多肽pa21及含多肽pa21的教槽料的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及多肤技术和饲料领域，尤其设及多肤PA21及含多肤PA21的教槽料。
【背景技术】
[0002] 长期W来，仔猪肠道问题是影响我国养猪业发展和养殖效益的关键问题。肠道不 仅是营养物质消化吸收的重要器官，同时也是动物体最大的免疫器官。国内养猪业面临的 哺乳和断奶仔猪发病率和死亡率高的问题，很大程度上都是仔猪肠道功能受损导致的。大 剂量使用抗生素作为预防和治疗仔猪肠道问题的主要手段，虽然能够取得比较理想的效 果，但是抗生素长期大量的使用引起的畜产品药物残留和有害菌耐药不断增强已成为威胁 人类安全的重大隐患。此外，抗生素虽然能够通过抑制有害菌增殖改善肠道健康，但是并没 有从根本上改善仔猪肠道功能。仔猪肠上皮细胞是肠道功能的主要执行者，其占仔猪小肠 粘膜细胞的90%W上，由位于隐窝的干细胞分裂增殖产生，然后沿隐窝-绒毛轴向绒毛顶端 迁移，最终调亡排入肠腔，从而完成整个生命周期。肠上皮细胞向绒毛顶端迁移的过程也是 其分化成熟完成生理功能的过程，上皮细胞更新是否正常直接影响肠道功能。然而，断奶应 激和疾病等因素能够干扰仔猪肠道上皮细胞的正常更新，从而影响肠道功能和健康。仔猪 肠道上皮细胞的增殖、分化和迁移等更新过程严重依赖于其所处环境的氧化还原势。研究 表明改善肠上皮细胞的氧化还原能力能够显著促进其增殖和分化的顺利进行。因此，在抑 制肠道有害细菌增殖的同时改善肠上皮细胞的抗氧化能力才能更好地改善仔猪肠道健康。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种新的具有抗氧化和抗菌双重作用的多肤PA21。
[0004] 本发明的另一目的在于提供一种含多肤PA21的教槽料。
[0005] 多肤PA21，所述的多肤PA21为人工设计合成的活性多肤，具有抗氧化和抗菌双重 功能，包含17个氨基酸残基，分子量为2096.55 Da,等电点为9.39,其氨基酸序列为Lys Leu Pro Gln Met Trp Lys Gln He Ala Cys Arg Leu Tyr Asn Thr Cys。
[0006] 所述的含多肤PA21的教槽料由W下重量份数的原料组成:膨化玉米22-30份，玉米 15-25份，碎米5-10份，乳清粉8-12份，豆油1-3份，膨化大豆8-15份，43%豆巧10-15份，鱼粉 2-5份，血浆蛋白粉2-5份，石粉0.3-0.7份，憐酸氨巧0.7-1.2份，赖氨酸0.05-0.3份，苏氨酸 0.05-0.3份，多肤PA21 0.04-0.3份，50%氯化胆碱0.04-0.08份，氧化锋0.15-0.3份，丙酸巧 0.04-0.06份，乙氧基哇嘟0.03-0.06份，复合维生素0.4-0.7份，复合矿物质0.2-0.6份。
[0007] 其中，43%豆巧是指豆巧中蛋白质的质量百分比含量为43%。
[000引所述的含多肤PA21的教槽料优选由W下重量份数的原料组成:膨化玉米27份，玉 米20.7份，碎米8份，乳清粉10份，豆油2份，膨化大豆10份，43%豆巧12份，鱼粉4份，血浆蛋白 粉3份，石粉0.5份，憐酸氨巧1份，赖氨酸0.15份，苏氨酸0.1份，多肤PA210.1份，50%氯化胆 碱0.05份，氧化锋0.3份，丙酸巧0.05份，乙氧基哇嘟0.05份，复合维生素0.5份，复合矿物质 0.5 份。
[0009] 其中，所述的复合维生素由W下重量份数的原料组成：维生素 A 3-6份，维生素 D 28-35份，维生素 E 14-18份，维生素 K 0.4-0.8份，维生素 Bl 0.5-1份，维生素 B2 1.5-2份， 维生素 B6 0.6-1.5份，维生素 Bl 2 0.8-1.6份，烟酸10-20份，D-泛酸巧3-8份，生物素0.3-0.7份，沸石粉补足至1000份。
[0010] 所述的复合矿物质由W下重量份数的原料组成:五水硫酸铜80-120份，硫酸亚铁 50-80份，一水硫酸锋15-30份，硫酸儘，20-45份，亚砸酸钢(含砸1%) 2-5份，舰酸巧(含舰 1%) 8-12份，沸石粉补足至1000份。
[OCm] 所述的多肤PA21W膨化玉米为载体，纯多肤PA21的重量百分比含量化0%。
[0012] 所述的含多肤PA21的教槽料应用于14日龄~断奶后14天的仔猪。
[0013] 本发明具有如下优点： 1、本发明中的多肤PA21具有抗氧化和抗菌的双重作用，同时具有分子量小、人工合成 方便且成本低和细胞毒性低等优点。
[0014] 2、所述的教槽料能够显著改善仔猪肠道健康和肠道形态结构，从而改善仔猪的生 长性能。
【附图说明】
[0015]图1是本发明中多肤PA21的细胞毒性实验图； 图2是本发明中含多肤PA21的教槽料对断奶仔猪腹泻率的影响图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非W任何形式对本发明进行限制。
[0017] 实施例1:多肤PA21的制备 多肤PA21的化学合成方法:根据
【发明内容】
中所述氨基酸序列，用全自动多肤合成仪 (ABI433)合成PA21全序列，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化； 纯化的多肤PA21分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T(F)测定， 等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。
[0018] 多肤PA21含有17个氨基酸残基，分子量为2096.55 Da,等电点为9.39,其氨基酸序 列为Lys Leu Pro Gln Met Trp Lys Gln He Ala Cys Ar邑 Leu Tyr Asn Thr Cys。
[0019] 实施例2:多肤PA21的抑菌实验 通过测定多肤PA21最小抑菌浓度(minimal inhibitoiT concenhation,MIC)来反映 其抗菌效果，最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。采用二倍稀释法，具体方 法如下:受试细菌(如表一)接种于LB固体培养基上，然后于37°C培养箱中倒置培养。待菌落 长出后，用一次性接种环挑取各受试细菌单菌落至LB液体培养基中，37°C培养箱中震荡培 养至对数生长期。紫外分光光度计上检测菌液0D600,根据1 0D600 = lXl〇9 CFU/mL将受 试菌菌液用液体LB培养基稀释至2 X 1〇5 C即/mL。然后在无菌96孔板各孔中加入10化L LB 液体培养基，然后在Al孔中加入I(K)化稀释到多肤PA21样品（多肤样品加入前用0.22WI1微 孔滤膜过滤除菌），混匀后取10化L加入A2孔，A2孔混匀后再取10化L加入A3孔，依次倍比稀 释，最后从A12孔吸出100化弃去，至此多肤PA21二倍浓度梯度样制成。向预先加入多肤 PA21的各孔中加入已稀释好的菌液10化L混匀，于37°C缓慢震荡培养16h，然后测定600nm处 吸光值。结果计算:取检测不到细菌生长的孔和与之相邻的有细菌生长的孔中多肤PA21浓 度之和的平均值作为多肤PA21最小抑菌浓度。测试结果如表1所示。从表中可W看出多肤 PA21对大肠杆菌、沙口氏菌和枯草芽抱杆菌均有非常强的杀伤作用。
[0020] 表1多肤PA21对各菌的最小抑菌浓度表
注：1 )PA21 MIC:多肤PA21的最小抑菌浓度 2)所述结果为5次独立重复实验结果的平均值。
[0021 ]实施例3:多肤PA21体外抗氧化作用 通过检测多肤PA21的自由基清除能力和还原能力来反映其抗氧化能力。通过ABTS (2， 2'-azin〇-bis(3-ethy化enzthiazoline-6-sulfonic acid)法体外检测多肤PA21的自由基 清除能力，此法的原理是ABTS在一定的氧化剂(高硫酸钟等)作用下生产绿色的ABTS%而抗 氧化剂会抵制ABTS+的产生，通过分光光度计检测吸光度的变化即可计算出样品的自由基 清除能力。本试验使用购自碧云天总抗氧化能力检测试剂盒(S0119)进行检测。还原能力则 通过检测还原化的能力反应，具体的检测过程如下:通过将多肤PA21溶液与2.5mL 0.2M憐 酸盐缓冲液(PBS, pH=6.6)及2.5血1% KsFe(CN)S混合均匀后，50°C解育20分钟，然后加入 2.5mL 10% S氯乙酸混匀后，于离屯、机中3000转/分钟离屯、10分钟，取上清2.5血加入2.5mL 蒸馈水及0.5 mL 0.1% FeCb溶液，然后通过分光光度计于700皿检测吸光值即可反应多肤 PA21的还原能力。本试验使用抗氧化剂下基径基茵香酸(BHA)作为阳性对照。从表2可W看 出，多肤PA21具有很强的自由基清除能力和还原能力。
[0022] 表2多肤PA21的抗氧化值表
注：1)BHA:下基径基茵香酸（阳性对照） 2)所述结果为5次独立重复实验结果的平均值。
[0023] 实施例4:多肤PA21的细胞毒性实验 将猪小肠上皮细胞IPEC-I培养于含有5%太牛血清、200 U/mL双抗(青霉素和链霉素各 100 U/mL)，5 ug/L表皮生长因子化GF)的HAM'S/F12培养基中培养至对数期，用憐酸盐缓 冲液化yClone)清洗S遍后，加入0.25%的膜蛋白酶消化至单个细胞，加入HAM' S/F12培养基 后400 g离屯、4分钟，弃上清后用新鲜的HAM'S/F12培养基悬浮细胞，调整至细胞密度为IX IO6个/mL,然后往96孔细胞培养板每孔中加入200 uL，待细胞贴壁后加入不同浓度多肤 PA21，置于二氧化碳培养箱（37°C、5% C〇2)培养24小时后，每孔中加入20 Ul CCK-8(碧云 天）CCK-8溶液，继续培养2小时，然后用酶标仪检测450 nm波长的吸光值。检测结果如图1 (其中PA21-200为200 ug/mL多肤PA21;PA21-100为 100 ug/