tOAc (50mL)中，并加 入NaHCO3 (60mL)。将两层分离，并用另外的DCM萃取水层（50mL X 2)。合并有机萃取物，干 燥（MgSO4)，过滤，并蒸发，得到黄色油。通过Biotag硅胶柱，使用从石油醚：EtOAc 8:2(v/ v)到EtOAc的梯度来纯化粗产物ld(异构体A)，为白色固体（183mg，产率：56% )。
[0196] 异构体 A ,H NMR(400MHz，d6-DMS0) : δ 2. 24-2. 35 (m，2H，H-2'），3. 56-3. 66 (m，2H， H-5'），3· 96-4. 00 (m，1H，H-4'），4· 23 (s，2H，CH2NH)，4· 33-4. 37 (m，1H，H-3'），4· 43-4. 51 (m，CH 2F)，5. 12 (br. s，1H，CHN3)，5. 23 (br. s，1H，5' -OH)，6. 07 (t，J = 6. 7Hz，1H，Η-Γ )，8. 26 (s，I H，H-6)，10. 11 (br s，1H，NH)，11. 72 (br s，1H，NH)。19F NMR:-74. 3 (CF3)，-230. 5 (CH2F)。
[0197] 对于lc(异构体B)，以360mg的规模实施了相同的反应，得到了相应的产物 ld(异构体8，15011^，63%)。1!1匪1?(4001抱，(16-0150):2.24-2.37(111，2!1，!1-2'），3.57-3.70(m，2H，H-5'），3.97-4.01(m，lH，H-4'），4.23(br.s，2H，CH 2NH)，4.33-4.37(m，lH，H-3'），4· 44-4. 53(m，CH2F)，5· 11-5. 21 (br. s，1H，CHN3), 5. 23(br. s，1H，5' -OH), 6. 07(t，J =6.6Hz，lH，H-l'），8.23(s，lH，H-6)，10.09(br s，lH，NH)，11.70(br s，lH，NH)。19F NMR:-74. I(CF3), -230.1 (CH2F)〇
[0198] 相应的三磷酸酯Ie的制备以及进一步将染料附接至核碱基上以得到完全功能化 的三磷酸核苷（ffN) If已报导于WO 2004/018497,并通常为本领域技术人员所熟知。
[0199] 实施例2
[0200] 具有3' -OH保护基的核苷酸的合成
[0202] 方案2示例性说明了用于制备具有C-酰氨基取代的叠氮基甲基作为3' -OH保护 基的修饰的核苷酸的合成路线。化合物2a_2i使用修饰的胸腺嘧啶（T-PA)作为碱基。可 以使用的碱基的其他非限制性实例包括Cbz-PA、ADMF-PA和GPac-PA，其结构显示于上文的 方案1中。在实验程序中，报道了具有N，N-二甲基-C( = 0)_取代的叠氮基甲基保护基（R =匪e2)的化合物2f和后续的反应。也制备了具有其他C-酰氨基的化合物，例如N-乙 基-C ( = 0) - (R = NHEt)。
[0203] 实验稈序
[0204] 于4°C下，向起始核苷2a(4. 27g，6. 9mmol)的无水CH3CN(50ml)溶液中加入2, 6-二 甲基吡啶（2. 4mL，20. 7mmol)、S (CH2CH2OAc) 2 (12. 2g，69mmol)，然后加入 Bz202 (纯度 50 %， 33. 4g，69mmol)。反应混合物缓慢升温至室温。将所述混合物再搅拌12小时。TLC监测 (EtOAc:DCM = 4:6v/v)直至可见该起始核苷被完全消耗。然后将反应减压浓缩至油状残留 物。将石油醚（800ml)加入该混合物中，并用力搅拌10分钟。将石油醚层倾倒出，剩余物 用石油醚重复处理2次。然后将油状残留物在DCM/NaHC0 3(l:l)(1000mL)之间分配。分离 有机层，水层用DCM进一步萃取（2X 500mL)。合并的有机层用MgSO4干燥，过滤并减压蒸除 易挥发成分。通过Biotag硅胶柱（100g)，使用从石油醚到石油醚：EtOAc 2:8(v/v)的梯度 来纯化粗产物2b，得到浅黄色泡沫（4. 17g，产率：74%，非对映异构体）。
[0205] 在N2下，向带有分子筛（4 A)的起始核苷2b(4. 54g，5. 56mmol)的无水 (3H2Cl2(56mL)溶液中加入环己稀（5. 62mL，56mmol)。用冰浴将混合物冷却至4°C。在队下 缓慢添加磺酰氯（I. 13mL，13. 9mmol)的DCM (25ml)溶液，历时90分钟。30分钟后在该温度 下，TLC(EtOAc:DCM = 4:6v/v)表明有10%的起始核苷2b剩余。向反应混合物中另外加入 磺酰氯（〇. ImL)。TLC表明2b完全转化。减压（以及25°C的室温）蒸除易挥发成分，并迅速 地将油状残留物置于高真空中10分钟直到其呈泡沫状。粗产物用N 2吹扫，然后溶解于无水 DMF(5mL)中，并立即加入NaN3(l. 8g，27. 8mmol)。所得悬浮液在室温下搅拌2小时，或直到 TLC表明反应完全并形成两种异构体（A和B)形式的2c。反应混合物在Et0Ac:NaHC03(l :l) (1000 mL)之间分配。将有机层分离，水层用EtOAc进一步萃取（2 X 300mL)。合并的有机萃 取物然后用MgSO4干燥，过滤并减压蒸除易挥发成分。通过Biotag硅胶柱（100g)，使用从 石油醚到石油醚：EtOAc I: I (v/v)的梯度分离两种非对映异构体2c (异构体A和B)，为浅 黄色泡沫。异构体A :1. 68g，产率：40. 7%，异构体B :1. 79g，产率：43. 2%。
[0206] 向起始核苷 2c (异构体 A) (I. 63g，2. 2mmol)的 MeOH/THF (I: I) (20mL)溶液中缓慢 加入 NaOH(lM 水溶液）（2.2mL，2.2mmol)，并在 4°C下搅拌。用 TLC(EtOAc:DCM = 4:6v/v) 监测反应进程。反应在1小时后终止，届时通过TLC不再可见起始材料。将反应混合物在 DCM:NaHC03(l:l)(150mL)之间分配。分离有机层，水层用DCM进一步萃取（2X70mL)。合 并的有机萃取物用MgSO 4干燥，过滤并减压蒸除易挥发物质。通过Biotag硅胶柱（IOg)，使 用从石油醚：EtOAc (8:2) (v/v)到EtOAc的梯度纯化粗产物2d，为浅黄色泡沫（I. lg，产率： 71% ) 〇
[0207] 对于2c(异构体B，1.57g)重复相同的反应，并得到了相应的产物2d(异构体B， I. 01g，69%产率）。
[0208] 室温下，向起始核苷2d (异构体A) (700mg，Immol)的CH3CN (IOmL)溶液中添 加 TEMP(K63mg，0. 4mmol)和 BAIB^44mg，2mmol)。用 TLC (EtOAc:DCM = 7: 3v/v)监测 反应进程。反应在2小时后终止，届时通过TLC不再可见起始材料。将反应混合物在 DCM:Na2S203(l:l)(100mL)之间分配。分离有机层，水层用DCM进一步萃取（2X70mL)。然 后用NaCl (饱和溶液）洗涤合并的有机萃取物。有机层在未经MgSO4干燥的情况下减压蒸 发，以防止产物沉淀析出。通过Biotag硅胶柱（IOg)，使用从石油醚：EtOAc (1:1) (v/v)到 EtOAc再到MeOH:EtOAc (1:9)的梯度纯化粗产物2e，为浅黄色泡沫（异构体A，482mg，68% 产率）。
[0209] 对2d (异构体B，700mg)实施相同的反应，并得到相应的产物2e (异构体B，488mg， 69%产率）。
[0210] 室温下，向起始核苷2e(异构体A) (233mg，0. 33mmol)的CH3CN(IOmL)溶液中加入 Hunig's 碱（173 yL，Immol)和 B0P(165mg，0. 39mmol)。搅拌 5 分钟后，用 Me2NH(2M 的 THF 溶液）（(X41ml，0.82mmol)处理溶液。用TLC(MeOH:DCM= l:9v/v)监测反应进程。反应在 2小时后终止，届时通过TLC不再可见起始材料。反应混合物在DCM = NaHCO3 (1:1) (50mL)之 间分配。分离有机层，水层用DCM进一步萃取（2X30mL)。合并的有机萃取物用MgSOzrT 1燥， 过滤并减压蒸除易挥发成分。通过Biotag硅胶柱（10g)，使用从DCM:Et0Ac(8:2)(v/v)到 EtOAc的梯度纯化粗产物2f (R = NMe2),为浅黄色泡沫（异构体A，220mg，90 %产率）。
[0211] 对2e(异构体B，249mg)实施相同的反应，并得到了相应的产物2f(异构体B， 24〇11^，92%产率）。
[0212] 将起始材料2f (异构体A和B的混合物）（455mg，0. 61mmol)溶解于THF (2mL)中， 并用冰浴冷却至4°C。然后，缓慢加入TBAF (1.0 M的THF溶液，5wt. %水，1.0 mL，1.0 mmol)， 历时5分钟。将反应混合物缓慢加热至室温。用TLC(EtOAc)监测反应进程，反应在1小 时后终止，届时通过TLC不再可见起始材料。将反应溶液溶解在DCM(30mL)中，并加入 NaHCO3(30mL)。将两层分离，并用另外的DCM萃取水层（30mLX2)。合并有机萃取物，干燥 (MgS0 4)，过滤，并蒸发，得到黄色油。通过Biotag硅胶柱（10g)，使用从DCM:EtOAc 8:2(v/ v)到EtOAc再到Me0H:Et0Ac(2:8)的梯度纯化粗产物2g，为白色固体（52%产率，160mg)。
[0213] 相应的三磷酸酯2h的制备以及进一步将染料附接至核碱基上以得到完全功能化 的三磷酸核苷（ffN)2i已报导于WO 2004/018497,并通常为本领域技术人员所熟知。
[0214] 实施例3
[0215] 带有3' -OH保护基的核苷酸的合成
[0216]
[0217] 方案3示例性说明了用于制备具有二氟甲基取代的叠氮基甲基3'_0H保护基的修 饰的核苷酸的合成路线。化合物3a_3i使用修饰的胸腺嘧啶（T-PA)作为碱基。可以使用 的碱基的其他非限制性实例包括Cbz-PA、ADMF-PA和GPac-PA，其结构显示于上文的方案1 中。3b，3c和3d的合成程序描述于实施例2中。
[0218] 实验稈序
[0219] 于_78°C下，将N-叔丁基苯硫腈氯化物（181mg，0. 84mmol)的无水DCM(2ml)溶 液缓慢添加至起始核苷3d(异构体A) (490mg，0. 7mmol)与DBU(209 yL，I. 4mmol)的无水 DCM(5mL)溶液中。反应混合物于-78°C下搅拌2小时。用TLC(EtOAc:DCM 4:6v/v)监测反 应进程。反应在2小时后终止，此时TLC表明仍剩余10%的起始材料，以防止过度反应。将 反应混合物在DCM :NaHC03(l:l)(50mL)之间分配。水层用DCM进一步萃取（2X30mL)。合 并有机萃取物，干燥（MgSO 4),过滤、并蒸发，得到黄色油。通过Biotag硅胶柱（IOg)，使用 从石油醚：EtOAc (8:2) (v/v)到石油醚：EtOAc (2:8) (v/v)的梯度纯化粗产物3e，为浅黄色 泡沫（异构体A，250mg，51 %产率）。
[0220] 对3d(异构体B，480mg)实施相同的反应，并得到了相应的产物3e(异构体B， 24〇11^，50%产率）。
[0221] 于4°C (冰浴）下，将DAST (181mg，0· 84mmol)的DCM(2. 5mL)溶液缓慢添加至起始 核苷 3e(异构体 A) (342mg，0. 49mmol)、Et0H(15 yL，0. 25_〇1)的 DCM(2. 5mL)溶液中。将 反应混合物于4°C下搅拌1小时。用TLC(EtOAc:石油醚=3:7v/v)监测反应进程。反应在 1小时后终止。将反应混合物在DCM = NaHCO3 (1:1) (50mL)之间分配。水层用DCM进一步萃 取（2X30mL)。合并有机萃取物，干燥（MgS04)，过滤，并蒸发，得到黄色油。通过Biotag娃 胶柱（IOg)，使用从石油醚：EtOAc(9:1) (v/v)到石油醚：EtOAc(2:8) (v/v)的梯度纯化粗产 物3f，为浅黄色泡沫（异构体A，lOOmg，28 % )。
[0222] 对3e(异构体B，480mg)实施相同的反应，并得到了相应的产物3f(异构体B， 24〇11^，50%产率）。
[0223] 将起始材料3f (异构体A) (124mg，0. 17mmol)溶解于THF (2mL)中，并用冰浴冷却 至 4°C。然后，缓慢加入 TBAF (1.0 M 的 THF 溶液，5wt. %水，255 μ L，