10. 255mmol)，历时 5 分 钟。将反应混合物缓慢加热至室温。用TLC(EtOAc)监测反应进程。反应在1小时后终止， 届时通过TLC不再可见起始材料。将反应溶液溶解于DCM (30mL)中，并加入到NaHCO3 (30mL) 中。将两层分离，水层用另外的DCM萃取（30mLX 2)。合并有机萃取物，干燥（MgSO4),过滤， 并蒸发，得到黄色油。通过Biotag硅胶柱（4g)，使用从DCM = EtOAc 8:2(v/v)到EtOAc再到 MeOH:EtOAc(2:8)的梯度纯化粗产物3g，为浅黄色泡沫（异构体A，54%产率，44mg)。
[0224] 异构体 A :? NMR(400MHz，d6-DMS0) : δ 2. 24-2. 35 (m，2H，H-2'），3. 56-3. 66 (m，2H ，H-5 '），3· 96-4. 00 (m，1H，H-4 '），4· 23 (s，2H，CH2NH)，4· 33-4. 37 (m，1H，H-3 '），4· 85 (s，2H，OCH 2N3)，5. 23 (t，J = 5. 1Hz，1H，5 ' -OH)，6. 07 (t，J = 6. 7Hz，1H，Η-Γ )，8. 19 (s，1H，H-6)，10. 09 (br s，lH，NH)，11.70(br s，lH，NH)。19F NMR:-74.4(CF3)，-131.6(CH2F)。
[0225] 对3f(异构体B，133mg)实施相同的反应，并得到了相应的产物3g(异构体B， 48mg，54 % 产率）。1H NMR(400MHz，d6-DMS0) : δ 2. 27-2. 44 (m，2H，H-2'），3. 58-3. 67 (m，2H ，H-5'），4· 00-4. 02 (m，1H，H-4'），4· 24 (d，J = 4. 1Hz，2H，CH2NH)，4· 57-4. 58 (m，1H，H-3'）， 5. 24-5. 29 (m，2H，5 ' -OH, OCHN3)，6. 07-6. 34 (m，2H，Η-Γ，CHF2)，8. 19 (s，1H，H-6)，10. 09 (br s，lH，NH)，11.70(br s，1H，NH)。19FNMR:-74.2(CF3)，-131.4(CH2F)。
[0226] 相应的三磷酸酯3h的制备以及进一步将染料附接至核碱基上以得到完全功能化 的三磷酸核苷（ffN)3i已报导于WO 2004/018497,并通常为本领域技术人员所熟知。
[0227] 实施例4
[0228] 3' -OH保护基的热稳宙件测试
[0229] 针对多种3' -OH保护基的热稳定性进行了研究（图1A)。通过在60°C下，加热 0· ImM 的在 pH = 9 缓冲液（tis-HCl 50mM，NaCl 50mM，吐温 0· 05%，Mg2S046mM)中的每种 3 ' -OH被保护的核苷酸来评价热稳定性。选取了多个时间点，并使用HPLC来分析未被封闭 的材料的形成。发现-CH2F和-C(O)NHBu的稳定性比标准物叠氮基甲基（-CH 2N3)保护基高 约2倍。发现-CF2H基团的稳定性比该标准物高约10倍（图1B)。
[0230] 实施例5
[0231] 3' -OH保护基的脱保护
[0232] 又研究了多种3'_0H保护基的脱保护反应速率。将标准物叠氮基甲基保护基的脱 保护速率与-CH 2F取代的叠氮基甲基和-C(O)NHBu取代的叠氮基甲基进行比较。观察到使 用膦（ImM THP)作为脱保护试剂时，相比于所述标准物叠氮基甲基保护基，两种更加热稳定 的3'-OH封闭基被更快地除去。见图2A。例如，-〇^和-C(O)NHBu的半存留期（half-life) 分别为8. 9分钟和2. 9分钟，相比之下叠氮基甲基的半存留期为20. 4分钟（图2B)。
[0233] 实施例6
[0234] 测序实验
[0235] 制备具有-CH2F(mono-F)取代的叠氮基甲基3' -OH保护基的修饰的核苷酸，并在 Miseq平台上评价了其测序性能。预期3' -OH保护基的增加的稳定性会使得用于测序化 学的核苷酸质量更高，并具有更少的污染的3' -未被封闭的核苷酸。在SBS测序试剂盒中 3' -未被封闭的核苷酸的存在会因此导致预定相事件，将该预定相事件读为预定相值。
[0236] 首先使用短的12次循环测序实验来产生定相值和预定相值。根据以下浓度使用 mono-F取代的叠氮基甲基保护的ffNs :ffA-染料I (2uM)、ffT-染料2 (IOuM)、ffC-染料 3(2uM)和ffG-染料4(5uM)。mono-F取代的叠氮基甲基基团包括异构体A和B。两种染 料--染料2在标准Miseq试剂盒中，而染料5用于标记ffT。表1显示了多种具有mono-F 取代的叠氮基甲基的异构体A和B的核苷酸组合，并针对定相影响和预定相影响进行了评 价。在所有情况下，预定相值都大幅低于对照--使用标准V2Miseq试剂盒核苷酸作为对 照（图3)。
[0239] 测序质量测试
[0240] 在Miseq上实施了 2X400bp测序，以评价这些核苷酸对于改善测序质量的潜力。 根据制造商的说明书（Illumina Inc.，圣迭戈，CA)实施测序运行。标准并入缓冲液被 替换为含有全部mono-F封闭的FFN的并入缓冲液，各自具有单独的染料标记：fTA-染料 I (2uM)、ffT-染料 2 (IuM)、ffC-染料 3 (2uM)和 ffG-染料 4 (5uM)。使用的 DNA 库由 B 仙人 掌属基因组DNA根据标准TruSeq HT方案来制得。
[0241] 在两组测序实验中（使用mono-F封闭的异构体A和B)，观察到非常低的预定相 值。与低的定相值相联系，在这两组情况中，应用这些新的核苷酸产生了优异的2X400bp 测序数据，且>80%的碱基在Q30以上（见图4A异构体A的Q分值，以及图4B异构体B的 Q分值图）。这些结果证实了相比Miseq v2试剂盒（2X250bp，在典型的R&D测序实验中 80%的碱基〉Q30,或者按照规定的说明书，70%的碱基〉Q30)具有显著改进。如下文所示， 表2综合了当在頂X中使用全部mono-F ffNs-A-异构体时的测序数据。表3综合了在頂X 中使用全部mono-F ffNs-B-异构体的测序数据。
[0242] 表 2
[0243]
【主权项】
1. 修饰的核苷酸或核苷分子，其包含嘌呤或嘧啶碱基和核糖或脱氧核糖糖部分，所述 糖部分具有可除去的3' -羟基保护基，所述可除去的3' -羟基保护基形成与所述3' -碳原 子共价连接的结构-0-C(R) 2N3，其中 R选自氢、-C^ROJR2)。-C( = 0)0R3、C( = 0)NR4R5、-C(R6)20(CH2)pNR7Rs 和-C(R9) 20-Ph-C( = 0)NR10Rn; R1和R2各自独立地选自氢、任选取代的烷基或卤素； R3选自氢或任选取代的烷基； R4和R5各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或任 选取代的芳烷基； R6和R9各自选自氢、任选取代的烷基或卤素； R'R8、!^和R11各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳 基或任选取代的芳烷基； m为0-3的整数； η为0-3的整数；条件是m+n的总和等于3 ;以及 P为0-6的整数；条件是R1和R2不能均为卤素；以及至少一个R不为氢。2. 如权利要求1所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中一个R为氢且另一个R 为-COOJR2)#3. 如权利要求1或2所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中-C(R乂叱^选 自-CHF2、-CH2F、-〇1(：12或-CH2C1 〇4. 如权利要求1-3中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中-C?1) n(R2)n^ -CHF2〇5. 如权利要求1-3中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中-C?1)6. 如权利要求1所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中一个R为氢且另一个R为_C( = 0)0R3〇7. 如权利要求6所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中R3为氢。8. 如权利要求1所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中一个R为氢且另一个R为_C( = 0)NR4R5〇9. 如权利要求1或8所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中R4和R5均为氢。10. 如权利要求1或8所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中R4为氢且R5为Ci6烷基。11. 如权利要求1或8所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中R4和R5均为Ci6烷基。12. 如权利要求1所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中一个R为氢且另一个R 为 _C(R6)20(CH2)pNR7Rs〇13. 如权利要求1或12所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中R6均为氢。14. 如权利要求1、12和13中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中R7 和R8均为氢。15. 如权利要求1和12-14中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中p 为0〇16. 如权利要求1和12-14中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中p 为6〇17. 如权利要求1所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中一个R为氢且另一个R 为-C(R9)20-Ph-C( =Ο)·1%11。18. 如权利要求1或17所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中R9均为氢。19. 如权利要求1、17和18中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中 R1(]和R11均为氢。20. 如权利要求1、17和18中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中 R1()为氢且R11为氨基取代的烷基。21. 如权利要求1-14中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中在使用 膦的脱保护反应中除去所述3' -羟基保护基。22. 如权利要求21所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中所述膦为三（羟甲基）膦 (THP)〇23. 如权利要求1-22中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中所述碱 基经由可裂解的连接基团或不可裂解的连接基团与可检测标记连接。24. 如权利要求1-22中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中所述 3' -羟基保护基经由可裂解的连接基团或不可裂解的连接基团与可检测标记连接。25. 如权利要求23或24所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中所述连接基团是可裂解 的。26. 如权利要求23-25中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中所述 可检测标记为荧光团。27. 如权利要求23-26中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分子，其中所述 连接基团为对酸不稳定的、对光不稳定的或含有二硫键。28. 制备在测序反应中与目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸的方法，其包括将 权利要求1-27中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸分子并入所述生长的互补多核苷 酸，其中所述修饰的核苷酸的并入防止了任何后续的核苷酸引入所述生长的互补多核苷酸 中。29. 如权利要求28所述的方法，其中所述修饰的核苷酸分子的并入通过末端转移酶、 末端聚合酶或逆转录酶来实现。30. 测定目标单链多核苷酸的序列的方法，其包括 监测互补核苷酸的顺序并入，其中并入的至少一个互补核苷酸是权利要求23-27中任 一项权利要求所述的修饰的核苷酸分子；以及 检测所述修饰的核苷酸分子的特性。31. 如权利要求30所述的方法，其中通过检测与所述碱基连接的所述可检测标记来测 定所述修饰的核苷酸的特性。32. 如权利要求30或31所述的方法，其中在引入所述下一个互补核苷酸之前，将所述 3' -羟基保护基和所述可检测标记除去。33. 如权利要求32所述的方法，其中所述3'-羟基保护基和所述可检测标记在单步的 化学反应中除去。34. 试剂盒，包含多个权利要求1-27中任一项权利要求所述的修饰的核苷酸或核苷分 子以及用于其的包装材料。35.如权利要求34所述的试剂盒，还包含酶和适合于所述酶的作用的缓冲液。
【专利摘要】本文描述的某些实施方案涉及具有新的3’-羟基保护基的修饰的核苷酸和核苷分子。所述3’-羟基保护基形成与3’-碳原子共价连接的结构-O-C(R)2N3，其中R如权利要求书中所定义。本文也提供了制备这类修饰的核苷酸和核苷分子的方法，以及使用这类修饰的核苷酸和核苷分子通过合成方法进行测序的方法。
【IPC分类】C07H19/10, C07H19/14, C07H19/173, C07H19/073, C07H19/20
【公开号】CN105377869
【申请号】CN201380076386
【发明人】刘小海, 吴晓琳, 杰弗里·保罗·史密斯
【申请人】伊鲁米纳剑桥有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2013年3月15日
【公告号】CA2903095A1, EP2970356A1, US20160002721, WO2014139596A1