本发明涉及烟草工业领域，具体是一种生物技术提升再造烟叶香气品质的方法。
背景技术：
：再造烟叶主要由烟末、碎片、烟梗或低次烟叶加入胶粘剂和其他添加剂等组成。烟末、碎片、烟梗是烟草工业的副产物，以前多作弃置处理。我国是烟草大国，每年有数十万吨烟末、碎片、烟梗资源被废弃，既造成环境污染，同时也是对自然资源的浪费。研究表明，烟末、碎片、烟梗中含有的成分种类与烟叶成分基本一致，但是存在杂气重、刺激性大和口感不适等吸味缺陷。再造烟叶的细胞壁物质主要有纤维素、半纤维素、果胶、木质素等。细胞壁物质和淀粉含量高，烟叶粗糙，烟气刺激大，不和顺；水溶性糖含量高使烟叶吃味醇和，香气优美，但糖类化合物含量高，焦油释放量大；过量的纤维素会赋予烟气尖刺和灼热感并产生呛咳；烟草木质素的热裂解对烟草品质产生负面影响，木质素含量越高，烟叶品质越差，具有强烈的刺激性气味，青杂气重，吸味辛辣、涩口，其裂解时产生小分子醛类和苯酚类物质，如丙烯醛、苯酚、1,2-苯二酚等。同时木质素也是造纸工业排放黑液COD和色度形成的主要原因，其结构是由甲氧基取代的对-羟基肉桂酸聚合而成的异质多晶三维多聚体，分子间多为稳定的醚键、C-C键，是目前公认的微生物难降解芳香化合物之一。生物转化法是在细胞或酶等生物催化下进行的化学反应，即是指利用微生物(微生物的生长细胞、微生物的休止细胞)、酶(来自微生物或动植物的纯酶或粗酶)或植物细胞，通过简单的生物转化或生物合成制备所需物质的方法。与化学催化剂相比，生物催化剂专一性更强、催化活性更高、条件更易控制。可接受大量的外源复杂分子作为底物，化学选择性、区域选择性、立体选择性或对映选择性的催化底物生成相应的产物。生物转化广泛应用于天然产物的生物合成、药物前体化合物的转化、有机化合物的不对称合成、光学活性化合物的拆分、活性成分筛选及新药开发、药物代谢研究等诸多领域。用生物转化法生产的香兰素与植物提取的天然香兰素等同(Natural-identicalvanillin)，被称为生物香兰素(BilogicVanillin)。其转化前体有丁香酚、异丁香酚、香草醇、香草胺、松柏醇、阿魏酸、芳香族氨基酸等天然化合物。阿魏酸酯酶能切断细胞壁中多糖一多糖、多糖一木质素间的交联，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的释放，利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料，可以将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来，从而破坏了细胞壁的骨架结构，使得木质素、半纤维素以及纤维素之间的连接被部分打破，结构变得比处理前疏松。阿魏酸存在于烤烟烟叶中。纤维素、淀粉、蛋白质可被生物酶定向水解生成葡萄糖、低聚糖、短肽、氨基酸等，能有效降低卷烟的刺激性，减轻杂气和改善吸味。微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，可使植物原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。采用丁酸杆菌阿魏酸酯酶、木质素降解酶协同作用、桑肠杆菌(Enterobactermori)VL4-3复合生物转化再造烟叶水溶液，分解、转化再造烟叶中木质素、纤维素、蛋白质等大分子刺激性物质为糖类、阿魏酸等，再转化阿魏酸等为香兰素等香味前体物质，使生产的再造烟叶降低刺激性、减少青杂气、香气丰富优美、具有奶甜香气，提升再造烟叶香气品质，还未见报道。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一种生物技术提升再造烟叶香气品质的方法，采用丁酸杆菌阿魏酸酯酶、木质素过氧化物酶(Lip和锰过氧化物酶MnP协同作用)、桑肠杆菌(Enterobactermori)VL4-3复合发酵，以再造烟叶水溶液为底物进行生物转化，再经常规工业工序生产再造烟叶，其中丁酸杆菌阿魏酸酯酶释放再造烟叶细胞壁中的阿魏酸，疏松结构，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的释放，两种木质素过氧化物酶协同作用分解木质素，桑肠杆菌VL4-3能转化阿魏酸生成香兰素，其酶体系能分解、转化再造烟叶中的大分子刺激性物质或难挥发的香味前体物质为小分子香气物质或还原糖等，并且丁酸杆菌阿魏酸酯酶和桑肠杆菌VL4-3中的多糖酶具有协同作用，这些酶和微生物的复合生物转化，使生产的再造烟叶降低刺激性、减少青杂气、烟气柔和、香气丰富优美、具有奶甜香气，改善口感，提高再造烟叶的香气品质。本发明提供一种生物技术提升再造烟叶香气品质的方法，包括以下步骤：(1)菌株活化：将桑肠杆菌(Enterobactermori)VL4-3接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25～35℃、pH5～9条件下，静置培养24～72h后得到斜面培养物，再接种到种子培养基，在25～35℃，转速100～150rpm/min条件下振荡培养12～36h，连续转接1～3次后制得种子培养液；所述的桑肠杆菌(Enterobactermori)VL4-3保藏号为CCTCCNO：M2012020，于2012年2月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；所述的斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；所述的种子培养基：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；(2)复合生物转化预处理：在再造烟叶的萃取工序，将步骤(1)所得的种子培养液按质量比2～10％接种到再造烟叶水溶液中，并添加占再造烟叶质量比的0.15～0.4％的丁酸杆菌阿魏酸酯酶、木质素过氧化物酶(Lip和锰过氧化物酶MnP协同作用)复合酶，搅拌混合均匀，在pH至4.5～6.0，在35～45℃条件下，发酵1～12小时，得到再造烟叶生物转化液；(3)再造烟叶常规生产工序：所述步骤(2)所得的再造烟叶生物转化液，在55～65℃、pH自然条件下萃取反应40～60min，碟螺离心分离液渣，将萃取液75～85℃下真空浓缩至固含量40％，得到浓缩液，在此过程中，温度超过70℃，本发明的酶和菌失活；而残渣则通过用干燥机实施100～120℃干燥处理，灭活酶和菌，制成一定的水含量的烟草基片，将浓缩液喷涂到烟草基片上卷制成提升香气品质的再造烟叶。进一步的，步骤(2)中所述的丁酸杆菌阿魏酸酯酶为食品级，酶活100-1000u/g，占再造烟叶的质量比为0.05～0.15％；木质素过氧化物酶Lip，食品级，酶活100～1000u/g，占再造烟叶质量比的0.05～0.15％；锰过氧化物酶MnP，食品级，酶活100～1000u/g，占再造烟叶质量比的0.05～0.10％。进一步的，步骤(3)中所述的一定的水含量为质量比5～15％。本发明的有益效果：本发明采用生物酶和微生物对再造烟叶进行生物转化，通过阿魏酸酯酶水解烟末、烟梗细胞壁的阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，释放阿魏酸，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的释放，破坏细胞壁的骨架结构，使木质素、半纤维素以及纤维素之间的连接被部分打破，结构变得比处理前疏松，结合木质素过氧化物酶的协同作用来降解木质素；然后桑肠杆菌转化阿魏酸生产香兰素及其香气前体物质，同时桑肠杆菌的酶体系中的蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶等，降解再造烟叶及其萃取液中的蛋白质、果胶、淀粉和纤维素，生成游离氨基酸、还原糖等，最终使生产的再造烟叶萃取液及其基片中，刺激性大分子物质包括木质素、纤维素、淀粉、蛋白质含量减少，且小分子香气成分增加，使生产的再造烟叶降低刺激性、减少青杂气、烟气柔和、香气优美、增加奶香气，改善口感，提高再造烟叶的香气品质。本发明工艺条件温和易操作，实现了酶和微生物转化技术对再造烟叶香气品质的提升，绿色环保，具有工业化应用的前景。具体实施方式下面通过具体的实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解，此部分所描述的具体实施例仅可用于解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1本发明提供一种生物技术提升香气品质的再造烟叶，包括以下步骤：(1)菌株活化：将桑肠杆菌(Enterobactermori)VL4-3接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在27℃、pH5条件下，静置培养28h后得到斜面培养物，再接种到种子培养基，在28℃，转速100rpm/min条件下振荡培养12h，转接1后制得种子培养液；所述的桑肠杆菌(Enterobactermori)VL4-3，菌株保存号为CCTCCNO：M2012020，于2012年2月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心。所述的斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。所述的种子培养基：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。(2)复合生物转化预处理：在再造烟叶的萃取工序，将步骤(1)所述的种子培养液按质量比3％接种到再造烟叶水溶液中，并添加占再造烟叶质量比的0.15％的丁酸杆菌阿魏酸酯酶、木质素过氧化物酶(Lip和锰过氧化物酶MnP)复合酶，搅拌混合均匀，在pH至4.5，在35℃条件下，发酵2小时，得到再造烟叶生物转化液；所述的丁酸杆菌阿魏酸酯酶为食品级，酶活1000u/g，占再造烟叶的质量比为0.05％；木质素过氧化物酶Lip，食品级，酶活1000u/g，占再造烟叶质量比的0.05％；锰过氧化物酶MnP，食品级，酶活1000u/g，占再造烟叶质量比的0.05％；(3)再造烟叶常规生产工序：所述步骤(2)所得的再造烟叶生物转化液，在55℃、pH自然条件下萃取反应60min，碟螺离心分离液渣，将萃取液80℃下真空浓缩至固含量40％，得到浓缩液，在此过程中，温度80℃，本发明的酶和菌失活；而残渣则通过用干燥机实施102℃干燥处理，灭活酶和菌，制成水含量质量占比为13％的烟草基片；将浓缩液喷涂到烟草基片上卷制成提升香气品质的再造烟叶。实施例2本发明提供一种生物技术提升香气品质的再造烟叶，包括以下步骤：(1)菌株活化：将桑肠杆菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在30℃、pH5.5条件下，静置培养48h后得到斜面培养物，再接种到种子培养基，在30℃，转速110rpm/min条件下振荡培养24h，连续转接2次后制得种子培养液；所述的桑肠杆菌(Enterobactermori)VL4-3保藏号为CCTCCNO：M2012020，于2012年2月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心。所述的斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。所述的种子培养基：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。(2)复合生物转化预处理：在再造烟叶的萃取工序，将步骤(1)所述的种子培养液按质量比4％接种到再造烟叶水溶液中，并添加占再造烟叶质量比的0.2％的丁酸杆菌阿魏酸酯酶、木质素过氧化物酶(Lip和锰过氧化物酶MnP)复合酶，搅拌混合均匀，在pH至5，在37℃条件下，发酵3小时，得到再造烟叶生物转化液；所述的丁酸杆菌阿魏酸酯酶为食品级，酶活500u/g，占再造烟叶的质量比为0.10％；木质素过氧化物酶Lip，食品级，酶活800u/g，占再造烟叶质量比的0.10％；锰过氧化物酶MnP，食品级，酶活500u/g，占再造烟叶质量比的0.07％；(3)再造烟叶常规生产工序：所述步骤(2)所得的再造烟叶生物转化液，在60℃、pH自然条件下萃取反应50min，碟螺离心分离液渣，将萃取液81℃下真空浓缩至固含量40％，得到浓缩液，在此过程中，温度81℃，本发明的酶和菌失活；而残渣则通过用干燥机实施105℃干燥处理，灭活酶和菌，制成水含量质量占比为11％的烟草基片；将浓缩液喷涂到烟草基片上卷制成提升香气品质的再造烟叶。实施例3本发明提供一种生物技术提升再造烟叶香气品质的方法，包括以下步骤：(1)菌株活化：将桑肠杆菌(Enterobactermori)VL4-3接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在32℃、pH6.5条件下，静置培养60h后得到斜面培养物，再接种到种子培养基，在32℃，转速120rpm/min条件下振荡培养32h，连续转接3次后制得种子培养液；所述的桑肠杆菌(Enterobactermori)VL4-3保藏号为CCTCCNO：M2012020，于2012年2月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心。所述的斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。所述的种子培养基：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。(2)复合生物转化预处理：在再造烟叶的萃取工序，将步骤(1)所述的种子培养液按质量比6％接种到再造烟叶水溶液中，并添加占再造烟叶质量比的0.4％的丁酸杆菌阿魏酸酯酶、木质素过氧化物酶(Lip和锰过氧化物酶MnP协同作用)复合酶，搅拌混合均匀，在pH至5.8，在42℃条件下，发酵4小时，得到再造烟叶生物转化液；所述的丁酸杆菌阿魏酸酯酶为食品级，酶活300u/g，占再造烟叶的质量比为0.15％；木质素过氧化物酶Lip，食品级，酶活100u/g，占再造烟叶质量比的0.15％；锰过氧化物酶MnP，食品级，酶活200u/g，占再造烟叶质量比的0.10％；(3)再造烟叶常规生产工序：所述步骤(2)所得的再造烟叶生物转化液，在62℃、pH自然条件下萃取反应40min，碟螺离心分离液渣，将萃取液83℃下真空浓缩至固含量40％，得到浓缩液，在此过程中，温度83℃，本发明的酶和菌失活；而残渣则通过用干燥机实施110℃干燥处理，灭活酶和菌，制成水含量质量占比为12％的烟草基片；将浓缩液喷涂到烟草基片上卷制成提升香气品质的再造烟叶。试验例1：感官评吸效果对比试验将实施例1、2、3制备的生物技术提升香气品质的再造烟叶与未经处理的对照样品卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内(22℃+1、相对湿度为60％+2％)平衡48h，请专家评吸小组评吸。经评吸小组反复评吸，表1表明：本发明制备的生物技术提升香气品质的再造烟叶，酶和菌株的复合生物转化作用下，能降解、分解、转化再造烟叶萃取液和基片中的蛋白质、木质素、果胶、淀粉、纤维素等大分子物质为还原糖、香兰素及其香味前体物质，使生产的再造烟叶降低刺激性、减少青杂气、香气丰富优美、具有奶甜香气，提升再造烟叶香气品质。表1.生物技术提升香气品质的再造烟叶的感官评吸效果对比试验例2：再造烟叶木质素含量的检测采用测定木质素含量的经典方法Klason法来检测再造烟叶中的木质素含量，其原理是用72％硫酸除去纤维素，难溶的木质素经过滤、洗涤、干燥称重、计算等步骤可得到其含量，本发明的生物技术提升香气品质的再造烟叶中的木质素含量均有降低，结果如表2。表2.综合方法全面提升品质的再造烟叶的木质素含量实验组木质素含量木质素降低率空白对照3.25％/实施例1组2.78％14.46％实施例2组2.74％15.69％实施例3组2.91％10.46％试验例3：再造烟叶生物转化液香兰素HPLC检测再造烟叶生物转化液，经0.22μm微孔滤膜过滤后用高效液相色谱检测，用AgilentEclipseXDB-C8色谱柱(5μm,4.6*150mm)，流动相为甲醇/0.5％冰乙酸＝30/70，流速1mL/min，检测波长280nm，进样量10μL，检测时间40min。用50％甲醇溶液配制1g/L的标准样品溶液,稀释成一系列不同浓度,每次进样10μL,以峰面积对标准样品浓度作图，绘制标准曲线。表3.再造烟叶生物转化液中香兰素的浓度实验组香兰素浓度(mg/L)未处理对照/实施例1组127实施例2组258实施例3组242以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。当前第1页1 2 3