修饰的核苷或核苷酸的制作方法
【专利说明】修饰的核苷或核苷酸
[0001] 背景 发明领域
[0002] 本文描述的一些实施方案涉及包含3' -羟基保护基的修饰的核苷酸或核苷以及 它们在多核苷酸测序方法中的应用。本文所述的某些实施方案涉及制备3'-羟基被保护的 核苷酸或核苷的方法。
[0003] 相关抟术描沐
[0004] 通过改进用于表征分子或其生物反应的技术，在某种程度上使得对分子的研究有 所进展。特别是核酸DNA和RNA的研究已受益于开发用于序列分析和杂交事件研究的技术。
[0005] 改进核酸研究的技术中的一个实例是开发固定化核酸的制备阵列。这些阵列代表 性地由固定至固相载体材料上的高密度多核苷酸矩阵构成。见，例如，Fodor等人，Trends Biotech. 12:19-26, 1994,该文献描述了使用化学敏感的玻璃表面来组装核酸的方法，该玻 璃表面由遮盖物（mask)保护但在限定的区域被暴露以允许附接适当修饰的核苷亚磷酰 胺。还可以通过将已知的多核苷酸在预定位置处"点样"至固相载体上的技术来制造制备 阵列（例如，Stimpson 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 92:6379-6383, 1995) 〇
[0006] -种测定与阵列结合的核酸的核苷酸序列的方法被称作"合成法测序"或"SBS"。 理想化地，这种测定DNA序列的技术需要受控地（即，一次一个）并入相对于正被测序的核 酸的正确的互补核苷酸。因为每个核苷酸残基被逐个测序，因此，这允许通过在多次循环中 加入核苷酸来精确测序，从而防止发生一系列不受控制的并入。使用附着于被并入的核苷 酸的合适的标记来读取该被并入的核苷酸，然后除去该标记部分并随后进行下一轮测序。
[0007] 为保证仅发生单个并入，向加入至生长链上的每个标记的核苷酸中加入结构修饰 ("保护基"）以确保只有一个核苷酸被并入。在已加入具有保护基的核苷酸之后，然后在 不干扰正被测序的DNA的完整性的反应条件下，将所述保护基除去。然后，随着并入下一个 经保护的标记的核苷酸，所述测序循环能够继续进行。
[0008] 为适用于DNA测序，核苷酸以及更通常为三磷酸核苷通常需要3'-羟基保护基，以 防止用于将其并入至多核苷酸链内的聚合酶在加入所述核苷酸上的碱基时继续复制。对能 够加至核苷酸上且依然合适的基团的类型有很多限制。所述保护基应防止另外的核苷酸分 子被加入至多核苷酸链中，且同时在不破坏该多核苷酸链的情况下易于从糖部分中除去。 此外，修饰的核苷酸需要耐受聚合酶或用于将该修饰的核苷酸并入多核苷酸链内的其他适 合的酶。因此，理想的保护基表现出长期的稳定性，可高效地被聚合酶并入，阻止核苷酸二 次并入或进一步并入，并且具有在不破坏多核苷酸结构的温和条件下被除去的能力，优选 地在水性条件下被除去。
[0009] 先前已描述了可逆的保护基。例如，Metzker等人，（Nucleic Acids Research, 22(20) :4259-4267, 1994)公开了八种3' -修饰的2-脱氧核糖核苷5' -三磷酸 酯（3'_修饰的dNTP)的合成和应用，并在两组DNA模板测定中对并入活性进行了测试。TO 2002/029003描述了一种测序方法，其可能包括在聚合酶反应中使用烯丙基保护基对DNA 生长链上的3' -OH基团加帽。
[0010] 另外、我们先前在国际申请公开NO.W02004/018497中报导了开发了许多可逆保 护基和在DNA相容的条件下将它们脱保护的方法，由此通过参考的方式将其全部内容并入 本文。
[0011] 概述
[0012] 本文描述的某些实施方案涉及修饰的核苷酸或核苷分子，其包含嘌呤或嘧啶碱基 和核糖或脱氧核糖的糖部分，所述糖部分具有可除去的3' -羟基保护基，形成与3' -碳原 子共价连接的结构-O-C (R) 2N3，其中
[0013] R 选自氢、-C(R1)ni(R2)n'-C( = 0)0R3、C( = 0)NR4R5、-C(R6)2O(CH 2)pNR7R8 和-C (R9) 20-Ph-C ( = 0) NR1V1;
[0014] R1和R2各自独立地选自氢、任选取代的烷基或卤素；
[0015] R3选自氢或任选取代的烷基；
[0016] R4和R5各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳 基、或任选取代的芳烷基；
[0017] R6和R 9各自选自氢、任选取代的烷基或卤素；
[0018] R7 和Rn各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的 杂芳基、或任选取代的芳烷基；
[0019] m为0-3的整数；以及
[0020] η为0-3的整数；条件是m+n的总和等于3 ;以及
[0021] p为0-6的整数；条件是R1和R2不能均为卤素；以及至少一个R不为氢。
[0022] 本文描述的某些实施方案涉及制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生 长多核苷酸的方法，包括将本文所述的修饰的核苷酸分子并入所述生长的互补多核苷酸， 其中所述修饰的核苷酸的并入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸中。
[0023] 本文描述的某些实施方案涉及测定目标单链多核苷酸的序列的方法，包括监测互 补核苷酸的顺序并入，其中至少一个并入的互补核苷酸是本文描述的修饰的核苷酸分子； 以及检测所述修饰的核苷酸分子的特性。在某些实施方案中，通过末端转移酶、末端聚合酶 或逆转录酶来完成修饰的核苷酸分子的并入。
[0024] 本文描述的某些实施方案涉及试剂盒，其包含多个本文描述的修饰的核苷酸或核 苷分子和包装材料。在某些实施方案中，通过检测与碱基连接的可检测标记来测定所述修 饰的核苷酸的特性。在某些这类实施方案中，在引入下一个互补核苷酸之前，将3'_羟基保 护基和可检测标记除去。在某些这类实施方案中，3' -羟基保护基和可检测标记在单步的 化学反应中除去。
[0025] 附图的简要说明
[0026] 图IA示例性说明了多种3' -OH保护基。
[0027] 图IB示例性说明了多种3' -OH保护基的热稳定性。
[0028] 图2A示例性说明了三种不同3' -OH保护基的脱保护速率曲线。
[0029] 图2B显示了三种不同3' -OH保护基的脱保护完成一半的时间（deprotection half time)的图表。
[0030] 图3显示了多种具有热稳定的3'-OH保护基的修饰的核苷酸的定相（phasing)值 和预定相（prephasing)值，并与标准的保护基比较。
[0031] 图4A显示了并入混合物（頂X)中Mono-F ffNs-A-异构体的2X400bp测序数据。
[0032] 图4B显示了并入混合物（MX)中Mono-F ffNs-B-异构体的2 X 400bp测序数据。
[0033] 发明详述
[0034] 一个实施方案为包含3' -OH保护基的修饰的核苷酸或核苷。在一个实施方案中， 所述3 ' -OH保护基为单氟甲基取代的叠氮基甲基保护基。在另一个实施方案中，所述3 ' -OH 保护基为C-酰氨基取代的叠氮基甲基保护基。另一个实施方案涉及具有二氟甲基取代的 叠氮基甲基3' -OH保护基的修饰的核苷酸。
[0035] 定义
[0036] 除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员 所通常理解含义相同的含义。使用术语"包括"以及该术语的其他形式并非限制。使用术 语"具有"以及该术语的其他形式并非限制。如本说明书中所使用的，不论在过渡短语中还 是在权利要求书中，术语"包含"应解释为具有开放性的含义。即，以上术语应与短语"至少 含有"或"至少包括"同义地进行解释。例如，当在方法的上下文中使用时，术语"包含"意 味着该方法至少包括已叙述的步骤，但可以包括另外的步骤。当在化合物、组合物、或装置 的上下文中使用时，术语"包含"意味着该化合物、组合物或装置至少包括已叙述的特征或 组分，但可以包括另外的特征或组分。
[0037] 如本文中使用的，常见的有机缩略语的定义如下：
[0038] Ac 乙酰基
[0039] Ac2O 乙酸酐
[0040] aq. 水性/水相
[0041 ] Bn 苄基
[0042] Bz 苯甲酰基
[0043] BOC或Boc 叔丁氧羰基
[0044] Bu 正丁基
[0045] cat. 催化的
[0046] Cbz 节氧羰基
[0047] 〇C 摄氏温度
[0048] dATP 脱氧三磷酸腺苷
[0049] dCTP 脱氧三磷酸胞苷
[0050] dGTP 脱氧三磷酸鸟苷
[0051] dTTP 脱氧三磷酸胸苷
[0052] ddNTP 双脱氧核苷酸
[0053] DBU 1，8-二氮杂双环[5. 4. 0] ^^一碳 _7_ 烯
[0054] DCA 二氯乙酸
[0055] DCE 1,2-二氯乙烷
[0056] DCM 二氯甲烷
[0057] DIEA 二异丙基乙胺
[0058] DMA 二甲基乙酰胺
[0059] DME 乙二醇二甲醚
[0060] DMF N, N ' -二甲基甲酰胺
[0061] DMSO 二甲亚砜
[0062] DPPA 叠氮磷酸二苯酯
[0063] Et 乙基
[0064] EtOAc 乙酸乙酯
[0065] ffN 全功能核苷酸（fully functional nucleotide)
[0066] g 克
[0067] GPC 凝胶渗透色谱法
[0068] h或hr 小时
[0069] iPr 异丙基
[0070] KPi pH 7. 0的10 mM磷酸钾缓冲液
[0071] KPS 过硫酸钾
[0072] IPA 异丙醇
[0073] IMX 并入混合物（Incorporation mix)
[0074] LCMS 液相色谱法-质谱
[0075] LDA 二异丙基氨基锂
[0076] m 或 min 分钟
[0077] mCPBA 间氯过氧苯甲酸
[0078] MeOH 甲醇
[0079] MeCN 乙腈
[0080] Mono-F -CH2F
[0081] Mono-FffN 修饰的核苷酸，其在叠氮基甲基3' -OH保护基的
[0082] 亚甲基位具有-CH2F取代的
[0083] mL 毫升
[0084] MTBE 甲基叔丁基醚
[0085] NaN3 叠氮化钠
[0086] NHS N-羟基琥珀酰亚胺
[0087] PG 保护基
[0088] Ph 苯基
[0089] ppt 沉淀
[0090] rt 室温
[0091] SBS 合成法测序
[0092] TEA 三乙胺
[0093] TEMPO (2, 2, 6, 6-四甲基哌啶-1-基）氧化物
[0094] TCDI 1，Γ-硫羰基二咪唑
[0095] Tert, t 叔
[0096] TFA 三氟乙酸
[0097] THF 四氢呋喃
[0098] TEMED 四甲基乙二胺
[0099] μ L 微升
[0100] 如本文中使用的，术语"阵列"指与一个或多个基质相连的不同的探针分子的群 体，以至于该不同的探针分子能够根据相对位置而彼此区别开。阵列可以包括不同的探针 分子，它们各自位于基质上不同的可寻址位置。可选地或另外地，阵列可以包括各自带有不 同的探针分子的相互分离的基质，其中不同的探针分子可以根据基质所附着的表面上的基 质的位置来识别，或根据基质在液体中的位置来识别。其中相互分离的基质位于表面上的 示例性阵列包括但不限于：例如美国专利No. 6, 355, 431 BK US 2002/0102578和PCT公开 第TO 00/63437号中所描述的那些阵列，包括在孔内的珠。可用于本发明以区分在液体阵 列中的珠，例如使用微流体装置，例如荧光激活细胞分选仪（FACS)的示例性模式描述于例 如美国专利No. 6, 524, 793中。可以在本发明中使用的阵列的实例还包括但不限于：美国 专利 No. 5, 429, 807、5, 436, 327、5, 561，071、5, 583, 211、5, 658, 734、5, 837, 858、5, 874, 219、 5, 919, 523、6,