新型复合物形成蛋白质的制作方法

专利名称：新型复合物形成蛋白质的制作方法
1.引言蛋白质间的复合物在自然界分布广泛。
基本上，这些蛋白质能分配于下列类别—抗体，其利用抗原结合位点能特异结合抗原的相应表位(也可以是另一种抗体)—蛋白质复合物，例如在凝血系统或补体系统的活化中存在的—不同类型的配体受体相互作用，例如☆抗原或其表位与T细胞或B细胞受体☆生长因子、细胞因子、趋化因子、肽类激素、类固醇激素和介质与其相应受体☆酶如uPA或tPA与其受体☆病毒蛋白与其相应的细胞受体—粘附分子之间的粘附—信号传送、细胞型控制和基因转录控制中的蛋白质复合物文献中总结了大量这种例子，如Hardie等人，《蛋白激酶手册I和II》，学院出版社，1995，Callard等人，《细胞因子手册》，学院出版社，1994，Pigott等人，《粘附分子手册》，学院出版社，1994，Barclay等人，《白细胞抗原手册》，学院出版社，1994，Watson等人，《G蛋白连接的受体手册》，学院出版社，1994，Hesketh，《癌基因手册》，学院出版社，1995，Leid等人，细胞68，377(1992)，Murre等人，细胞58，537(1989)，Bbeneza等人，细胞61，49(1990)，Brugge，现代微生物学与免疫生物学主题(Curr.Top.Microbiol.Immunolbiol.)123，1(1981)，Callebaut等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，6270(1992)，Nadeau等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268，1479(1993)，Burbach等人，美国国家科学院院报89，8185(1992)，Hoffman等人，科学252，954(1991)，《应激诱导的蛋白质》，M.L.Pardue，J.R.Feramisco和S.Lindquist编，A.R.Liss，纽约(1989)，《真核转录因子》，D.S.Lachman，学院出版社(1991)，《转录调节》，S.McKnight和K.R.Yamamoto编，CSHL出版社，冷泉港，纽约(1992)。
在某些情况下，至少两种蛋白质之间自然确定的大量特异化合物在疾病诊断中用于蛋白质的分析或检测(见EP 0 491 362 B1)，这些蛋白质的结合配偶体用于疾病的预防或治疗。如果特定蛋白质复合物的一个配偶体可获得，则借助于该配偶体，第二种或其他成分如补体或凝血因子、抗原、受体或信号蛋白可以确定。而且，特异蛋白质复合物可在寻找抑制剂的小分子激活剂中使用。另外，为了疾病的预防或治疗，可对患者或动物施用受体的纯化的抗体或配体如细胞因子和肽类激素。
对于形成蛋白质复合物的蛋白质的这些不同应用可能性，各种蛋白质参与复合物形成及各蛋白质在生物中分布的特异性是极其重要的。特异性越低，配偶体与外源蛋白质的非特异性结合发生得越频繁。
例如，如所知的，非特异的，即不希望的含外源蛋白质配偶体的复合物的形成是使用抗体分析和诊断的主要问题。不希望的含外源蛋白质配偶体的复合物的形成可能也是体内副作用的原因，例如在注射抗体后。另外，两种蛋白质之间的特异结合是复合转录因子，特别是合成转录因子复合物的产生和特异功能的必要条件，如专利申请EP-A 0 805 209所述。
因此十分需要不与外源配偶体反应的、新型的、高度特异的复合物形成蛋白质。
2.发明简述本发明涉及由非天然存在的特异复合物形成蛋白质形成的复合物，其中在该复合物中含有下列成分a)至少一种对于靶结构特异的配体b)至少一种含有突变的二聚化结构域的蛋白质，该突变二聚化结构域来源于天然存在的二聚化结构域的突变，该突变二聚化结构域能与成分c)特异相互作用，且成分b)与成分a)共价键合，c)至少一种含有突变的二聚化结构域的蛋白质，该突变二聚化结构域来源于天然存在的二聚化结构域的突变，该突变二聚化结构域能与成分b)特异相互作用，且成分c)与成分d)共价键合，d)至少一种效应物。
根据本发明，成分b)和c)的特征在于相同或不同类型氨基酸的天然存在的肽或蛋白质被替换或插入，使得这样突变的肽或蛋白质实际只能彼此复合。但是，这样突变的肽或蛋白质与相应的未突变野生型蛋白质或肽不发生复合。这样能形成突变单体的同型二聚体或异源二聚体(突变的肽或蛋白质)。
相同或不同蛋白质的结合域中的突变可抑制在未突变状态下能复合的一对相同或不蛋白质或肽的未突变单体与突变单体之间形成复合物的能力。同时，突变给予这一对突变蛋白质彼此高特异性结合的能力。于是突变成对发生，其中一个突变发生于成分b)中，另一个在成分c)中发生，即，这一对的各氨基酸之间的分子相互作用是可能的。
插入天然存在的肽或蛋白质之间的根据本发明的氨基酸可以是，例如(成对列出旨在表明二聚蛋白质复合物中的分子相互作用)成分b)或c) 成分c)或b)3-18半胱氨酸3-18半胱氨酸3-24碱性氨基酸，如 3-24酸性氨基酸，如组氨酸 天冬酰胺精氨酸 天冬氨酸赖氨酸 谷氨酰胺谷氨酸3-24疏水性氨基酸，如3-24芳族氨基酸甲硫氨酸苯丙氨酸异亮氨酸酪氨酸亮氨酸 色氨酸缬氨酸3-24芳族氨基酸 3-24芳族氨基酸成分b)和c)的初始蛋白质在此可以相同或不同。
根据本发明的两种蛋白质的复合物的结合常数至少是KM＝10-7mol l- 1，优选地至少KM＝10-8mol l-1。
在本发明含义中，例如，下列相同或不同的配偶体(用于产生成分b)或c)并结合异源二聚体)优选地在其各自的结合域中突变，并使用这些或完整的蛋白质成分b)或c) 成分c)或b)FosJun或Jun B或Jun DFRAU-1 Jun或Jun B或Jun DFRAU-2 Jun或Jun B或Jun DFOS-B Jun或Jun B或Jun DOCT-1 Jun或Jun B或Jun DNFKB(p65) IKBRasRAFCD4p56LcKbcl-2 bad或bax细胞周期蛋白A cdk1E2FDPCD40 CD40LMycMaxMycN MaxMycL Maxp105(Rb1) AFF-2，E1Ap107(Rb2) E7、E2F或Mycp130 E7、E2F或MycCBLGagTRPTRPMet MetMyb p67或p160VAV p67或p160APC α或β-连环蛋白APC APCVD受体 h-(视黄醛x-受体)RXRα或βT3受体 HRXRα或βMyoD E12成分b)或c) 成分c)或b)E12 IdE47 IdHHSP90 孕酮受体HHSP90 糖皮质激素受体HHSP90 盐皮质激素受体HHSP90 二噁英(dioxin)受体二噁英受体 ArntHPS90FKBP59HSP90环孢素结合蛋白HPS90Pp60V-srcHSP70HSF1热激因子1HSP70HSF2热激因子2这些蛋白质对是优选的，其天然具有螺旋-环-螺旋/亮氨酸拉链结合序列。
本发明还涉及这些根据本发明的复合物形成蛋白质的极其不同的应用，例如—作为多价蛋白质复合物用于预防和治疗—作为多价配体用于基因治疗的载体—作为合成转录因子用于基因表达的控制
—作为诊断或分析系统在本说明书中，根据所选择的应用类型选择成分a)和b)。
本发明特别涉及新型复合物形成蛋白质，其中所述氨基酸已插入自然形成同型二聚体或异源二聚体的蛋白质中，使得这样突变的这些蛋白质(成分b)和c))只与其本身(同型二聚体)，或与相应突变的配偶体(异源二聚体)，但不再与天然存在的未突变的初始蛋白质形成复合物。
含有成分a)、b)、c)和d)的新型复合物形成蛋白质能在如两个实施方案中使用。
在第一个实施方案中(见

图1a)，成分b)是一种同型(或异型)多聚体[成分b)1-b)n]，相应的相同(或不同)的成分c)在所有情况下均可与之结合，作为单体和与成分d)连接。
在该实施方案中，多种成分d)(效应物)与靶结构结合。
在第二个实施方案中(见图2)，成分b)和成分c)都是多聚体，只有一种或少量成分d)与成分c)结合。尽管该实施方案中只有少量成分d)(效应物)与靶结构结合，但成分c)与d)之间的结合极强，能提高成分c)和d)与靶结构结合的特异性。
本发明涉及由成分a)、b)、c)和d)组成的新型复合物形成蛋白质，也涉及编码这些复合物形成蛋白质的核酸构建体。本发明也涉及由成分d)、b)、c)和d)组成的复合物，即成分a)被替换为d)，及编码它们的核酸构建体。
另外，本发明也涉及由成分a)、b)、c)和a)组成的复合物，即成分d)被替换为a)，及编码它们的核酸构建体。
本发明还涉及上述由成分a)、b)、c)和d)组成的复合物形成蛋白质或其变体，其另外含有一种融合肽、转运(translocation)肽或在成分c)与d)或a)与b)之间含有蛋白质的切割序列，及编码它们的核酸构建体。
所有这类核酸构建体均能借助于本领域技术人员所知的病毒或非病毒载体导入细菌、酵母或哺乳动物细胞中。
这类细胞能用于制备根据本发明的蛋白质，乃至为了生物的预防或治疗目的施用。
然而，插入载体中的这类核酸构建体也能为了预防或治疗目的直接对生物施用。
本发明还涉及上述复合物之一的制备，其中该复合物的一种蛋白质利用编码它的核酸构建体表达，而该复合物的不同于第一种的另一种蛋白质利用编码它的核酸构建体表达，分离表达的蛋白质，并彼此复合。对于由同型二聚体或同型寡聚体组成的复合物，制备中不需表达不同于第一种的第二种蛋白质。3.用于预防和治疗的多价蛋白质复合物本发明涉及根据本发明的蛋白质复合物在疾病预防或治疗中的应用。在本说明书中，成分a)是靶结构的配体。靶结构能存在于细胞膜上、胞外基质中或组织液或血液中。
根据本发明，成分a)可能是—细胞受体的配体，例如☆生长因子，如VEGF、PDGF、EGF、TGFα、TGFβ、KGF、SDGF、FGF、IGF、HGF、NGF、BDNF、神经营养因子、BMF、铃蟾肽、M-CSF、血小板生成素、促红细胞生成素、SCF、SDGF、制瘤素、PDEGF、内皮素-1☆细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15☆干扰素α、β和γ☆肿瘤坏死因子TNFα、β☆趋化因子，如RANTES、MCAF、MIP-1α或β、NAP、β-血小板球蛋白☆肽类激素，如SRH、SIH或STH、MRH或MSH、PRH、PIH或促乳素、GnRH、LH-RH、FSH-RH、LH/ICSH或FSH、TRH或TSH、CRH或ACTH☆血管紧张肽、激肽、组胺、其同源物或类似物
☆类固醇激素，如雌激素、促孕激素、男性激素、糖皮质激素、盐皮质激素、其同源物或类似物☆维生素，如叶酸在本发明说明书中，成分a)也可以是粘附分子，粘附分子的一部分，或粘附分子的类似物，其可结合细胞膜上相应的粘附分子或靶细胞上粘附分子的另一特异结合结构。
能用作成分a)的这类粘附分子有，例如—Lewis X(对于GMP-140)—S-Lewis X(对于ELAM-1)—LFA-1(对于ICAM-1和ICAM-2)—MAC-1(对于ICAM-1)—VLA-4(对于VCAM-1)—PECAM(对于PECAM)—玻连蛋白(对于玻连蛋白受体)—GMP-140(对于Lewis X)—S-Lewis X(对于ELAM-1)—ICAM-1、ICAM-2(对于LFA-1、MAC-1)—VCAM-1(对于VLA-4)—纤连蛋白(对于VLA-4)—层粘连蛋白(对于VLA-6)—纤连蛋白、层粘连蛋白(对于VLA-1、VLA-2、VLA-3)—纤连蛋白(对于VLA-4)—纤维蛋白原(对于GpIIb-IIIa)—B7(对于CD28)—CD28(对于B7)—CD40(对于CD40L)—CD40L(对于CD40)在本发明说明书中，成分a)也可以是与配偶体蛋白结合从而参与生物反应链的蛋白质，如补体因子、凝血因子、激肽系统、纤维蛋白溶解系统的因子，或血浆或细胞酶抑制剂或血浆或细胞酶。
在本发明说明书中，成分a)也可以是前述蛋白质之一的受体。
在本发明说明书中，成分a)也可以是Fc受体的胞外部分(Dougherty等人，输血学(Transfusion Science)17，121(1996))，靶细胞特异的抗体通过其Fc部分与之结合。
在本发明说明书中，成分a)也可以是抗体分子或抗体分子的表位结合部分。人抗体是优选的。
鼠单克隆抗体能以人源化形式使用。人源化以Winter等人(自然349，293(1991))和Hoogenbooms等人(输血血液生物学综述36，19(1993))所述的方法进行。抗体片段按照现有技术制备，如Winter等人(自然349，293(1991))、Hoogenboom等人(输血血液生物学综述36，19(1993)，Girol，分子免疫学28，1379(1991))或Huston等人(国际免疫学综述(Intern.Rev.Immunol.)10，195(1993))所述的方法。
重组抗体片段直接由现有的杂交瘤制备，或借助“噬菌体展示”技术从鼠或人抗体片段文库中分离。这些抗体片段然后以遗传水平直接用于进一步的操作(例如与其他蛋白质融合)。
为了从杂交瘤中产生重组抗体片段，通过分离mRNA，将RNA反转录为cDNA，随后利用聚合酶链反应和互补于可变片段5’或3’端的寡核苷酸扩增，获得编码抗体的抗原结合域(VH、VL)的遗传信息。然后将VH和VL片段克隆到细菌表达载体中，例如以Fv片段、单链Fv片段(scFv)或Fab片段的形式。
也可利用“噬菌体展示”技术从鼠源或人源的抗体文库(免疫文库，天然文库)中直接分离新抗体片段。在抗体片段的“噬菌体展示”中，将抗原结合域以scFv片段或Fab片段的形式，作为与丝状噬菌体外壳蛋白g3P的融合蛋白克隆到噬菌体基因组或噬菌粒载体中。在抗原包被的塑料容器上，在抗原结合的顺磁珠上，或通过与细胞表面结合，筛选抗原结合的噬菌体(“淘选”)。
通过可变抗体片段的PCR扩增，由免疫动物或患者的B淋巴细胞制备免疫文库。为此，使用鼠或人免疫球蛋白基因或人免疫球蛋白基因家族特异的寡核苷酸的组合。
用未免疫的供体作为免疫球蛋白基因源，能制备天然文库。此外，能用免疫球蛋白种系基因制备半合成的抗体所有组成成分，可变片段的互补决定区3利用简并引物经PCR替换。这些所谓的单样(single pot)文库与免疫文库相比具有优点，即能从一个文库中分离抗大量抗原的抗体片段。
抗体片段的亲和力能利用噬菌体展示技术进一步提高，现有抗体片段的新文库通过随机、基于密码子或定向的诱变，通过链改组含天然组成成分的片段的各结构域，或借助于细菌突变株制备，而具有改进性质的抗体片段通过在严格条件下重新筛选分离。另外，通过逐步将可变区域之一替换为人组成成分，随后用原始抗原筛选(指导的筛选)以，能使鼠抗体片段人源化。此外，鼠抗体的人源化也可通过将人抗体超变区定向替换为原始鼠抗体的相应区而进行。
根据本发明，在根据本发明的配体(成分a))上能含有如靶细胞上的靶结构的至少两种相同或不同的配体。一种特殊形式的双特异性或多特异性重组抗体是单链、双或多抗原结合分子。这些分子的制备在专利申请DE 19816141.7(未公布)中描述。在该专利申请中，例如，特别引用成分a)的制备。
在本发明说明书中，成分a)也可以是病毒的外壳蛋白或外壳蛋白的一部分，其通过外壳蛋白特异结合所选择的细胞。
成分a)的选择取决于根据本发明的复合物形成蛋白质将结合的靶结构。
其例子是—活化的内皮细胞的配体在本发明的含义内，其包括抗内皮细胞膜结构的抗体或抗体片段，如Burrows等人(药物治疗(Pharmac.Ther.)64，155(1994))、Hughes等人(癌症研究(Cancer Res.)49，6214(1989))和Maruyama等人(美国国家科学院院报87，5744(1990))所述。特别是，其包括抗VEGF受体的抗体。
配体还包括可与内皮细胞上的膜结构或膜受体结合的所有活性化合物。其包括，例如，末端含有甘露糖和IL-1或生长因子或其片段或其亚序列的物质，其可与内皮细胞表达的受体结合，如PDGF、bFGF、VEGF、TGFβ(Pusztain等人，病理学杂志169，191(1993))。
另外，还包括可与活化的和或增殖的内皮细胞结合的粘附分子。这类粘附分子如Slex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1、VLA-4、玻连蛋白或RGD肽已有描述(Augustin-Voss等人，细胞生物学杂志119，483(1992)，Pauli等人，癌症转移综述(Cancer Metast.Rev.9，175(1990)，Honn等人，癌症转移综述11，353(1992)综述)。
本发明含义内的配体尤其包括具有内皮细胞向性的病毒外壳糖蛋白。这些病毒包括，例如—丝状病毒，例如☆马尔堡病毒其外壳蛋白GP(糖蛋白)和sGP(第二糖蛋白)☆或埃博拉病毒其外壳蛋白GP和sG—巨细胞病毒特别是其gB蛋白—I型单纯疱疹病毒—HIV-1病毒—麻疹病毒—汉坦病毒—甲病毒，如塞姆利基森林病毒—流行性出血热病毒—脊髓灰质炎病毒—肠道病毒(例如，Echo 9，Echo 12，柯萨奇B3)—活化巨噬细胞和/或活化淋巴细胞的配体本发明含义内的配体包括可与免疫细胞表面特异结合的其他物质。其包括抗免疫细胞膜结构的抗体或抗体片段，如Powelson等人(生物技术进展(Biotech.Adv.)11，725(1993))所述。
另外，配体也包括其抗原结合可变部分可与免疫细胞Fc-γ或Fc-ε或Fc-μ受体结合的单克隆或多克隆抗体或抗体片段(Rojanasakul等人，药物研究11，1731(1994))。
另外，其包括人单克隆或多克隆免疫球蛋白的Fc片段。这类Fc片段例如通过使用重组DNA的遗传工程或按照Haupt等人(Klin.Wschr.47，270(1969))、Kranz等人(生物学标准进展(Dev.Biol.Standard)44，19(1979))、Fehr等人(临床药学进展(Adv.Clin.Pharmac.)6，64(1974))或Menninger等人(免疫化学(Immunochem.)13，633(1976))的方法制备。
配体另外还包括可与免疫细胞表面上膜受体结合的所有物质。其包括细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-3、IL4、IL-6、IL-10、TNFα、GM-CSF、M-CSF，生长因子，如EGF、TGF、FGF、IGF或PDGF，或可与免疫细胞表达的受体结合的其片段或其亚序列。其还包括粘附分子和可与细胞膜结构如脾、肝、肺和其他组织中巨噬细胞上的甘露糖6-磷酸受体结合的其他配体。
Perales等人(欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)226，255(1994))已清楚地描述了这些配体和膜结构的选择。
然而，本发明含义中的配体也包括具有淋巴细胞和/或巨噬细胞向性的这些病毒的外壳糖蛋白。
这些病毒感染的巨噬细胞包括，例如—HIV-1特别是在gp120的V3区有突变的菌株，导致与巨噬细胞的结合增强—HIV-2—汉坦病毒，例如Punmala病毒—巨细胞病毒—呼吸道合胞体病毒
—单纯疱疹病毒—丝状病毒病毒感染的淋巴细胞包括，例如—水痘带状疱疹病毒(VZV)；VZV尤其感染T细胞—疱疹病毒6(HHV-6)；HHV-6尤其感染T细胞—狂犬病病毒；狂犬病病毒外壳蛋白尤其可与TH2细胞结合—HIV-1；糖蛋白gp120优选地与T细胞的CD4分子结合—HTLV-II；HTLV-II尤其感染B细胞—HTLV-I；HTLV-I尤其感染T细胞—C型流感病毒C型流感病毒利用血凝素酯酶融合(HEF)蛋白与N-乙酰-9-β-乙酰神经氨酸(Neu 5，9 Ac)结合，这优选地发生于B淋巴细胞上，在T淋巴细胞上较低程度发生或不发生—在核苷酸位点872(编码氨基酸序列HEF的位点284)中突变的C型流感病毒，例如苏氨酸替换为异亮氨酸。具有这种突变的表面蛋白HEF对N-乙酰-9-β-乙酰神经氨酸受体有比野生病毒明显更强的亲和力—C型流感病毒的HEF裂解产物，其含有与N-乙酰-9-O-乙酰神经氨酸的结合结构。该结合结构由催化三联体丝氨酸71、组氨酸368或369和天冬氨酸261确定—EB病毒；EBV尤其感染B细胞—单纯疱疹病毒-2HSV-2尤其感染T细胞
—麻疹病毒—肌细胞的配体包括，例如，抗肌细胞特别是平滑肌细胞膜结构的抗体或抗体片段。这类抗体是，例如—抗体10F3—抗肌动蛋白抗体—抗血管紧张肽II受体抗体—抗生长因子受体抗体或抗下列受体的抗体—EGF受体—或PDGF受体—或FGF受体—或抗内皮素A受体抗体这些配体另外还包括可与肌细胞上的膜结构或膜受体结合的所有活性物质(Pusztai等人，病理学杂志169，191(1993)，Harris，现代生物技术观点2，260(1991)综述)。例如，其包括可与平滑肌细胞表达的受体结合的生长因子或其片段或其亚序列，例如—PDGF—EGF—TGFβ—TGFα—FGF—内皮素A然而，本发明含义内的配体也包括具有肌细胞向性的这些病毒外壳的糖蛋白。这些病毒包括如巨细胞病毒。—造血细胞的配体这些配体包括针对分化不良血细胞上表达的受体的抗体或抗体片段。
已描述了对于如下列受体的这类抗体—干细胞因子受体—IL-1受体(I型)—IL-1受体(II型)—IL-3受体α—IL-3受体β—IL-6受体—GM-CSF受体另外，配体也包括其恒定区可与免疫细胞Fc-γ受体结合的单克隆或多克隆抗体或抗体片段。
配体还包括可与分化不良的血细胞表面上的膜结构或膜受体结合的所有物质。例如，包括可与血细胞表达的受体结合的生长因子，如SCF、IL-1、IL-3、IL-6、GM-CSF或其片段或其亚序列。—滑膜细胞和炎症细胞的配体包括其可变区可与滑膜细胞或炎症细胞的膜结构结合的单克隆或多克隆抗体或抗体片段。这些膜结构是，例如—波形蛋白—纤连蛋白—Fc受体其也包括恒定区可与Fc受体结合的单克隆或多克隆抗体或抗体片段。
其另外还包括可与滑膜细胞上的膜结构或膜受体结合的所有活性化合物。例如，包括可与滑膜细胞上表达的受体结合的细胞因子或生长因子或其片段或其亚序列，如IL-1-RA、TNFα、IL-4、IL-6、IL-10、IGF、TGFβ。
另外，还包括其主要成分是可与巨噬细胞上的甘露糖-6-磷酸受体结合的末端甘露糖的配体。
—病毒感染的细胞的配体配体包括针对病毒感染的细胞细胞膜上表达的病毒抗原的抗体或抗体片段。
这类抗体已对于如下列病毒感染的细胞描述—HBV—HCV—HSV—HPV—HIV—EBV—HTLV—肝细胞和其他组织细胞的配体配体包括可与肝细胞表面上的膜结构或膜受体结合的所有物质。例如，包括生长因子，如细胞因子，EGF、TGF、FGF或PDGF，或可与这类细胞表达的受体结合的其片段或亚序列。还包括可与对特定组织选择的细胞膜结构结合的配体。包括，例如膜结构 配体 组织细胞唾液酸糖蛋白受体唾液酸血清粘蛋白 肝细胞新糖蛋白半乳糖转铁蛋白受体转铁蛋白 肝、其他组织细胞胰岛素受体 胰岛素肝、其他组织细胞甘露糖-6-磷酸受体 甘露糖脾、肝、肺、其他组织中的巨噬细胞Fc-γ受体 免疫球蛋白G 网状内皮系统，其他组织Perales等人(欧洲生物化学杂志226，255(1994))已清楚地描述了这些配体和膜结构。
然而，本发明含义中的配体特别包括具有所选细胞向性的病毒外壳糖蛋白，如下列细胞—支气管上皮细胞*呼吸道合胞体病毒—肝细胞*丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒*丝状病毒例如，肝细胞可通过唾液酸糖蛋白受体结合马尔堡病毒*乙型肝炎病毒肝细胞优选地通过唾液酸糖蛋白受体结合HBV的preS2和preS1域*丁型肝炎病毒—肝窦状隙细胞*V型肝炎病毒HBV通过纤连蛋白结合—神经胶质细胞的配体其包括抗神经胶质细胞膜结构的抗体或抗体片段，如Mirsky等人(细胞与组织研究(Cell and Tissue res.)240，723(1985))、Coakham等人(实验肿瘤研究进展(Prog.Exp.Tumor Res.)29，57(1985))和Mckeever等人(神经生物学(Neurobiol.)6，H9(1991))所报道的。这些膜结构还包括神经粘附分子如N-CAM，特别是其C多肽链。
另外还包括可与神经胶质细胞上的膜结构或膜受体结合的所有活性化合物。例如，包括末端携带甘露糖并与甘露糖-6-磷酸受体结合的物质，胰岛素和胰岛素样生长因子，PDGF和可与相关膜受体结合的这些生长因子的片段。
在本发明含义内的配体特别包括具有神经胶质细胞向性的这些病毒的外壳糖蛋白。
这些病毒包括，例如—HIV-1亚型JRF1—单纯疱疹病毒1—白血病细胞的配体包括抗白血病细胞膜结构的抗体或抗体片段。已为诊断与治疗方法描述了大量这类单克隆抗体(Kristensen，丹麦医学公报(Danish MedicalBulletin)41，52(1994)；Schranz，Therapia Hungarica 38，3(1990)；Drexler等人，白血病研究10，279(1986)；Naeim，疾病标志(Dis.Markers)7，1(1989)；Stickney等人，现代肿瘤学观点(Curr.Opin.Oncol.)4，847(1992)；Drexler等人，Blut 57，327(1988)；Freedman等人，癌症探索(Cancer Invest.)9，69(1991)综述)。根据白血病的类型，合适的配体是，例如，具有下列抗原特异性的单克隆抗体或其抗原结合抗体片段细胞 膜抗原AMLCD13CD14CD15CD33CAMALSialosyl-LeB-CLL CD5CD1cCD23膜免疫球蛋白的独特型和同种型T-CLL CD33M38
IL-2受体T细胞受体ALL CALLACD19非何杰金淋巴瘤配体还包括可与白血病细胞的膜结构或膜受体结合的所有活性化合物。例如，包括可与白血病细胞表达的受体结合的生长因子或其片段和亚序列。
已经描述了这类生长因子(Cross等人，细胞64，271(1991)；Aulitzky等人，药物48，667(1994)；Moore，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)1，3(1995)；van Kooten等人，白血病与淋巴瘤(Leuk.Lymph.)12，27(1993))。例如，包括—非何杰金氏淋巴瘤中的IFNα—IL-2，特别是T细胞白血病中的IL-2—T细胞、单核细胞、髓样、红细胞和巨核母细胞白血病中的FGF—白血病中的TGFβ—视黄醛，如急性前髓细胞白血病中的视黄酸—肿瘤细胞的配体包括抗肿瘤细胞膜结构的抗体和抗体片段。这类抗体例如已由Sedlacek等人(肿瘤学稿件(Contrib.to Oncol.)32，Karger Verlag，慕尼黑(1988)和肿瘤学稿件43，Karger Verlag，慕尼黑(1992))清楚地描述。
其他例子是抗下列成分的抗体—唾液酰Lewis—肿瘤上的肽，可被T细胞识别—癌基因表达的蛋白质
—神经节苷脂，如GD3、GD2、GM2、9-O-乙酰GD3、岩藻糖基GM1—血型抗原及其前体—多形上皮粘蛋白上的抗原—热激蛋白上的抗原根据本发明，成分d)可能缺乏，或者根据所预防或治疗的疾病性质，与如下的成分a)一起选择a)肿瘤的治疗a.1)靶细胞—增殖的内皮细胞或—与内皮细胞相邻的基质细胞和肌细胞，或—肿瘤细胞或白血病细胞a.2)效应物细胞增殖的抑制剂，例如—成视网膜细胞瘤蛋白(pRb＝p110)或相关p107和p130蛋白成视网膜细胞瘤蛋白(pRb/p110)和相关p107和p130蛋白经磷酸化灭活。优选地，将要使用的这些细胞周期抑制剂的基因是表达蛋白质的灭活位点具有突变而其功能不受影响的基因。这些突变的例子已对于p110描述。
p107或p130蛋白的DNA序列类似地突变。
—p53蛋白蛋白p53在细胞中的灭活方法是结合特异蛋白质如MDM2，或利用去磷酸化的C端丝氨酸使p53寡聚化。优选地，使用在C端截短丝氨酸392的p53蛋白的DNA序列。
—p21(WAF-1)—p16蛋白—其他cdk抑制剂—GADD45蛋白—Bak蛋白—Bax蛋白
a.3)效应物凝血诱导因子和血管发生抑制剂，例如—纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)—PAI-2—PAI-3—制管张素和/或内皮生长抑制素—干扰素(IFNα、IFNβ或IFNγ)—血小板因子4—IL-12—TIMP-1—TIMP-2—TIMP-3—白血病抑制因子(LIF)—组织因子(TF)及其凝固活性片段a.4)效应物细胞抑制蛋白和细胞毒性蛋白，例如—穿孔素—粒酶—IL-2—IL-4—IL-12—干扰素，如IFN-α、IFNβ或IFNγ—TNF，如TNFα或TNFβ—制瘤素M—鞘磷脂酶—爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物a.5)效应物细胞抑制或细胞毒性抗体—细胞抑制或细胞毒性抗体，包括针对内皮细胞膜结构的抗体，如Burrows等人(药物治疗(Pharmac.Ther.)64，155(1994))，Hughes等人，(癌症研究49，6214(1989))和Maruyama等人，(美国国家科学院院报87，5744(1990))所述。特别是，其包括抗VEGF受体的抗体。
—另外，也包括抗肿瘤细胞膜结构的细胞抑制或细胞毒性抗体。这类抗体已有明确描述，例如，Sedlacek等人，(肿瘤学稿件32，KargerVerlag，慕尼黑(1988)和肿瘤学稿件43，Karger Verlag，慕尼黑(1992)。其他例子是抗唾液酸Lewis；抗T细胞可识别的肿瘤上的肽；抗癌基因表达的蛋白质；抗神经节苷脂如GD3、GD2、GM2、9-O-乙酰GD3、岩藻糖基GM1；抗血型抗原及其前体；抗多形上皮粘蛋白上的抗原；抗热激蛋白上的抗原的抗体。
—另外，也包括抗白血病细胞膜结构的抗体。大量这类单克隆抗体已在诊断及治疗方法方面描述(Kristensen，丹麦医学公报41，52(1994))；Schranz，Therapia Hungarica 38，3(1990)；Drexler等人，白血病研究10，279(1986)；Naeim，疾病标志7，1(1989)；Stickney等人，现代肿瘤学观点4，847(1992)；Drexler等人，Blut 57，327(1988)；Freedman等人，癌症探索9，69(1991)。根据白血病类型，合适的配体是，如针对下列膜抗原的单克隆抗体或其抗原结合抗体片段细胞膜抗原AML CD13CD15CD33CAMALSialosyl-LeB-CLL CD5CD1cCD23膜免疫球蛋白的独特型和同种型T-CLL CD33M38
IL-2受体T细胞受体ALL CALLACD19非何杰金淋巴瘤—鼠抗体的人源化，Fab和rec Fv片段的基因的制备和优化按照本领域技术人员所知的技术进行(Winter等人，自然349，293(1991)；Hoogenbooms等人，输血血液生物学综述36，19(1993)；Girol，分子免疫学28，1379(1991)或Huston等人，国际免疫学综述10，195(1993))。rec Fv片段与成分b)和/或成分c)的融合用本领域技术人员所知的现有技术通过表达编码该融合蛋白的基因进行。
a.6)效应物炎症诱导剂，例如—IL-1—IL-2—RANTES(MCP-2)—单核细胞趋化和活化因子(MCAF)—IL-8—巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1α、-β)—嗜中性粒细胞活化蛋白-2(NAP-2)—IL-3—IL-5—人白血病抑制因子(LIF)—IL-7—IL-11—IL-13—GM-CSF—G-CSF
—M-CSF—眼镜蛇毒因子(CVF)或功能上相应于人补体因子C3b的CVF的亚序列，它们能与补体因子B结合，并在被因子D切割后成为C3转化酶—人补体因子C3或其亚序列C3b—人补体因子C3的裂解产物，其在功能和结构上类似于CVF—可活化补体或引起炎症的细菌蛋白质，如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的孔蛋白、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的聚集因子、(特别是革兰氏阴性菌的)modulin、军团菌(Legionellae)或B型流感嗜血菌(Haemophilus influenza)或克雷伯氏菌(Klebsiellae)的主要外膜蛋白，或G组链球菌(Streptococci)的M分子。
a.7)效应物活化细胞抑制剂前体的酶，例如，可将无活性前体物质(前体药物)切割为活性细胞抑制剂(药物)的酶。
这类物质和相关的前体药物和药物已由Deonarain等人(英国癌症杂志(Br.J.Cancer)70786(1994)，Mullen(药物治疗63，199(1994)和Harris等人，基因治疗(Gene Ther.)1，170(1994))描述。例如，能使用下列酶之一—单纯疱疹病毒胸苷激酶—水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶—细菌硝基还原酶—细菌β-葡糖醛酸糖苷酶—来源于黑麦(Secale cereale)的植物β-葡糖醛酸糖苷酶—人β-葡糖醛酸糖苷酶—人羧肽酶(CB)，例如肥大细胞的CB-A、胰CB-B或细菌羧肽酶—细菌β-内酰胺酶—细菌胞嘧啶脱氨酶—人过氧化氢酶或过氧化物酶
—磷酸酶，特别是人碱性磷酸酶、人酸性前列腺磷酸酶或5型酸性磷酸酶—氧化酶，特别是人赖氨酰氧化酶或人酸性D-氨基氧化酶—过氧化物酶，特别是人谷胱甘肽过氧化物酶、人嗜酸性过氧化物酶或人甲状腺过氧化物酶—半乳糖苷酶b)自身免疫病和炎症的治疗b.1)靶细胞—增殖的内皮细胞或—巨噬细胞和/或淋巴细胞，或—滑膜细胞b.2)用于治疗变态反应的效应物，例如—IFNβ—IFNγ—IL-10—抗IL-4的抗体或抗体片段—可溶性IL-4受体—IL-12—TGFβb.3)预防移植器官排斥的效应物，例如—IL-10—TGFβ—可溶性IL-1受体—可溶性IL-2受体—IL-1受体拮抗剂—可溶性IL-6受体—免疫抑制抗体或其含VH和VL片段，或通过接头连接的其VH和VL片段。免疫抑制抗体是，例如，T细胞受体或其CD3复合物特异的抗体，抗CD4或CD8抗体，抗IL-2受体、IL-1受体或IL-4受体抗体，或抗粘附分子CD2、LFA-1、CD28或CD40的抗体。
b.4)用于治疗抗体介导的自身免疫病的效应物，例如—TGFβ—IFNα—IFNβ—IFNγ—IL-12—可溶性IL-4受体—可溶性IL-6受体—免疫抑制抗体或其含VH和VL片段b.5)用于治疗细胞介导的自身免疫病的效应物，例如—IL-6—IL-9—IL-10—IL-13—TNFα或TNFβ—IL-13—免疫抑制抗体或其含VH和VL片段b.6)细胞增殖抑制剂、细胞抑制或细胞毒性蛋白，和用于活化细胞抑制剂前体的酶这类蛋白质的例子已在部分a.7)中提及。
b.7)用于关节炎治疗的效应物在本发明含义中，选择直接或间接抑制如关节中的炎症和/或促进关节中胞外基质(软骨，结缔组织)重建的效应物。
其包括，例如—IL-1受体拮抗剂(IL-1-RA)；IL-1-RA可抑制IL-1α、β的结合—可溶性IL-1受体；可溶性IL-1受体可结合并灭活IL-1
—IL-6IL-6可增强滑膜细胞和软骨细胞的TIMP和超氧化物的分泌，降低IL-1和TNFα的分泌—可溶性TNF受体可溶性TNF受体可结合并灭活TNF。
—IL-4IL-4可抑制IL-1、TNF-α和MMP的形成和分泌—IL-10IL-10可抑制IL-1、TNF-α和MMP的形成和分泌，增强TIMP的分泌—胰岛素样生长因子(IGF-1)IGF-1可刺激胞外基质的合成。
—TGFβ，特别是TGFβ1和TGFβ2TGFβ可刺激胞外基质的合成。
—超氧化物歧化酶—TIMP，特别是TIMP-1、TIMP-2或TIMP-3c)血液细胞缺陷形成的治疗c.1)靶细胞—增殖的造血系统的不成熟细胞，或—与造血细胞相邻的基质细胞c.2)用于治疗贫血的效应物，例如—促红细胞生成素c.3)用于治疗白细胞减少症的效应物，例如—G-CSF—GM-CSF—M-CSFc.4)用于治疗血小板减少症的效应物，例如—IL-3—白血病抑制因子(LIF)
—IL-11—血小板生成素d)神经系统损伤的治疗d.1)靶细胞—神经胶质细胞或—增殖的内皮细胞d.2)效应物神经元生长因子，例如—FGF—神经生长因子(NGF)脑源性神经营养因子(BDNF)—神经营养因子3(NT-3)—神经营养因子-4(NT-4)—睫状神经营养因子(CNTF)d.3)效应物酶，例如—酪氨酸羟化酶—多巴脱羧酶d.4)效应物可抑制或中和TNFα的神经毒性作用的细胞因子及其抑制剂，例如—TGFβ—可溶性TNF受体TNF受体可中和TNFα—IL-10IL-10可抑制IFNγ、TNFα、IL-2和IL-4的形成—可溶性IL-1受体—IL-1受体I—IL-1受体II可溶性IL-1受体可中和IL-1活性—IL-1受体拮抗剂—可溶性IL-6受体
e)血凝和血液循环系统疾病的治疗e.1)靶细胞—内皮细胞或—增殖的内皮细胞或—内皮细胞和平滑肌细胞附近的体细胞—巨噬细胞e.2)靶结构血凝系统的蛋白质，例如—凝血酶—血纤蛋白e.3)抑制血凝或促进纤维蛋白溶解的效应物，例如—组织纤溶酶原激活物(tPA)—尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)—tPA和uPA的杂合物—蛋白C—蛭素—丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpine)，如C-1S抑制剂、α1-抗胰蛋白酶或抗凝血酶III—组织因子途径抑制剂(TFPI)e.4)促进血凝的效应物，例如—F VIII—F IX—血管性假性血友病因子—F XIII—PAI-1—PAI-2—组织因子及其片段e.5)效应物血管生成因子，例如—VEGF—FGF
—Tie-1—Tie-2e.6)降低血压的效应物，例如—激肽释放酶—内皮细胞一氧化氮合酶e.7)在内皮层损伤后抑制平滑肌细胞增殖的效应物，例如—抗增殖、细胞抑制或细胞毒性保护素，或—可将细胞抑制剂前体切割为细胞抑制剂的酶，如以上所述(a.7部分)e.8)效应物其他血浆蛋白，例如—C1灭活剂—血清胆碱酯酶—转铁蛋白—1-抗胰蛋白酶f)接种f.1)靶细胞—肌细胞或—巨噬细胞和/或淋巴细胞f.2)用于预防传染病的效应物以常规方法制备有效疫苗的可能性有局限性。
所选择的效应物是由传染病原体形成的蛋白质、糖蛋白或脂蛋白，其通过引发免疫反应，即通过抗体结合和/或利用细胞毒性T淋巴细胞，导致病原体的中和和/或消除。这类所谓的中和抗原已经用作疫苗抗原(参见Ellis，实验医学生物学进展(Adv.Exp.Med.Biol.)327，263(1992)的综述)。
优选地，在本发明的含义内，使用下列病原体的中和抗原—A型流感病毒—HIV—狂犬病病毒
—HSV(单纯疱疹病毒)—RSV(呼吸道合胞体病毒)—副流感病毒—轮状病毒—VZV(水痘-带状疱疹病毒)—CMV(巨细胞病毒)—麻疹病毒—HPV(人乳头瘤病毒)—HBV(乙型肝炎病毒)—HCV(丙型肝炎病毒)—HDV(丁型肝炎病毒)—HEV(戊型肝炎病毒)—HAV(甲型肝炎病毒)—霍乱弧菌抗原—布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)—幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)—疟疾抗原—然而，本发明含义内的效应物也包括抗独特型抗体或其抗原结合片段，其抗原结合结构(互补决定区)是传染病原体的中和抗原的蛋白质或糖类结构的拷贝。
这类抗独特型抗体特别能代替传染性细菌病原体中的糖类抗原。
这类抗独特型抗体及其裂解产物已由Hawkins等人(免疫治疗杂志(J.Immunother.)14，273(1993))和Westerink和Apicella(免疫病理学讨论(Springer Seminars in Immunopathol.)15，227(1993))清楚地描述。
f.3)效应物肿瘤抗原—其包括肿瘤细胞上的抗原。这类抗原已由如Sedlacek等人(肿瘤学稿件32，Karger Verlag，慕尼黑(1998)和肿瘤学稿件43，KargerVerlag，慕尼黑(1992))清楚地描述。
其他例子有下列抗原，或，例如对应于下列抗原的抗独特型抗体—唾液酰Lewis—可被T细胞识别的肿瘤上的肽—癌基因表达的蛋白质—血型抗原及其前体—多形上皮粘蛋白上的抗原—热激蛋白上的抗原g)慢性传染病的治疗g.1)靶细胞—肝细胞—淋巴细胞和/或巨噬细胞—上皮细胞—内皮细胞g.2)效应物，例如—具有细胞抑制、凋亡或细胞毒性作用的蛋白质—可将抗病毒或细胞毒性物质切割为活性物质的酶g.3)效应物抗病毒蛋白—抗病毒活性细胞因子和生长因子。其包括，例如，IFNα、IFNβ、IFN-γ、TNFβ、TNFα、IL-1或TGFβ—如已述的可灭活多种病毒或产生其含VH和VL片段或经接头连接的其VH和VL片段的特异性抗体抗病毒抗原的抗体有，例如抗HBV抗HCV抗HPV抗HIV抗EBV抗HTLV抗柯萨奇病毒抗汉坦病毒—Rev-结合蛋白。这些蛋白质可结合Rev RNA，抑制反转录基因表达的Rev-依赖的转录后阶段。Rev-结合蛋白的例子有RBP9-27RBP1-8URBP1-8DRBP1-8的假基因g.4)效应物抗细菌蛋白抗细菌蛋白包括，例如，可中和细菌毒素或调理细菌的抗体。例如，其包括抗下列物质的抗体脑膜炎球菌C或B大肠杆菌疏螺旋体(Borrelia)假单胞菌(Pseudomonas)幽门螺杆菌金黄色葡萄球菌h)相同或不同效应物的组合在本发明的含义中，优选两种不同的成分d)，其至少具有一种附加作用，通过成分b)和c)彼此复合。
在本发明的含义中，优选效应物的组合，例如h.1)肿瘤的治疗—相同或不同的、细胞抑制、凋亡、细胞毒性和/或炎症刺激蛋白，或—可切割细胞抑制剂前体的相同或不同的酶h.2)自身免疫病的治疗—具有抑制细胞和或体液免疫反应的协同作用的不同细胞因子或受体，或—不同或相同的TIMPh.3)血细胞缺陷形成的治疗不同的分级连续细胞因子，如IL-1、IL-3、IL-6或GM-CSF和促红细胞生成素、G-CSF或血小板生成素h.4)神经细胞损伤的治疗—神经元生长因子和细胞因子或细胞因子抑制剂h.5)血凝及血液循环系统疾病的治疗—抗凝剂和纤溶剂(例如，tPA或uPA)或—细胞抑制、凋亡或细胞毒性蛋白和抗凝剂或纤溶剂—几种不同的协同作用的凝血因子，例如，FVIII和vWF或FVIII和FIXh.6)接种—抗原和免疫刺激细胞因子，如IL-1α、IL-1β、IL-2、GM-CSF、IL-3或IL-4受体—一种传染病原体或不同传染病原体的不同抗原，或—一种肿瘤类型或不同肿瘤类型的不同抗原h.7)病毒传染病的治疗—抗病毒蛋白和细胞抑制、凋亡或细胞毒性蛋白—抗一种病毒或几种病毒的不同表面抗原的抗体h.8)细菌传染病的治疗—抗不同表面抗原和/或微生物毒素的抗体4.用于基因治疗的病毒和非病毒载体的多功能配体多功能配体已在专利申请EP-A 0 846 772中详细描述。特地引用该专利申请。
用作多功能配体时，选择针对一种细胞靶结构的成分a)。部分3)中已经提到了对于细胞靶结构特异的配体(成分a))的例子。
对于多功能配体，选择效应物(成分d))，使其能结合病毒载体或非病毒载体。这类效应物有，例如—病毒如AdV、AAV、慢病毒、RTV、痘苗病毒、HSV、流感病毒、HJV的细胞受体
—对于病毒蛋白、非病毒载体或核酸特异的重组抗体，如IgG、F(ab)2、Fab、重组Fv、二价抗体(diabody)或单链、双抗原结合蛋白—具有可与病毒蛋白偶联的反应性基团的肽—具有特定核酸序列结合亲和力的肽优选地，成分d)是人抗体的完整抗体分子或表位结合片段。
鼠单克隆抗体优选地以人源化形式使用。人源化以Winter等人(自然349，293(1991))和Hoogenboom等人(输血血液生物学综述36，19(1993))所述的方法进行。抗体片段和重组Fv片段按照现有技术如前所述制备。
使用双价还是单价片段取决于抗体特异性和基因构建体的选择。如果所选择的抗体不利地影响病毒基因构建体外壳蛋白的融合活性(如Ubol等人(病毒学杂志69 1990(1995))所述)，则优选单价抗体片段。
抗体特异性取决于所使用的基因构建体的类型。
—如果基因构建体本身是裸RNA或裸DNA，或作为与非病毒载体的复合物，根据本发明的实施方案之一是，抗体的特异性针对已导入DNA中的表位。
这类表位能通过异种物质与DNA结合产生。其例子有*顺铂对DNA的交联*烷化剂如氮芥、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥对鸟嘌呤N7上的烷化*蒽环霉素如阿霉素、柔红霉素的DNA双螺旋中的嵌入抗这类DNA上新引入的表位的单克隆抗体，例如—抗甲基化DNA的抗体—抗O6-乙基脱氧鸟苷抗体(用乙基亚硝基脲处理DNA后)—抗N7-乙基鸟嘌呤抗体—抗N5-甲基-N5-甲酰-2，5，6三氨基-4-羟基嘧啶—抗O6-甲基-2’-脱氧鸟苷、O6-乙基-2’-脱氧鸟苷、O6-正丁基-2’-脱氧鸟苷、O6-异丙基-2’-脱氧鸟苷、O4-甲基-2’-脱氧胸苷、O4-乙基-2’-脱氧胸苷的抗体—抗苯丙氨酸氮芥与DNA的加合物的抗体
—抗蒽环霉素抗体然而，由于DNA代谢过程中DNA的甲基化，在DNA中也产生新表位。
已知大量大肠杆菌株，它们可使导入其中的质粒DNA上的N6腺嘌呤甲基化(Winnacker，《从基因到克隆》，18/19页，VCH Publisher，Weinheim(1987))。细菌具有酶DNA腺嘌呤甲基化酶，该酶在复制期间特异地甲基化N6位腺嘌呤(Hattman等人，分子生物学杂志126,367(1978))。
本发明因而特别涉及抗甲基化DNA——特别是抗甲基化N6腺嘌呤—单克隆抗体在根据本发明的配体系统中的应用。
—如果基因构建体与一种非病毒载体复合，本发明的另一特别实施方案是，抗体的特异性针对该载体上的一种表位。
这些载体包括阳离子聚合物、肽、蛋白质、聚酰胺或阳离子脂类，如阳离子脂和磷脂。抗这类载体的抗体的例子有※抗亚精胺、精胺或腐胺抗体※抗聚赖氨酸抗体※抗白蛋白抗体※抗磷脂抗体※抗聚乙烯亚胺抗体—如果基因构建体是一种病毒，则抗体特异性针对病毒外壳蛋白上的一种或多种相同或不同的表位。由于所用的配体系统中的接头优选地是一种融合肽或蛋白，也能使用通过与外壳蛋白结合而不利地影响病毒的细胞粘附和/或融合活性的抗体。
能用作载体的抗病毒外壳蛋白的抗体是，例如，抗下列病毒的抗体※鼠白血病病毒※HIV病毒※腺病毒※单纯疱疹病毒※巨细胞病毒
※小鼠细小病毒※腺伴随病毒※新培斯病毒※痘苗病毒在本发明的另一个优选的实施方案中，成分d)是Fc受体的胞外部分。已提及的抗体之一，其可直接或间接结合含抗原结合部分的基因构建体，通过其Fc部分与Fc受体结合。
在本发明的另一个优选实施方案中，成分d)是一种阳离子结构单位，如，阳离子氨基酸、阳离子肽或蛋白质或生物胺，它们能与基因构建体复合。
这些阳离子结构单位包括，例如—赖氨酸或聚赖氨酸—精氨酸或聚精氨酸—组氨酸或聚组氨酸—含有至少1个赖氨酸、1个精氨酸和/或1个组氨酸的肽—多胺，如尸胺、亚精胺、精胺、胍丁胺或腐胺在另一个优选的实施方案中，成分d)是携带转基因的病毒外壳蛋白的受体。
例如已对于下列病毒描述了这类受体—HIV※CD4分子(可溶的或天然的)※半乳糖苷神经酰胺※趋化因子受体—HBV※IL-6受体※膜联蛋白或载脂蛋白—HTLV※IL-2受体(β和γ链)—麻疹病毒
※CD46分子—弗兰德白血病病毒※促红细胞生成素受体—水痘-带状疱疹※人免疫球蛋白G的Fc片段—仙台病毒※血型糖蛋白—C型流感病毒※N-乙酰-9-乙酰氨基-9脱氧神经氨酸※9-O-乙酰基-N-乙酰神经氨酸—口蹄疫病毒※整联蛋白αVβ3—EBV※补体受体2(CD21)—单纯疱疹病毒※275kDa甘露糖-6-磷酸受体或46kDa甘露糖-6-磷酸受体—腺病毒※CAR(柯萨奇腺病毒受体)5.融合肽或转运肽的插入对于多价蛋白质复合物，其中效应物(成分d)必须穿透胞内起预防或治疗作用，或作为一种多功能配体，将一种载体插入细胞质中，融合肽将与该效应物连接。该融合肽能插入成分c)和d)之间或与成分d)连接。融合肽包括，例如—含有假单胞菌外毒素A的转位域(域II)的肽—含有肽GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQ ID NO.1)的肽—含有肽AALAEA[LAEA]4LAAAAGC(SEQ ID NO.2)的肽—麻疹病毒融合蛋白的含有肽FAGV-VLAGAALGVAAAAQI(SEQ ID NO.3)的肽
—流感A型HA2蛋白的含有肽GLFGAIAGFIEGGWWGMIDG(SEQ ID NO.4)的肽—含有肽GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG(SEQ ID NO.5)或下列肽的肽GLFGAIAGFIE； (SEQ ID NO.6)ALFGAIAGFIE； (SEQ ID NO.7)LFLGAIAGFIE； (SEQ ID NO.8)LLLGAIAGFIE； (SEQ ID NO.9)LILGAIAGFIE； (SEQ ID NO.10)GIFGAIAGFIE； (SEQ ID NO.11)GLLGAIAGFIE； (SEQ ID NO.12)GLFAAIAGFIE； (SEQ ID NO.13)GLFEAIAGFIE； (SEQ ID NO.14)GLFGAMAGFIE； (SEQ ID NO.15)GLFGAIAGLIE； (SEQ ID NO.16)GLFGAIAGFIV； (SEQ ID NO.17)GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG(SEQ ID NO.18)或GLLEALAELLEGGWEGLLEG(SEQ ID NO.19).
在本发明说明书中，还可使用具有融合性质的病毒蛋白。许多病毒含有融合和/或转运外壳蛋白，例如副粘病毒、反转录病毒和疱疹病毒。其包括，例如，HIV的TAT蛋白或其转运氨基酸序列或HSV的VP22蛋白。
许多病毒还含有负责病毒附着和随后的细胞膜融合的糖蛋白(Gaudin等人，普通病毒学(J.Gen.Viro.)76，1541(1995))。
这类蛋白质例如由甲病毒、弹状病毒和正粘病毒形成。
本发明含义内的病毒融合蛋白已由Hughson(现代生物学(Curr.Biol.)5，265(1995))、Hoekstra(生物能量学与生物膜杂志(J.BioenergeticsBiomembranes)22，675(1990))和White(生理学年述(Ann.Rev.Physiol.)52，675(1990))清楚地描述。
本发明含义内的融合蛋白是，例如—A型或B型流感病毒的血凝素，特别是HA2成分—A型流感病毒的M2蛋白本身或与流感病毒血凝素或A型流感神经酰胺酶突变体结合使用，其缺乏酶活性，但可引起血细胞凝集。
—流感病毒血凝素的肽类似物6.蛋白酶切割序列的插入本发明还涉及多功能蛋白质复合物，其在成分a)与b)或成分c)与d)之间含有可被蛋白酶切割的肽序列。利用这些蛋白酶，能从配体(成分a)或配体与突变蛋白[成分a)、b)和c)]上切下效应物，并且该效应物例如在多价蛋白质复合物浓度的游离形式时能显示其作用。
本发明特别涉及可被肿瘤中或肿瘤细胞或炎症细胞形成的蛋白酶切割的切割序列。
酶切割序列的例子—纤溶酶原激活物—前列腺特异性抗原—组织蛋白酶—溶基质素—胶原酶和—纤溶酶原在专利申请EP-A 0 859 058中列出，在此特别引用。
本发明还涉及含有可被病毒形成的蛋白酶切割的切割序列的多价蛋白质复合物。
反转录病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒、肝炎病毒、痘病毒、巨细胞病毒和登革热病毒的酶的切割序列的例子在德国专利申请DE 198 50987.1(未公布)中列出，在此特别引用。
本发明还涉及含有可被细胞释放的蛋白酶切割的切割序列的多价蛋白质复合物。
这类蛋白酶的例子是，例如，胱天肽酶(caspase)如胱天肽酶1、2、3、4、5、6、7、8和9。
专利申请DE 198 50987.1(未公布)中列出了相关的切割序列，在此特别引用。7.用于控制基因表达的合成转录因子专利申请EP-A 0 805 209中描述了激活物反应性启动子。在本发明中特别引用。这些激活物反应性启动子被一种合成转录因子激活，该转录因子原则上由两种激活物亚基——亚基A和亚基B组成。这两种亚基都含有结合蛋白(A、B)。在EP-A 0 805 209中，选择可自然形成复合物AB，使得亚基A与亚基B连接，产生功能转录因子复合物的结合蛋白(A、B)。本发明涉及激活物反应性启动子的合成转录因子，其中结合蛋白A+B是突变的结合蛋白。
该合成转录因子复合物的最简单形式由下列成分组成成分a) 至少一种反应配偶体的配体＝激活域成分b) 一种突变的结合蛋白，使其只与成分c)连接成分c) 一种突变的结合蛋白，使其只与成分b)连接成分d) 至少一种效应物＝DNA结合域本发明还涉及编码根据本发明的转录因子复合物的核酸构建体。该核酸构建体的表达受启动子如专利申请EP-A 0 805 209中所列启动子的控制，在此特别引用。8.新型分析与诊断系统本发明涉及用于定性或定量分析或诊断反应物的分析或诊断系统的新型复合物形成蛋白质。
在这类诊断系统中，成分a)是参加与待分析的反应物特异结合的至少一种配体。该配体直接或间接连接至少一种突变结合蛋白[成分b)1-b)n]，使得产生成分ab。另外，至少一种突变结合蛋白[成分c)1-c)n]，其能通过至少两个结合位点与成分b)二聚化)与至少一种效应物(成分c)连接，其中该效应物是一种发出信号的物质(分析物)。成分cd是由于成分b)与成分c)的组合产生的。
成分ab通过a)与反应物结合。利用成分ab与成分bc的复合物形成，能测定通过成分a)与成分ab结合的反应物的量。
该诊断系统例如能在所示的两个实施方案中使用(见图1和图2)在第一个实施方案中(见图1)，成分b)是一种同型(或异型)多聚体[成分b)1-b)n]，许多相同(或不同)的成分c)与之结合，在所有情况下均作为单体或与成分d)连接。
利用该实施方案，许多发出信号成分[分析物，成分d)]与待分析的反应物结合，提高了系统的灵敏度。
在第二个实施方案中(见图2)，成分b)和成分c)都是多聚体，只有一种或少数成分d)与成分c)结合。在该实施方案中，尽管只有少数成分d)与被分析的反应物结合，但成分c)与d)之间的结合极强，能提高被分析的反应物的检测特异性。
在本发明的另一特别实施方案中，成分c)[c1-cn]与至少一种成分b[b1-bn]结合，至少一种成分cd能与之二聚化。图1b显示了这样一个例子。
这种特殊实施方案大大提高了检测系统的灵敏度。
借助于根据本发明的分析或诊断系统，能在固相中或固相上、在液体如体液中、在细胞上和在组织中测定反应物。
根据本发明，成分a)可以是—一种核苷酸序列。如果选择核苷酸序列，应当末端衍生[例如根据WO95/02422，或通过插入核苷酸结合蛋白(如，LexA、Gal4或转录因子)或抗体的结合序列]，使得成分b)能通过核苷酸结合蛋白或通过抗体的抗原结合部分与之直接或间接偶联。
—细胞受体的配体—病毒外壳蛋白—病毒外壳蛋白的细胞受体
—生长因子、细胞因子、趋化因子、肽类激素、介质或类固醇的细胞受体—与配偶体蛋白连接，从而参与生物反应链的蛋白质，例如，补体因子、凝血因子、激肽系统、纤维蛋白溶解系统的因子，或血浆或细胞酶抑制剂或血浆或细胞酶—Fc受体胞外部分，靶细胞特异的抗体通过Fc部分与之结合—抗体分子或鼠或人抗体分子的表位结合部分重组抗体片段如部分3)所述制备。
在根据本发明的分析或诊断系统中，信号发出成分，分析物(成分d)例如可以是荧光分子，引起化学荧光反应的分子，酶，如可切割造就待测底物的磷酸酶或过氧化物酶，同位素或金属。
利用根据本发明的分析与诊断系统，待测反应物与过量的成分混合。例如，通过洗涤去除不与待测反应物结合的成分ab级分。随后，与反应物结合的成分用过量成分cd处理，例如通过洗涤去除不与成分ab结合的成分bc级分，测定通过成分ab和c)与反应物结合的成分d)。
阐明本发明主题的实施例激活物反应性启动子单元的制备与检测制备激活物反应性启动子单元，其中激活物亚基A与激活物亚基B连接(见图3)。利用突变的c-jn和突变的c-fos进行组合(见图4)。该复合物是可激活激活物反应性启动子的转录因子。
根据本发明的激活物反应性启动子单元在下游接连由下列不同核苷酸序列组成激活物亚基A—细胞周期蛋白A基因的启动子(核酸-214-+100；Zwicker等人，EMBO J.14，4514(1995))—SV40的核定位信号(NLS)(SV40大T，氨基酸126-132；PKKKRKV(SEQ ID NO.20)，Dingwall等人，TIBS 16，478(1991)—HSV1 VP16的酸性反式激活域(TAD)(VP16，氨基酸411-455；Triezenberg等人，基因进展(Genes Dev.)2，718(1988))—c-jun蛋白的亮氨酸拉链部分的cDNA(氨基酸276-312；Mark等人，自然373，257(1995))，其中氨基酸283、288和302突变(m-jun)。
突变的描述(图2)氨基酸283K→E氨基酸288K→E氨基酸302R→E激活物亚基B—酪氨酸酶基因的启动子(2×增强子序列，核酸-2014～-1820，和核启动子核酸-209～+51；Shibata等人，生物化学杂志267，20584(1992))—SV40的核定位信号(NLS)(SV40大T，氨基酸126-132；PKKKRKV(SEQ ID NO.20)，Dingwall等人，TIBS 16，478(1991)—Gal4蛋白的DNA结合域的cDNA(氨基酸1-147，Chasman和Kornberg，分子细胞生物学10，2916(1990))—c-fos蛋白的亮氨酸拉链部分的cDNA(氨基酸160-196；Mark等人，自然373，257(1995))，其中氨基酸167、172和181突变(m-fos)。
突变的描述(图2)氨基酸167E→K氨基酸172E→K氨基酸181E→K突变c-fos与突变c-jun的二聚化激活物亚基A和B的表达产物通过突变c-fos亮氨酸拉链与突变c-jun亮氨酸拉链结合而二聚化。
如下检测激活物亚基A和B的二聚化，即突变c-fos亮氨酸拉链与突变c-jun亮氨酸拉链的结合在有或无(S35)-甲硫氨酸时在体外翻译系统(TNT T7快速偶联转录/翻译系统，Promega，Madison，WI)中合成蛋白质。随后，合成的蛋白质(m-jun-VP16和m-fos-Gal4)以1∶1混合通过凝胶电泳分离复合物，并在免疫沉淀后用抗-GAI4抗体分析。
获得下列结果—蛋白质m-jun-VP16能与蛋白质m-fos-GAL4连接。
—蛋白质m-jun-VP16不能与蛋白质wt-fos-GAL4连接，而蛋白质wt-jun-VP16不能与蛋白质m-fos-GAL4连接(见表1)。
二聚蛋白质是激活物反应性启动子10×的嵌合转录因子(Gal4-SV40)。激活物反应性启动子和效应系统激活物反应性启动子具有下列组成—具有核苷酸序列5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’的Gal4-结合蛋白的10×结合序列(Webster等人，细胞52，169(1988)；SEQ IDNO.21)—SV40的基础启动子(核酸48-5191；Tooze(编)，DNA肿瘤病毒(冷泉港，纽约，冷泉港实验室))—报道基因萤光素酶(Luc)的cDNA(Nordeen，生物技术6，454(1988))图5显示了核苷酸序列及其激活单位的顺序。
这样制备的核苷酸构建体克隆到pGL3质粒载体(Promega；Madison，USA)中，直接使用，或在胶体分散系统中体内使用。
完整激活反应性启动子单位的作用如下启动子细胞周期蛋白A以细胞周期特异的方式调节VP16激活域和突变c-jun亮氨酸拉链(激活亚基A)的组合cDNA的转录(图3)。
启动子酪氨酸酶限制Gal4结合域、SV40的NLS和黑素瘤细胞上的突变c-fos亮氨酸拉链(激活亚基B)的组合cDNA的转录(图3)。
二聚体蛋白是激活物反应性启动子(Gal4结合域的DNA序列/SV40启动子)和效应基因(＝报道基因＝萤光素酶基因)转录的一种嵌合转录因子(图5)。构建体的制备构建体各种成分的连接和向质粒(pGL3，Promega，Madison WiUSA)中的插入(图6)通过经PCR扩增在不同元件末端所含的合适的限制酶切位点进行。利用限制位点特异的和本领域技术人员所知的酶和DNA连接酶进行连接。这些酶能商品获得。
使用所述质粒，用本领域技术人员所知的DOTAP法(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)转染培养物中保持的肿瘤细胞(MeWo人黑素瘤细胞，PC3人前列腺细胞)，并测定这些细胞产生的萤光素酶的量(Herber等人，癌基因9，1295(1994)；Lucibello等人，EMBO J.14，132(1995)和Jerome等人，人类基因治疗(Hum.Gen.Ther.)，印刷中(1998))。
为了检查细胞周期特异性，通过去除甲硫氨酸使肿瘤细胞在G0/G1期同步化48小时。BrdU掺入显示，MeWo和PC3细胞能在去除甲硫氨酸后同步(Jerome等人，人类基因治疗，印刷中(1998))。结果获得下列结果在转染的MeWo和PC3细胞中，能测定到较未转染的肿瘤细胞显著增多的萤光素酶(表2和表3)。
增殖的MeWo(DNA＞2S)形成比G0/G1同步的肿瘤细胞(DNA＝2S)和增殖的PC3细胞显著增多的萤光素酶(表2和表3)。
含有突变亮氨酸拉链的激活物亚基A和B不能与内源c-fos和c-jun结合(表2)。
含有突变亮氨酸拉链的激活物亚基A和B比专利申请EP-A 0 805209所详述的含CD4和LCK的系统(表2)更有活性，这是由于突变c-fos亮氨酸拉链与突变c-jun亮氨酸拉链的强烈结合。
因此，激活物反应性启动子单元引起细胞特异的、细胞周期依赖的萤光素酶基因表达(表4)。应用fos/jun系统的其他结果新型复合物形成蛋白质在黑素瘤和肺癌异种移植物中的活性通过皮内注射106MeWo细胞向裸鼠中引入黑素瘤异种移植物。
通过皮下注射2×107H322细胞(H3 22，支气管肺泡癌，人ATCC号CRL 5806)向裸鼠中引入肺癌异种移植物。
当异种移植物达到4mm大小时，将其与5％葡萄糖、0.01％TritonX100载体溶液中的下列质粒组合肿瘤内同时注射。
质粒组合—6ng pRL-SV40载体(Promega公司)+30μg pGL3启动子载体(Promega公司)—6ng pRL-SV40载体(Promega公司)+15μg 10×BS Gal4-SV40-luc+15μg Tyr-m-fos-CycA-VP16—6ng pRL-SV40载体(Promega公司)+15μg 10×BS Gal4-SV40-luc+15μg Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun。
所有这些质粒都用endofree QIAGEN质粒Maxi试剂盒(QIAGENInc.)分离。
pRL-SV40载体用作内部控制，以标准化不同异种移植物的结果。
注射24小时后，杀死小鼠，剥离出肿瘤并机械粉碎，利用双萤光素酶报道基因测定系统(Promega公司)测定裂解液中的萤光素酶活性。结果表示为萤火虫萤光素酶活性与pRL-SV40活性的比值，并翻译为蛋白质浓度。
结果(见表5)1.在两种类型的异种移植物——黑素瘤和肺癌异种移植物中，组成型表达的启动子SV40(pGL3启动子构建体)导致萤火虫萤光素酶活性的检测。
2.在两种类型的异种移植物中，注射15μg 10×BS Gal4-SV40-luc+15μg Tyr-m-fos-CycA-VP16后未发现有萤火虫萤光素酶活性。
3.萤火虫萤光素酶活性只在注射15μg 10×BS Gal4-SV40-luc+15μg Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun的黑素瘤异种移植物中发现。这表明fos-jun系统引起黑素瘤异种移植物中萤光素酶活性的选择性表达。
受fos/jun系统控制的效应基因的表达具有生物学效应。
为了分析fos/jun系统引起生物学作用的能力，将报道基因萤光素酶替换为Bax cDNA(Oltvai等人，1993)。为了能分析转染的细胞，这些细胞用CMV-luc共转染。大量萤光素酶组成型表达，这可用萤光素酶测定法容易地测定，因此可计算存活的转染细胞的百分数。
如制造商所述，用lipofectin(Gibco BRL Inc.)或DOTAP(Boehringer Mannheim Inc.)转染MeWo(人黑素瘤)和H322(支气管肺泡肺癌)细胞系。细胞用下列质粒共转染pCDNA3(Invitrogen Inc.；对照)1ng CMV-luc+1μg Tyr-m-fos-CycA-VP16+1μg pCDNA3CMV-bax(Bax cDNA，在pCDNA3中克隆)1ng CMV-luc+1μgTyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun+1μg CMV-baxpBax(对照)1 ng CMV-luc+1μg Tyr-m-fos-CycA-VP16+1μgpBax10×BS Gal4-SV40-bax1ng CMV-luc+1μg Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun+1μg10×BS Gal4-SV40-bax。
在用pCDNA3和pBax(不表达Bax cDNA的对照质粒)共转染的情况下测定的萤光素酶值假定为转染细胞的100％存活率。
转染48小时后，收集细胞，测定萤光素酶活性。
结果(见表6)1.如果Bax cDNA受组成型CMV启动子控制，两种细胞型中存活的转染细胞的百分数降至9-10％的MeWo细胞和32-36％H322细胞。
2.如果Bax cDNA受10×BS Gal4-SV40启动子控制，若MeWo细胞用对照质粒(Tyr-m-fos-CycA-VP16)共转染则存活的转染细胞的百分数为100％，若使用Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun则降至36％。对于H3 22细胞，两种情况下存活转染细胞的百分数均为100％。
这些结果显示，黑素瘤中fos-jun系统的激活足以引起在非黑素瘤细胞中未发现的生物学效应(细胞破坏)。腺病毒转移后fos-jun系统在黑素瘤中的选择性表达如He等人(1998)所述，利用细菌重组将Tyr-m-fos-CycA-VP16、Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun和10×BS Gal4-SV40-luc转录盒克隆到人E1/E3缺失的腺病毒(血清型5)中。
MeWo和H322细胞用AdTyr-m-fos-CycA-VP16+Ad10×BS Gal4-SV40-luc或用AdTyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun+Ad10×BS Gal4-SV40-luc同时感染6小时，并在注射48小时后测定萤光素酶活性。
两种细胞系中的活性与用AdSV40-luc(使用SV40启动子(-138/+45)的人E1/E3-缺失的腺病毒(血清型5)，D.M.Nettelbeck，未公开的数据)获得的结果比较。
结果(见表7)对于两种细胞系，对照腺病毒(AdTyr-m-fos-CycA-VP16)共感染导致萤光素酶活性的弱表达，而比AdSV40-luc高70倍的高活性只在注射AdTyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun后的MeWo细胞中发现。
在向腺病毒载体中转移fos-jun系统后，fos-jun系统在黑素瘤中的选择性表达保持。
图例图1(a)新型复合物形成蛋白质的图示，可能性1(b)可能性1的变体图2新型复合物形成蛋白质可能性2的图示。图3根据实施例的激活物反应性启动子单元A和B。图4根据实施例的c-jun和c-fos的突变。图5激活物反应性启动子和效应基因。图6用于表达根据本发明的复合物形成蛋白质的核酸构建体。
表1免疫沉淀后的蛋白质-蛋白质相互作用
表2MeWo细胞中的萤光素酶活性
表3PC3细胞中的萤光素酶活性
表4细胞特异的、细胞周期依赖的萤光素酶基因表达
表5黑素瘤和肺癌异种移植物中的萤光素酶活性
对于标准差n＝5表6存活的转染细胞占MeWo和H322细胞的百分数所有细胞均用1 ng CMV-luc作为转染细胞的标记共转染
表7腺病毒转移后黑素瘤中的选择性基因表达
权利要求
1.非天然存在的特异复合物形成蛋白质的复合物，其中在该复合物中含有下列成分a)至少一种对于靶结构特异的配体，b)至少一种含有突变的二聚化结构域的蛋白质，该突变的二聚化结构域来源于天然存在的二聚化结构域的突变，该突变的二聚化结构域能与成分c)特异性地相互作用，且成分b)与成分a)共价键合，c)至少一种含有突变的二聚化结构域的蛋白质，该突变的二聚化结构域来源于天然存在的二聚化结构域的突变，该突变的二聚化结构域能与成分b)特异性地相互作用，且成分c)与成分d)共价键合，和d)至少一种效应物。
2.如权利要求1所述的复合物，其中成分a)被成分d)替换。
3.如权利要求1所述的复合物，其中成分d)被成分a)替换。
4.如权利要求1-3之一所述的复合物，其中还含有一种融合肽或转运肽。
5.如权利要求1-4之一所述的复合物，其在成分c)与d)或a)与b)之间含有蛋白酶的切割序列。
6.如权利要求1-5之一所述的复合物，其中配体(成分a)选自生长因子、细胞因子、TNF、趋化因子、肽类激素、介体、类固醇激素、维生素、补体因子、凝血因子、激肽系统或纤维蛋白溶解系统的因子、血浆或细胞酶、血浆或细胞酶抑制剂、病毒外壳蛋白、前述蛋白质和活性化合物之一的细胞受体、抗体、抗体裂解产物如F(ab)2、单链Fv、单链、双抗原结合分子、Fc片段、DNA结合蛋白、转录因子的DNA结合域和转录因子的激活域。
7.如权利要求1-6之一所述的复合物，其中成分b)和c)来源于彼此自然结合的蛋白质。
8.如权利要求7所述的复合物，其中彼此自然结合的蛋白质选自如下天然二聚化配偶体Fos Jun或Jun B或Jun DFRAU-1 Jun或Jun B或Jun DFRAU-2 Jun或Jun B或Jun DFOS-BJun或Jun B或Jun DOCT-1Jun或Jun B或Jun DNFKB(p65)IKBRas RAFCD4 p56LcKbcl-2bad或bax细胞周期蛋白Acdk1E2F DPCD40 CD40LMyc MaxMyc NMaxMyc LMaxp105(Rb1)AFF-2，E1Ap107(Rb2)E7、E2F或Mycp130 E7、E2F或MycCBL GagTRP TRPMet MetMyb p67或p160VAV p67或p160APC α或β-连环蛋白APC APCVD受体 h-(视黄醛x-受体)RXRα或βT3受体 HRXRα或βMyoD E12E12IdE47IdHHSP90 孕酮受体HHSP90 糖皮质激素受体HHSP90 盐皮质激素受体HHSP90 二噁英受体二噁英受体 ArntHPS90 FKBP59HSP90 环孢素结合蛋白HPS90 Pp60V-srcHSP70 HSF1热激因子1HSP70 HSF2热激因子2
9.如权利要求8所述的复合物，其中彼此自然结合的蛋白质属于螺旋-环-螺旋/亮氨酸拉链家族。
10.如权利要求7-9之一所述的复合物，其中成分b)和c)的二聚化结构域的突变通过引入下列氨基酸进行—在所有情况中在天然存在的主要二聚化结构域中引3-18个半胱氨酸；—在所有情况中在天然存在的主要二聚化结构域之一中引入3-24个碱性氨基酸，和在所有情况中在天然存在的主要二聚化结构域的另一个中引入3-24个酸性氨基酸；—在所有情况中在天然存在的主要二聚化结构域之一中引入3-24个疏水性氨基酸，和在所有情况中在天然存在的主要二聚化结构域的另一个中引入3-24个芳族氨基酸；和/或—在所有情况中在天然存在的主要二聚化结构域之一中引入3-24个芳族氨基酸，和在所有情况中在天然存在的主要二聚化结构域的另一个中引入3-24个芳族氨基酸。
11.如权利要求10所述的复合物，其中成分b)和c)是c-fos和c-jun突变的结合域，具有下列突变c-fos氨基酸167E→K172E→K181E→Kc-jun氨基酸283K→E288K→E302K→E。
12.如前述权利要求之一所述的复合物，其中成分d)选自细胞增殖抑制剂、凋亡诱导蛋白、细胞抑制或细胞毒性蛋白、凝集诱导因子、血管发生诱导因子、血管发生抑制因子、生长因子、细胞因子、趋化因子、白细胞介素、干扰素、补体因子、凝血因子、纤溶诱导蛋白、肽类激素、介质、细菌蛋白、(生长因子、细胞因子、趋化因子、白细胞介素、干扰素、补体因子、凝血因子、纤溶诱导蛋白、肽类激素、类固醇激素、介质或病毒外壳蛋白的)受体、病毒抗原、寄生虫抗原、肿瘤抗原、自身抗原、组织抗原、粘附分子、抗体或抗体裂解产物如F(ab)2、Fab、单链Fv、单链双抗原结合蛋白、信号发出成分反应的酶、可将活性物质前体转化为活性物质的酶、荧光染料、同位素、金属结合蛋白、DNA结合域。
13.如权利要求1-12之一所述的复合物在治疗剂生产和疫苗生产中的应用，用于治疗炎症、自身免疫病、血细胞缺陷形成、神经系统损伤、血凝和血液循环系统疾病、肿瘤、病毒和细菌感染。
14.如权利要求1-12之一所述的复合物在与病毒或非病毒载体复合及向生物体细胞或细胞培养物中靶细胞特异地导入该载体中的应用。
15.如权利要求1-12之一所述的复合物在体外或体内检测反应物中的应用。
16.一种编码如权利要求1-12所述的蛋白质的核酸构建体。
17.如权利要求16所述的核酸构建体，其编码激活物反应性启动子单元的激活物亚基。
18.一种含有如权利要求16或17所述的核酸构建体的宿主细胞。
19.如权利要求18所述的宿主细胞，其选自细菌、酵母和哺乳动物细胞。
20.如权利要求18和19之一所述的宿主细胞在制备如权利要求1-12之一所述的复合物中的应用。
21.如权利要求1-12之一所述的复合物的制备，其中(a)借助如权利要求16和17之一所述的核酸构建体表达如权利要求1-12之一所述的复合物的一种蛋白质，(b)借助如权利要求16和17之一所述的核酸构建体表达如权利要求1-12之一所述的复合物的另一种蛋白质，其不同于(a)所述的蛋白质，(c)分离步骤(a)和(b)获得的蛋白质，和(d)彼此复合。
全文摘要
本发明涉及由非天然存在的特异复合物形成蛋白质组成的复合物,其含有下列成分:a)至少一种对于靶结构特异的配体;b)至少一种含有突变的二聚化结构域的蛋白质,该突变的二聚化结构域来源于天然存在的二聚化结构域的突变,该突变的二聚化结构域能与成分c)特异相互作用,且成分b)与成分a)共价结合;c)至少一种含有突变的二聚化结构域的蛋白质,该突变二聚化结构域来源于天然存在的二聚化结构域的突变,该突变的二聚化结构域能与成分b)特异相互作用,且成分c)与成分d)共价结合,和;d)至少一种效应物。本发明也涉及这些复合物的用途和产生,以及编码这些蛋白质的核酸构建体及其用途。
文档编号A61P25/28GK1340103SQ00803763
公开日2002年3月13日 申请日期2000年1月5日 优先权日1999年1月12日
发明者V·杰罗姆, H－H·赛德拉克, R·穆勒 申请人:阿文蒂斯药物德国有限公司