-F15’ACNATHGAYGARTAYCCNGT3’WSPEP33-F25’CCNGTNATGTTYAAYTAYAC3’WSPEP33-R15’TTYTGNGTRTARTTRAACAT3’WSPEP33-R25’AACATNACNGGRTAYTCRTC3’WSPEP14-F15’GAYGAYCCNWSNAAYGAYCAWSPEP1 -R15’TGRTCRTTNSWNGGRTCRTC上述寡核苷酸的核苷酸碱基密码如下所述A=腺嘌呤T=胸腺嘧啶Y=胞嘧啶或胸腺嘧啶C=胞嘧啶U=尿嘧啶 R=腺嘌呤或鸟嘌呤G=鸟嘌呤I=肌苷O=肌苷或胞嘧啶H=腺嘌呤，胞嘧啶或胸腺嘧啶N=腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤或胸腺嘧啶W=腺嘌呤或胸腺嘧啶S=鸟嘌呤或胞嘧啶B=鸟嘌呤，胞嘧啶或胸腺嘧啶K=鸟嘌呤或胸腺嘧啶M=腺嘌呤或胞嘧啶C．PCR反应按上述，从制备自jojoba组织的总RNA中分离poly(A)+RNA。根据厂商的指导，使用Marathon cDNA扩增试剂盒(ClontechLaboraties公司)通过逆转录由poly(A)+或总RNA制备cDNA。在下文所示的PCR反应1-16中使用jojoba cDNA。
使用逆转录的单链cDNA作为模板，在Perkin Elmer CetusGeneAmp PCR System 9600 PCR仪中进行PCR。根据厂商的说明书使用商购的PCR反应和最优化的试剂。反应 正向引物反向引物1 WSPEP14-F1 WSPEP29-R12 WSPEP14-F1 WSPEP29-R23 WSPEP14-F1 WSPEP33-R14 WSPEP14-F1 WSPEP33-R25 WSPEP29-F1 WSPEP14-R16 WSPEP29-F1 WSPEP33-R17 WSPEP29-F1 WSPEP33-R28 WSPEP29-F2 WSPEP14-R19 WSPEP29-F2 WSPEP33-R110WSPEP33-F2 WSPEP33-R211WSPEP33-F1 WSPEP14-R112WSPEP33-F1 WSPEP29-R113WSPEP33-F1 WSPEP29-R214WSPEP33-F2 WSPEP14-R115WSPEP33-F2 WSPEP29-R116WSPEP33-F2 WSPEP29-R2用于PCR扩增的温度程序如下95℃2分钟1个循环；95℃30秒，60℃1分钟和72℃4分钟4个循环；95℃30秒，57℃1分钟和72℃4分钟4个循环；95℃30秒，54℃1分钟和72℃4分钟4个循环；95℃30秒，51℃1分钟和72℃4分钟4个循环；95℃30秒，48℃1分钟和72℃4分钟25个循环。
从反应3和4中，检测到长度约700个核苷酸的PCR产物。使用凝胶电泳纯化PCR产物，使用Topo TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)将其克隆至pCR2.1中。测定克隆PCR产物的DNA序列，它为708个核苷酸长(图3)。
根据厂商的指导，使用Marathon cDNA扩增试剂盒(ClontechLaboraties公司)，用5’和3’RACE扩增整个cDNA(Frohman等，1988)。使用引物WSPEP14-F1和WSPEP33-R2得到708个核苷酸长的PCR片断，由该片断的序列合成下列引物WSRACEF1 GATTTGCCTCATTTTGTGATCTCGGTGCTWSRACEF2 GACCTATACCCCCAGTTCAACGAGCCATACWSRACEF3 TTCAACGAGCCATACTTAGCCACCTCGCTGWSRACER1 AACAACCACCCTCCAGTCACCATCACGAACWSRACER2 TTGCCTGAAACCGCCTTCTTCACCACCATCWSRACER3 AAGATGTCTGACACCATGAGGTTCCACCTG使用parimer WSRACEF1,WSRACEF2和WSRACEF3建立3’RACE反应。使用parimer WSRACER1,WSRACER2和WSRACER3建立5’RACE反应。根据厂商的方法(Clontech Laboraties公司)进行PCR反应。所有6个PCR反应都得到可见的PCR产物，其大小约为700个核苷酸至1000个核苷酸。凝胶纯化PCR产物，根据厂商的方法(Invitrogen公司)将其克隆至pCR2.1中。使用Sequencher软件(GeneCodes公司)装配5’和3’RACE反应和先前由引物WSPEP14-F1和WSPEP33-R2得到的PCR产物的几个克隆的DNA序列。所有PCR产物的装配序列含有cDNA序列的编码区。
为了分离适于将蜡合酶基因克隆至表达盒以进行植物脂质修饰的基因片断，可使用引物WAXSYNFOR和WASXYNREV由cDNA扩增基因的编码区。WAXSYNFOR的序列是GGATCCGTCGACACAATGGAGGTGGAGAAGGAGCTAAAG,WASXYNREV的序列是GCATGCAGATCTCACCACCCCAACAAACCCATC。根据厂商的方法，使用Marathon cDNA(Clontech Laboraties公司)进行PCR反应。PCR程序由94℃ 15秒,60℃ 1分钟和72℃ 2分钟30个循环组成。根据厂商的方法(Invitrogen公司)将PCR产物克隆至pCR2.1中。所得质粒被称为pCGN8538。实施例8产生含有蜡合酶cDNA的转基因植物构建2个植物二元载体，质粒pCGN8559含有3个蜡生物合成所必需的基因涉及脂肪酸延长至大于18个碳的链长度的凝聚酶(KCS)，涉及脂肪醇形成的酰基辅酶A还原酶和蜡合酶。对照质粒pCGN8557含有KCS和酰基辅酶A还原酶基因。将pCGN7698的含有受napin调节序列控制的jojoba酰基辅酶A还原酶的Asp718片断克隆至二元载体pCGN5139的Asp718位点，形成pCGN8555。将pCGN7844的含有受napin调节序列控制的Lunaria KCS的NotⅠ片断克隆至pCGN8555的NotⅠ位点，形成pCGN8557。将pCGN8538含有jojoba蜡合酶基因编码区的SalⅠ-BglⅡ片断克隆至用相同的两个限制性内切核酸酶消化的pCGN7770的napin表达盒，形成pCGN8553。将pCGN8553含有受napin调节序列控制的jojoba蜡合酶的Sse8387片断克隆至pCGN8557的Sse8387位点，形成pCGN8559。经电穿孔将二元载体导入根瘤农杆菌EHA105。根据Bent等(1994，科学265:1856-1860)的真空浸入法，使用载体转化拟南芥生态型No-O。
上述结果表明得自部分纯化的蜡合酶蛋白的核酸序列具有由脂肪醇和脂酰底物形成蜡酯的活性。本文提供了得到蜡合酶蛋白及其氨基酸序列的方法。可操作这种核酸序列以在宿主细胞中转录序列和/或表达蜡合酶蛋白，所述蛋白质可用于多个领域。所述应用包括当在具有脂肪醇底物来源的宿主细胞中使用蜡合酶时生产蜡酯化合物，所述底物对宿主细胞而言是天然的，或可利用编码具有由脂酰底物形成醇之活性的脂酰还原酶蛋白的重组构建体提供该底物。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请都列入本文作为参考，就好象每篇文献或专利申请都特别地和单独地被提及以列入本文作为参考一样。
尽管通过描述和以说明和便于理解为目的的实施例详细地描述了上述发明，但本领域技术人员根据本发明的教导易于对本发明进行某些改变和修饰，而不背离所附权利要求书的精神或范围，这一点是显而易见的。
权利要求
1．重组的DNA构建体，其含有编码具有形成蜡酯之活性的至少一部分酰基转移酶的核酸序列，和与所述酰基转移酶编码序列不天然相关的异源DNA序列。
2．权利要求1的构建体，其中所述蜡酯是由脂肪醇和脂酰辅酶A底物形成的。
3．权利要求1的构建体，其中所述酰基转移酶对具有式为C2x的碳链的脂酰底物具有活性，其中X选自6-12。
4．权利要求1的构建体，其中所述酰基转移酶对具有式为C2x的碳链的脂肪醇底物具有活性，其中X选自6-12。
5．权利要求1的构建体，其中所述酰基转移酶编码序列得自种子植物。
6．权利要求1的构建体，其中所述酰基转移酶编码序列得自jojoba。
7．权利要求1的构建体，其进一步含有至少可在宿主细胞中转录所述酰基转移酶编码序列的启动子。
8．权利要求7的构建体，其中所述启动子可在植物细胞中表达所述酰基转移酶编码序列。
9．权利要求8的构建体，其中所述植物细胞是植物胚种子细胞。
10．权利要求7的构建体，其中所述启动子可在细菌细胞中表达所述酰基转移酶编码序列。
11．权利要求8的构建体，其中所述启动子得自在植物种子胚细胞中优先表达的基因。
12．含有权利要求1之构建体的细胞。
13．含有权利要求1之构建体的植物细胞。
14．含有重组构建体的宿主细胞，所述构建体含有编码脂酰还原酶蛋白的核酸序列；和含有编码具有形成蜡酯之活性的酰基转移酶蛋白的核酸序列，其中所述酰基转移酶编码序列对所述宿主细胞而言是异源的，其中所述还原酶和酰基转移酶编码序列处于在所述宿主细胞中起作用的启动子的调节控制之下。
15．权利要求14的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
16．权利要求15的植物细胞，其中所述植物细胞是芸苔属植物细胞。
17．含有权利要求1的构建体的芸苔属植物细胞。
18．含有具有形成蜡酯之活性的种子植物酰基转移酶的原核细胞。
19．在宿主细胞中生产蜡酯的方法，该方法包括步骤在导致酰基转移酶表达的条件下培养含有重组构建体的宿主细胞，所述构建体含有编码具有由脂肪醇和脂酰辅酶A底物形成蜡酯之活性的至少一部分酰基转移酶的核酸序列，其中所述酰基转移酶编码序列处于在所述细胞中起作用的调节元件的控制之下，其中所述宿主细胞含有所述酰基转移酶的脂肪醇底物。
20．权利要求19的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。
21．权利要求19的方法，其中所述宿主细胞是种子植物胚细胞。
22．权利要求21的方法，其中所述种子植物是芸苔属。
23．权利要求19的方法，其中所述酰基转移酶编码序列得自种子植物。
24．权利要求19的方法，其中由异源重组构建体表达脂酰还原酶编码序列，结果在所述宿主细胞中产生所述蜡合酶的所述脂肪醇底物。
25．含有权利要求19之方法产生的蜡酯的宿主细胞。
26．芸苔属种子细胞，其中所述种子细胞的内在脂质储备物含有蜡酯。
27．权利要求26的芸苔属种子细胞，其中所述蜡酯是长链蜡酯。
28．得自权利要求25之细胞的蜡酯。
29．权利要求1的构建体，其中所述酰基转移酶含有肽序列TIDEYPVMFNYTQK。
30．权利要求1的酰基转移酶，其中所述酰基转移酶含有肽序列FVPAVAPHGGALR。
全文摘要
本发明提供了编码脂酰辅酶A∶脂肪醇酰基转移酶(蜡合酶)的核酸序列,其中所述蜡合酶具有由脂肪醇和脂酰辅酶A底物形成蜡酯的活性。特别感兴趣的是可得自表观分子量约为33KD的jojoba胚蜡合酶的核酸序列。本发明还包括可得自蜡合酶蛋白的氨基酸和核酸序列,和这种序列提供能产生蜡酯之转基因宿主细胞的用途。
文档编号C12N15/32GK1301304SQ98808029
公开日2001年6月27日 申请日期1998年6月5日 优先权日1997年6月5日
发明者凯瑟琳·丹尼斯·拉迪萨瓦尔, 詹姆斯·乔治·梅茨, 迈克尔·W·拉斯纳 申请人:卡尔金有限责任公司