专利名称：具有神经保护作用的7－β－羟基类固醇的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于保护神经细胞免于死亡的一系列3-羟基-7β-羟基类固醇化合物及其一些酮衍生物的用途，它们因此可用于治疗和预防如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、非痴呆性认知损伤(Cognitive ImpairmentNo Dementia)(CIND)、中风、脑外伤、脊髓损伤和周围神经损伤等疾病或其后遗症；而且它们也可用于增强认知功能。
由于在尿中鉴定了7α-羟基DHEA，自从1959年就已知在体内可产生脱氢表雄酮(DHEA)的7α-羟基化代谢产物[J J Schneider，M L Lewbart，Recent Progr.Horm.Res.15(1959)201-230；L Starka等，Clin.Chim.Acta.7(1961)309-316]]。此后报道了来自人的许多器官，包括成人肝和胎肝、睾丸、附睾、皮肤、乳房组织、前列腺、脂肪基质细胞和扁桃体的组织制品中3β-羟基类固醇底物(包括DHEA和表雄酮-EPIA)的广泛7α-羟基化。在大鼠肝和大量的小鼠组织和器官中，DHEA在7位的羟基化也得到验证。但是，对7β-等价物的关注较少或者没有关注。所有这些研究中，7α-羟基-DHEA是迄今为止所产生的最主要的代谢物。事实上，Doostzadeh等[Steroids 63(1998)608-614]已报道由小鼠肝微粒体产生的7α-羟基-DHEA的生产率比7β-羟基-DHEA的生产率多15倍。
而且表明EPIA，DHEA和孕烯醇酮在大鼠脑中也可快速广泛地转化为它们相应的7α-羟基代谢物[J M Guiraud等，Steroids 34(1979)241-248；M Warner等，Endocrinology 124(1989)2699-2706；Y Akwa等，Biochem.J.288(1992)959-964]]。
WO 97/37664公开了包括7α-羟基取代的类固醇的各种化合物在治疗神经精神病、免疫或内分泌失调方面的用途。在WO 97/37664中建议可用这些化合物进行治疗的疾病包括阿尔茨海默氏病。但由于该病的作用机制是假设脑中缺少7α-羟基取代的类固醇而引起的，因此WO 97/37664中所建议的治疗通过服用7α-羟基取代的类固醇以替代缺少的化合物来调整这种缺乏。因此，WO 97/37664描述的程序是治疗已有的疾病，而不是预防疾病或通过阻止神经元的进一步损伤来防止疾病的恶化。所以WO 97/37664并没有描述神经保护作用。而且其还断言活性剂是7α化合物，而7β化合物如果存在，是非活性的。
WO 94/20111还公开了一些DHEA衍生物用于预防或减少组织生存力的丧失，所述组织生存力的丧失是由嗜中性粒细胞对内皮细胞的粘附引起的。但是，这不是引起本发明要治疗的紊乱的机理。
虽然已知在WO 97/37664中公开的化合物的7β-羟基类似物可在体内产生，但其产生的量低于5％，而7α-异构体的产生量超过95％。而且，没有表征负责将这些3-羟基类固醇转化为它们相应的7β-羟基衍生物的酶体系。由于这些理由并考虑到上面概述的研究，从文献中可以清楚地看出，总的结论是7β-异构体是非活性的。因此，如在上面概述的文献中清楚看到的一样，基本上不进行7β化合物的可能的生物活性的研究。
与此结论相反，我们很惊讶地发现7β-羟基取代的类固醇确实具有生物活性，并且该活性不是如WO 97/37664中对7α-羟基-取代的类固醇所描述的活性。更确切地说是神经保护活性，如以前在WO 99/31049中所证实的，虽然是在不同类的化合物中。
对于长时间缺氧或缺血(ischaemia)，可能会或不会造成低血糖，但都会产生不同程度的神经元损伤。
典型地，在心脏病发作时会发生缺血情况，但此时造成的损伤基本上局限在心脏组织，而且已经研发了一些可靠的治疗方法。对于本发明，我们考虑的是短时间或更长时间缺血对脑的影响，如在中风病人中产生的缺血或由于头损伤产生的缺血，以及在衰老过程中的更加缓慢发展的神经变性疾病中的缺血，在衰老过程中，慢性阈下级缺血和/或调和的能量供给可能对观察到的脑退化改变有贡献。缺血的严重程度取决于中风或损伤的性质，但一致的是存在脑部损伤，这是本发明强调的情况。
本领域中已知的各种神经保护制剂都尝试用来减缓脑损伤问题，但就目前而言，所有已知的制剂都有不利的副作用。例如，MK801(dizocilpine maleate)是一种非常简单的分子，可以对缺血病人提供一定程度的神经保护作用。但MK801也具有一定的“神经恐慌效应”(Martindale)，以及不利的运动作用。神经保护作用在Brain Research 755(1997)36-46(Pringle，A.K.，等)中有详细介绍，其作为参考结合在此处。这些作者在早期文章中也介绍了芋螺毒素的神经保护作用，但尽管该化合物具有神经保护作用，在体内却观察到其不利的副作用。
因此，本发明在于3-羟基-7β-羟基类固醇或3-氧代-7β-羟基类固醇及其药用酯用于生产保护神经元免受损伤的药剂的应用。
本发明尤其感兴趣的一类具体的7β-羟基类固醇是3β，7β-二羟基类固醇及其药用酯。
优选的酯是羧酸酯。
可用于本发明的任选取代的3β，7β-二羟基类固醇及其药用酯和它们的其它衍生物的实例是那些化学式(I)的化合物 其中R1和R2彼此是相同的或不同的，并且每个代表氢原子，含有1-6个碳原子的烷基，含有2-6个碳原子的烯基，含有2-6个碳原子的炔基，含有6-10个碳原子的芳基，甲酰基，含有2-7个碳原子的烷羰基，含有3-7个碳原子的烯羰基，含有3-7个碳原子的炔羰基，含有7-11个碳原子的芳羰基，含有8-15个碳原子的芳烷基羰基，含有9-15个碳原子的芳烯基羰基，或如下定义的杂环-羰基；Ra和Rb中的一个代表式-Rc的基团，优选是β构型，而另一个代表氢原子，或者Ra和Rb一起代表一个氧基；
Rc代表含有1-6个碳原子的烷酰基，芳基-羰基，其中芳基部分是含有6-10个环碳原子的芳香碳环基团，如下所定义的杂环-羰基，或者式-OR4的基团，其中R4代表上述对R1和R2所定义的任何一种基团或原子；环A， 是苯环或环己烷环；当环A是环己烷环时，在环B中的虚线代表碳-碳单键或双键，而n为1；或者当环A是苯环时，环B中的虚线代表碳-碳单键，而n为0；所述的杂环-羰基是式R3-CO的基团，其中R3代表含有3-7个环原子的杂环基团，其中1-3个原子是选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子，剩余的一个或多个原子中至少有一个原子是碳原子。
所述的烷基、烯基和炔基和所述的烷羰基、烯羰基和炔羰基的烷基、烯基和炔基部分是取代的或具有至少一个下述的取代基Ψ取代基Ψ羟基，巯基，卤素原子，氨基，含有1-6个碳原子的烷基氨基，其中每个烷基含有1-6个碳原子的二烷基氨基，氨基甲酰基，硝基，含有1-6个碳原子的烷氧基，含有1-6个碳原子的烷硫基，羧基，烷氧羰基和含有6-10个碳原子的非取代芳基；所述的芳基、所述的杂环基团、和所述芳羰基和所述芳烷基羰基的芳基部分是非取代的或具有至少一个下列的取代基ξ取代基ξ取代基Ψ中的任意一个，和含有1-6个碳原子的烷基，含有1-6个碳原子的羟烷基，和含有1-6个碳原子的卤代烷基；以及药用盐及其酯。
更优选地，在式(I)的化合物中R1和R2彼此是相同的或不同的，并且每个代表氢原子，含有1-6个碳原子的烷基，任选取代的苯基，甲酰基，含有2-5个碳原子的烷羰基，含有7-11个碳原子的芳羰基，含有8-15个碳原子的芳烷基羰基，或如下定义的杂环-羰基；Ra和Rb中的一个代表含有1-6个碳原子的烷酰基或式-OR4的基团，其中R4代表上述对R1和R2所定义的任何一种基团或原子，为β构型，而另一个代表氢原子，或者Ra和Rb一起代表一个氧基；
所述的杂环-羰基是式R3-CO的基团，其中R3代表含有3-7个环原子的杂环基团，其中1-3个原子是选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子，剩余的一个或多个原子中至少有一个原子是碳原子。
在本发明中可以使用的3-氧代-7β-羟基类固醇的实例是那些化学式(II)的化合物 其中Ra和Rb和R2如上所定义，并优选一起代表一个氧基。
在本发明的化合物中，当R1，R2，R4或取代基ξ是烷基时，所述烷基可以是含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-乙基丙基、2-乙基丙基、1，1-二甲基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、叔己基和1，1-二甲基戊基，其中含有1-4个碳原子的那些基团是优选的，最优选的是甲基和乙基。
当R1，R2或R4代表烯基时，所述烯基可以是含有2-6个碳原子的直链或支链烯基，其实例包括乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、异丙烯基，甲代烯丙基、1-，2-，3-丁烯基，异丁烯基，1-，2-，3-，4-戊烯基和1-，2-，3-，4-，5-己烯基，其中含有2-4个碳原子的那些烯基是优选的，最优选的是乙烯基和烯丙基。
当R1，R2或R4代表炔基时，所述炔基可以是含有2-6个碳原子的直链或支链炔基，其实例包括乙炔基、1-，2-丙炔基、1-，2-，3-丁炔基、异丁炔基、1-，2-，3-，4-戊炔基和1-，2-，3-，4-，5-己炔基，其中含有2-4个碳原子的那些炔基是优选的。
当R1，R2，R4或取代基Ψ代表芳基时，所述芳基是含有6-10个碳原子的芳香碳环。这些基团的实例包括苯基、1-萘基、2-萘基和茚基，其中苯基是优选的。除了取代基α的情况外，这些基团可以是取代的或非取代的。当该基团被取代时，取代基的数量仅受可取代位置的数量所限制，也许在某些情况下受空间位阻所限制。因此，在苯基的情况下，取代基的最大数量为5，而在萘基的情况下，取代基的最大数量为7等。然而，取代基的优选数量是1-3，取代基的描述如下。
当R1，R2或R4代表烷羰基时，所述烷羰基是烷酰基，其可以是含有2-7个碳原子(即烷基部分有1-6个碳原子)的直链或支链的基团，其实例包括乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基，己酰基和庚酰基，其中含有2-5个碳原子的那些基团是优选的，最优选的是乙酰基和丙酰基。该基团的烷基部分可以是取代的或非取代的，如果是取代的，则取代基选自取代基α。这种取代基的实例包括丙氨酰基、β-丙氨酰基、苯基丙氨酰基、天冬酰胺酰基、半胱氨酰基、乙醇酰基、氨基乙酰基、甲硫氨酰基、鸟氨酰基、甘油酰基、托品酰基、谷氨酰胺酰基、谷氨酰基、高半胱氨酰基、丝氨酰基、高丝氨酰基、苏氨酰基、乳酰基、亮氨酰基、异亮氨酰基、正亮氨酰基、赖氨酰基、缬氨酰基、正缬氨酰基和肌氨酰基。
当R1，R2或R4代表烯羰基时，所述烯羰基可以是含有3-7个碳原子的直链或支链烯羰基，其实例包括丙烯酰基、甲基丙烯酰基、丁烯酰基、异丁烯酰基、3-丁烯酰基、戊烯酰基和己烯酰基，其中含有3-5个碳原子的那些烯羰基是优选的，最优选的是丙烯酰基和甲基丙烯酰基。
当R1，R2或R4代表炔羰基时，所述炔羰基可以是含有3-7个碳原子的直链或支链炔羰基，其实例包括丙炔酰基、3-丁炔羰基、戊炔羰基和己炔羰基，其中含有3-5个碳原子的炔羰基是优选的。
当Rc，R1，R2或R4代表芳羰基时，所述芳羰基的芳基部分可以是上述定义和列举的芳基中的任意一个。优选的芳羰基包括苯甲酰基、邻-，间-，或对-甲苯酰基，邻-，间-，或对-甲氧苯酰基，邻-，间-，或对-羟基苯甲酰基、间三硝苯基、3，4，5-三羟苯甲酰基、3，4-二羟苯甲酰基、香草酰基、3，4-二甲氧苯甲酰基、邻氨基苯甲酰基、1-萘酰基和2-萘酰基。
当R1，R2或R4代表芳烷基羰基或芳烯基羰基时，其中的芳基、烷基或烯基视情况而定，可以是上述定义和列举的那些基团中的任意一个。这种基团的具体实例包括苯乙酰基、3-苯基丙酰基、二苯乙醇酰基、酪氨酰基、2-苯基丙烯酰基、α-苯丙酰基和肉桂酰基。
当Rc，R1，R2或R4代表杂环-羰基时，所述杂环-羰基是式R3-CO-的基团，其中R3代表含有3-7个环原子的杂环基团，其中1-3个原子是氮原子、氧原子或硫原子，剩下的原子是碳原子。至少一个环原子应该是碳原子。当其中有3个杂原子时，优选其中至少一个是氮原子。这种基团的实例包括2-和3-呋喃甲酰基，2-和3-噻吩甲酰基，2-吡啶羰基，烟酰基，异烟酰基，脯氨酰基，哌啶羰基，哌嗪羰基和吗啉代羰基。
当Rc代表烷酰基时，所述烷酰基可以是含有1-6个碳原子的直链或支链基团，其实例包括甲酰基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基，新戊酰基，己酰基和庚酰基，其中含有2-5个碳原子的那些基团是优选的，更优选的是乙酰基和丙酰基，最优选的是乙酰基。
当取代基Ψ或取代基ξ是含有1-6个碳原子的烷基氨基时，烷基部分可以是上述定义和列举的烷基中任意一个。这种烷基氨基的优选实例包括甲氨基，乙氨基，丙氨基，异丙基氨基，丁氨基，异丁基氨基，仲丁基氨基，叔丁基氨基，戊氨基，异戊基氨基，新戊基氨基，叔戊基氨基，己氨基和异己基氨基，其中含有1-4个碳原子的那些基团是优选的，最优选的是甲氨基和乙氨基。
当取代基Ψ或取代基ξ是二烷基氨基时，每个烷基部分含有1-6个碳原子，并且两个烷基彼此可以是相同的或不同的。烷基可以是上述定义和列举的烷基中的任意一个。这种二烷基氨基的优选实例包括二甲基氨基，甲乙基氨基，二乙基氨基，甲丙基氨基，二丙基氨基，二异丙基氨基，乙基丁基氨基，二丁基氨基，二-叔丁基氨基，甲基戊基氨基，二戊基氨基，二异戊基氨基和二己基氨基，其中每个烷基中含有1-4个碳原子的那些基团是优选的，最优选的是二甲基氨基和二乙基氨基。
当取代基Ψ或取代基ξ是烷氧基时，所述烷氧基可以是含有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，其实例包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，异戊氧基，新戊氧基，叔戊氧基，己氧基和异己氧基，其中含有1-4个碳原子的那些基团是优选的，最优选的是甲氧基和乙氧基。
当取代基Ψ或取代基ξ是含有1-6碳原子的烷硫基时，烷基部分可以是上述定义和列举的烷基中的任意一个。这种烷硫基的优选实例包括甲硫基，乙硫基，丙硫基，异丙硫基，丁硫基，异丁硫基，仲丁硫基，叔丁硫基，戊硫基，异戊硫基，新戊硫基，叔戊硫基，己硫基和异己硫基，其中含有1-4个碳原子的那些基团是优选的，最优选的是甲硫基和乙硫基。
当取代基Ψ或取代基ξ是烷氧羰基时，所述烷氧羰基可以是含有2-7个碳原子的直链或支链烷氧羰基，其实例包括甲氧羰基，乙氧羰基，丙氧羰基，异丙氧羰基，丁氧羰基，异丁氧羰基，仲丁氧羰基，叔丁氧羰基，戊氧羰基，异戊氧羰基，新戊氧羰基，叔戊氧羰基，己氧羰基和异己氧羰基，其中含有1-4个碳原子的那些基团是优选的，最优选的是甲氧羰基和乙氧羰基。
当取代基ξ是含有1-6个碳原子的羟烷基时，烷基部分可以是上述定义和列举的烷基中的任意一个。这种羟烷基的优选实例包括羟甲基，1-和2-羟乙基，1-，2-和3-羟丙基，1，2-二羟乙基，1，2，3-三羟丙基，4-羟丁基，5-羟戊基和6-羟己基。
当取代基ξ是含有1-6个碳原子，优选1-4个碳原子的卤代烷基时，烷基部分可以是如上所定义和列举的，并且卤素原子优选为氯，氟，溴或碘。这种基团的实例包括氟甲基，氯甲基，溴甲基，碘甲基，二氯甲基，二氟甲基，三氯甲基，三氟甲基，2，2，2-三氯乙基，2-氯乙基，2-氟乙基，2-溴乙基，2-碘乙基，2，2-二溴乙基，2，2，2-三溴乙基，3-氟丙基，3-氯丙基，4-溴丁基，4-氟丁基，5-氟戊基和6-氟己基。
应该认识到，当化合物含有式-OR的基团时，其中R是上面对于R1等所定义的基团和原子中的任意一个，活性物种有可能是含有自由羟基的化合物。因此，可以用可在体内转化成羟基的任何基团来代替羟基。
本发明的化合物的具体实例包括 7β-羟基-表雄酮(7β-羟基-EPIA) 7β-羟基-脱氢表雄酮(7β-羟基-DHEA) 7β-羟基-17β-雌二醇 7β-羟基-孕烯醇酮 7β-羟基-雌酮此外，认为下面的7α-羟基化合物以相同的方式被活化 7α-羟基-雌酮我们惊奇地发现，这些化合物可用于保护由中风、脑外伤、蛛网膜下haemhorrage或心脏分流手术导致的大脑缺血等事件所引起的急性和慢性神经元损伤。
本发明的化合物可从母类固醇开始，采用各种众所周知的方法来制备。例如，它们可采用在上面提及的文献中公开的方法来制备，该方法将得到7β和相应的7α化合物的混合物，该混合物然后可通过众所周知的技术进行分离。
举例说明，7β-羟基EPIA可以采用常规方法，在对DHEA的3β-羟基和17-酮基进行保护后，通过烯丙型氧化由DHEA获得的。然后用可溶的金属化合物催化剂(例如氢化钠)对该产品进行还原，并对3β-羟基和17-酮基脱保护。然后可采用常规方法，例如柱色谱分离7α-羟基和7β-羟基差向异构体，并且7β-羟基EPIA可通过结晶进行纯化。
在下面的反应路线中示出了可选择的合成方法
在上述化学式中，TBDMSO代表叔丁基二甲基甲硅氧基，而Ac代表乙酰基。
在上述反应路线的第一步中，以常规的方式采用叔丁基二甲基甲硅氧基对式(III)的化合物雌酮进行保护，得到保护的式(IV)化合物。然后在酸催化剂(例如对甲苯磺酸)的存在下，将其与乙二醇反应，以保护17位的酮基，得到式(V)的化合物。然后如后面的实施例3所述，在6位进入羟基，得到式(VI)的化合物，该化合物然后脱氢得到式(VII)的化合物。式(VII)化合物环氧化得到式(VIII)的化合物，然后式(VIII)化合物还原得到带7α-羟基的式(IX)的化合物。脱去叔丁基二甲基甲硅烷基保护基，得到式(X)的化合物，其与催化量的酸一起加热，得到7α-羟基-雌酮(XI)。例如使用铬酸/硫酸对其进行氧化，得到7-酮基-雌酮(XII)，然后其与乙酸酐反应，得到式(XIII)的化合物。例如使用氢，在钯催化剂存在下将式(XIII)的化合物氢化，得到式(XIV)的化合物，最后脱去乙酰基，得到本发明的化合物7β-羟基-雌酮(XV)。如果需要，其可被还原，得到也是本发明化合物的7β-羟基-雌二醇(XVI)。
本发明的其它7β-羟基化合物可以按照类似的方式制备，例如，7β-羟基-DHEA可通过下列反应路线来制备 在该反应路线中，DHEA(XVII)乙酰化得到相应的式(XVIII)的乙酸酯，然后其与乙二醇反应，得到式(XIX)的缩酮。然后将缩酮(XIX)如实施例16所述进行氧化，得到相应的7-酮基化合物(XX)，然后该化合物进行脱乙酰化，得到式(XXI)的化合物。将该化合物还原得到式(XXII)的7-羟基-17-缩酮基-EPIA，然后它用酸处理来除去缩酮基而得到7-羟基-EPIA，最后通过色谱分离成7β-和7α-异构体，得到7α-羟基-EPIA(XXIV)和7β-羟基-EPIA(XXV)。
本发明中的化合物可用于治疗可能有缺血危险，特别是中风或头损伤危险的病人。这种预防性应用是很有用的。然而，也已证实本发明的化合物具有有用的活性，即使在缺血情况发生后应用也是具有有用的活性的，但推荐尽早用药，以尽可能避免神经元的变性。在有些情况下，特别是在病人仍处于缺血危险中时，可以使用重复的剂量。
为了尽早得到期望的效果，用药的合适方式一般是注射。因此，静脉注射是特别优选的，但在有些情况下，优选的用药方式是直接将化合物注射到脑脊髓液中。
本发明中化合物的剂量可根据很多因素进行改变，包括患者的年龄、体重和全身状态、及用药方式、频率和途径。但一般推荐的剂量是从0.01到50mg/kg体重，更优选的是从0.05到20mg/kg体重的剂量。可以一次的剂量或分开的剂量进行用药。
通过下面的非限制性实施例进一步描述本发明，其中实施例1到20描述的是本发明中化合物的制备，实施例21和22描述的是它们的活性。在实施例1到20中，罗马数字代表上述反应路线中的化学式。
在1巴的氢气压力下，用200mg10％的钯/活性炭催化剂对80ml含有1.0g7-羟基-6-脱氢雌酮-3，7-二乙酸酯(XIII)(2.72mmol)的冰醋酸溶液进行脱氢。2小时后过滤反应介质并蒸发至干燥。残余物用快速色谱(SiO2/乙酸乙酯∶环己烷为1/9)纯化。得到855mg7-羟基雌酮-3，7-二乙酸酯(XIV)(2.31mmol，85％)。
如前所述进行实验性缺氧操作(Pringle等，1996；1997)。简要来说，将培养物转移到含有5μg/ml荧光排斥染料碘化丙锭(PI)的无血清培养基(SFM-75％MEM，补加1mM谷氨酰胺和4.5mg/ml葡萄糖的25％ HBSS)中。成象前培养物在SFM中平衡60分钟。然后用装有一套若丹明滤光片的Leica倒置显微镜检测PI荧光。该步骤中任何可检测到PI荧光的培养物在以后的实验中舍弃。通过将培养物转移到已用95％ N2/5％ CO2饱和的SFM(+PI)中来诱导缺氧。然后将培养皿(无盖)封口成密闭室，其中的空气已在密闭前通过以1OL/min的速度连续鼓气10分钟用95％N2/5％ CO2饱和了。然后在培养箱中放170分钟(因此缺氧总时间为180分钟)。在缺氧期的最后时刻，将培养物放回到含PI的含氧量正常的SFM中，再将其放回培养箱中维持24小时。
按前述方法(Pringle等.，1996；1997)用Apple IIsi计算机运行NIHImage1.60或Macintosh G4/400计算机运行OpenLab2.1(Improvision)对神经元损伤进行评估。图像用单色相机拍摄，并保存在光盘中以备脱机分析。在加入药品之前拍摄光透射图像，而在24小时缺氧后的恢复期结束时拍摄PI荧光图像。CA1细胞层的范围可从透射图像中确定。而CA1中的PI荧光区域可用NIH Image或Openlab中的密度分割功能进行计算。神经元损伤以PI荧光高于背景的CA1的百分比来表示。
类固醇化合物是通过制造最初的溶在乙醇中的1mg/ml溶液并进一步在SFM中稀释制得的。在缺氧之前、缺氧之中及缺氧之后的恢复期将化合物加入到培养物中45分钟。对照实验由只用载体处理的培养物构成。结果实验1进行最初的实验以确定7αOH-EPIA和7βOH-EPIA在100nM的高浓度下是否具有神经保护作用。缺氧在25.5±6.4％的CA1中产生损伤。在缺氧之前、之中及之后，7αOH-EPIA和7βOH-EPIA均可显著降低这种损伤(见表1)。
表1
实验2已确定7OH-EPIA的α和β异构体均具有神经保护作用，我们推测这种作用具有浓度依赖性。对照组缺氧对31.9±4.7％的CA1造成神经元损伤。7βOH-EPIA在10nM和100nM均具有显著的神经保护作用，但在浓度降低到1nM时活性丧失，如下面的表2所示。
表2
实验3已观测到7βOH-EPIA的神经保护作用，下面我们研究7βOH-DHEA是否有神经保护作用。在缺血之前、之中及之后，将培养物与100nM7βOH-DHEA或载体一起培育。缺氧在29.0±6.2％的CA1中产生损伤。在用7βOH-DHEA处理的培养物中，可以观察到极其明显地降低神经原损伤，如下面的表3所示。
表3
实施例22大鼠全脑缺血实验(4血管闭塞法)通过4血管闭塞法(4VO)在雄性Wistar大鼠(250-280g)中诱导脑缺血。两个椎动脉在戊巴比妥麻醉(60mg/kg腹腔注射)下通过电烙术进行闭塞。然后允许动物在自由进水但无食物的情况下恢复24小时。第二天颈动脉在30％氧/70％一氧化二氮麻醉下暴露在2％氟烷中，并用微脉管钳闭塞10分钟。随后，松开二只钳子，并检查二个动脉以进行立刻的再灌注。在手术时和随后的3小时中，通过用连有肛表的恒温控制的加热毯来维持其正常体温(37.5±0.5℃)。对于对照组，假手术动物的两个椎动脉在戊巴比妥麻醉下被电烙，两个普通的颈动脉在30％氧/70％一氧化二氮麻醉下暴露于氟烷但第二天不被夹紧。伤口用利多卡因胶处理，然后进行缝合。动物在环境温度30℃的情况下保持在加热灯下直至恢复意识。
共研究了7组动物1.(n＝8)类固醇化合物，7β-OH EPIA(0.1mg/kg，通过尾静脉注射，共注射3次分别在诱导缺血前15分钟、缺血中及再灌注后5分钟)；2.(n＝8)类固醇，7β-OH EPIA(0.3mg/kg，如1所述静脉注射3次)；3.(n＝8)类固醇，7β-OH EPIA(1mg/kg，如1所述静脉注射3次)；4.(n＝8)NBQX(二钠盐，因为更溶于水)作为参照物和阳性对照(TOCRIS，德国，30mg/kg，如1所述腹膜注射3次)；5.(n＝8)标准载体(0.9％ NaCl，含100μl乙醇)，如1所述静脉注射3次)；6.(n＝8)单独缺血；7.(n＝8)假手术对照组。
NBQX是2，3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并(F)喹喔啉，并已知具有神经保护活性[Gill，R.，Nordholm，L.，Lodge D.Theneuroprotective action of 2，3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)quinoxaline(NBQX)in a rat focal ischaemia model.BrainRes.580，35-43，1992]。
7β-OH EPIA是本发明的化合物7β-羟基表雄酮。
将上述物质溶解在100μl乙醇中，最后用0.9％NaCl稀释。
缺血后经过7天的生存期，所有动物用4％低聚甲醛穿心灌注固定。然后小心地除去脑并在相同的固定液中后固定2小时。脑在30％蔗糖中超低温保护后，放到异戊烷中快速冷冻并保存在-80℃。将含有海马结构的20微米低温恒温器部件用甲苯胺蓝或Neuro Trace荧光进行Nissl染色。数据分析Nissl染色后，通过存活神经元的数量可评价缺血后海马CA1区域神经元损伤的严重程度。计算每组CA1区域中每400μm长度上形态学完整的神经元的平均数。用装有20倍物镜的光学显微镜对每只动物的3-5个连续切片进行细胞计数，并对每个切片的400μm CA1区域进行6次计数。通过成对的Student’s t-测试对数据进行统计分析。数据以平均值±SEM来表示。结果和讨论结果如附
图1至3所示。
形态学完整的海马CA1神经元在Nissl染色(甲苯胺蓝或NeuroTrace，如图2)后根据以下标准来体现清晰的神经元核周体形状，带有阳性标记的核仁的大神经核，在具有Nissl染色的核周围的小细胞质区，表明具有完整的含核糖体的粗面内质网，因此具有完整的蛋白合成系统。
全脑缺血(轻度缺血)10分钟及7天的生存期导致海马CA1区域锥体细胞的选择性神经变性(图1A-1C)。在假手术动物的CA1中，锥体细胞平均数目为121.5±4.3(设为100％)。因此，在全脑缺血10分钟后，60％CA1神经元死亡(图1B)。缺血并如实验所述用载体(NaCl+100μl乙醇)进行静脉注射的动物组神经元数目与单独缺血动物组进行比较(图1A，1B)。NBQX(30mg/kg，如实验所述静脉注射三次)与缺血组比较，CA1锥体细胞中表现出显著的(p＝0.03)神经保护作用。与单独缺血组比较，NBQX表现出47.5％的神经保护作用，而与假手术组动物相比较，保护作用为68.5％。NBQX引起的神经保护作用与Gill等，1992和Gill 1994的结果是一致的，表明我们实验中所用的全脑缺血模式是有效的。7β-OH EPIA在全脑缺血10分钟和7天生存期后，对海马CA1锥体细胞具有浓度依赖性的神经保护作用(图1A)。T-测试分析表明，7β-OH EPIA在浓度为0.1mg/kg(p＝0.01)和0.3mg/kg(p＝0.0008)时具有非常显著的神经保护作用。与假手术组相比较，7β-OH EPIA对CA1锥体细胞分别表现出74.8％(0.1mg/kg)和83.9％(0.3mg/kg)的神经保护作用(图1C)。但7β-OH EPIA在浓度为1.0mg/kg时仅表现出神经保护的趋势，但作用不显著。
在缺血之前、之中和之后用7β-OH EPIA进行静脉注射的所有实验中，我们从未观察到动物的任何行为异常。
图1A数据以CA1区域每400μm长度的完整神经元的平均数目±SEM表示。
图1B数据以CA1区域每400μm长度的完整神经元与假手术动物的百分比表示，假手术组动物的完整神经元设为100％。
图1C当缺血组存活神经元数目设为0，而假手术组设为100％时，数据以神经保护作用的绝对百分比表示。
权利要求
1.3-羟基-7β-羟基类固醇或3-氧代-7β-羟基类固醇及其药用酯用于生产保护神经元免受损伤的药剂的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中的类固醇是化学式(I)的化合物 其中R1和R2彼此是相同的或不同的，并且每个代表氢原子，含有1-6个碳原子的烷基，含有2-6个碳原子的烯基，含有2-6个碳原子的炔基，含有6-10个碳原子的芳基，甲酰基，含有2-7个碳原子的烷羰基，含有3-7个碳原子的烯羰基，含有3-7个碳原子的炔羰基，含有7-11个碳原子的芳羰基，含有8-15个碳原子的芳烷基羰基，含有9-15个碳原子的芳烯基羰基，或如下定义的杂环-羰基；Ra和Rb中的一个代表式-Rc的基团，优选是β构型，而另一个代表氢原子，或者Ra和Rb一起代表一个氧基；Rc代表含有1-6个碳原子的烷酰基，芳基-羰基，其中芳基部分是含有6-10个环碳原子的芳香碳环基团，如下所定义的杂环-羰基，或者式-OR4的基团，其中R4代表上述对R1和R2所定义的任何一种基团或原子；环A， 是苯环或环己烷环；当环A是环己烷环时，在环B中的虚线代表碳-碳单键或双键，而n为1；或者当环A是苯环时，环B中的虚线代表碳-碳单键，而n为0；所述的杂环-羰基是式R3-CO的基团，其中R3代表含有3-7个环原子的杂环基团，其中1-3个原子是选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子，剩余的一个或多个原子中至少有一个原子是碳原子。所述的烷基、烯基和炔基和所述的烷羰基、烯羰基和炔羰基的烷基、烯基和炔基部分是非取代的或具有至少一个下述的取代基Ψ取代基Ψ羟基，巯基，卤素原子，氨基，含有1-6个碳原子的烷基氨基，其中每个烷基含有1-6个碳原子的二烷基氨基，氨基甲酰基，硝基，含有1-6个碳原子的烷氧基，含有1-6个碳原子的烷硫基，羧基，烷氧羰基和含有6-10个碳原子的非取代芳基；所述的芳基、所述的杂环基团、和所述芳羰基和所述芳烷基羰基的芳基部分是非取代的或具有至少一个下列的取代基ξ取代基ξ取代基Ψ中的任意一个，和含有1-6个碳原子的烷基，含有1-6个碳原子的羟烷基，和含有1-6个碳原子的卤代烷基；以及药用盐及其酯。
3.根据权利要求的用途，其中R1和R2彼此是相同的或不同的，并且每个代表氢原子，含有1-6个碳原子的烷基，任选取代的苯基，甲酰基，含有2-5个碳原子的烷羰基，含有7-11个碳原子的芳羰基，含有8-15个碳原子的芳烷基羰基，或如下定义的杂环-羰基；Ra和Rb中的一个代表含有1-6个碳原子的烷酰基或式-OR4的基团，其中R4代表上述对R1和R2所定义的任何一种基团或原子，为β构型，而另一个代表氢原子，或者Ra和Rb一起代表一个氧基；所述的杂环-羰基是式R3-CO的基团，其中R3代表含有3-7个环原子的杂环基团，其中1-3个原子是选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子，剩余的一个或多个原子中至少有一个原子是碳原子。
4.根据权利要求1的用途，其中的类固醇是化学式(II)的化合物 其中Ra和Rb中的一个代表式-Rc的基团，优选是β构型，而另一个代表氢原子，或者Ra和Rb一起代表一个氧基；Rc代表含有1-6个碳原子的烷酰基，芳基-羰基，其中芳基部分是含有6-10个环碳原子的芳香碳环基团，如下所定义的杂环-羰基，或者式-OR4的基团，其中R4代表上述对R1和R2所定义的任何一种基团或原子。
5.根据权利要求1的用途，其中的类固醇是7β-羟基-表雄酮。
6.根据权利要求1的用途，其中的类固醇是7β-羟基-脱氢-表雄酮。
7.根据权利要求1的用途，其中的类固醇是7β-羟基-17β-雌二醇。
8.根据权利要求1的用途，其中的类固醇是7β-羟基-孕烯醇酮。
9.根据权利要求1的用途，其中的类固醇是7β-羟基-雌酮。
10.根据权利要求1的用途，其中的类固醇是7α-羟基-雌酮。
11.根据前述权利要求中任何一个的用途，其中的神经元损伤是由慢性紊乱引起的。
12.根据权利要求11的用途，其中的慢性紊乱是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或非痴呆性认知损伤。
13.根据前述权利要求中任何一个的用途，其中的神经元损伤是由急性紊乱引起的。
14.根据权利要求13的用途，其中的急性紊乱是由中风、脑外伤、脊髓损伤或周围神经损伤引起的。
15.一种保护哺乳动物免受神经元损伤的方法，该方法通过给哺乳动物服用有效量的3-羟基-7β-羟基类固醇或3-氧代-7β-羟基类固醇或其药用酯来进行。
全文摘要
3－羟基－7β－羟基类固醇和3－氧代－7β－羟基类固醇或其药用酯可用于保护神经元免受损伤。
文档编号A61K31/5685GK1443071SQ0181319
公开日2003年9月17日 申请日期2001年6月29日 优先权日2000年6月29日
发明者恩斯特·武尔费特, 阿什利·克尔·普林格尔, 拉尔斯·埃里克·森德斯特罗姆 申请人:亨特-弗莱明有限公司