专利名称：异柠檬酸脱氢酶,其基因,以及其在肥胖、高脂血症、和脂肪肝治疗和在脂类生物合成中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种异柠檬酸脱氢酶，其催化产生对于脂类的生物合成所必需的NADPH，所述的脂类包括脂肪酸、角鲨烯和胆固醇，本发明还涉及异柠檬酸脱氢酶在代谢性疾病治疗中的用途，所述的代谢性疾病包括肥胖、高脂血症和脂肪肝。同样，本发明涉及异柠檬酸脱氢酶基因、含有该基因的融合基因构建体、在其基因组中包含该基因的转染子细胞、和能够在其整个寿命期间连续表达异柠檬酸脱氢酶的转基因动物。
背景技术：
参加TCA(三羧酸)循环的异柠檬酸脱氢酶，催化柠檬酸氧化脱羧成α-酮戊二酸并同时产生NADH或者NADPH。
在高等动物中，根据异柠檬酸脱氢酶异构酶的辅助因子和它们在细胞中的位置，可以将其分为三类线粒体NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(以下称为“IDH”)，线粒体NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(以下称为“IDPm”)，和细胞质NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(以下称为“IDPc”)。在这些异柠檬酸脱氢酶中，据信IDH在三羧酸循环(TCA)中的、伴随有α-酮戊二酸和NADH生成的异柠檬酸氧化脱羧中，起着主要的作用。NADH通过电子传递系统被用于能量生成，且α-酮戊二酸是用在氨基酸(例如谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、和脯氨酸)和其它生物制品合成中的一种代谢物。IDH的活性的调控被作为TCA循环的控制点。所以，IDH不仅是调控TCA循环的关键酶，而且是调控能量代谢、蛋白质生物合成和氮代谢的关健酶，这是因为TCA循环的代谢物参与了这些物质代谢。
自从IDH从酵母和猪中被分离出来以后就已对其进行了研究。酵母IDH是以八聚物形式存在的一种变构调节酶，其由两个不相同的、相互之间高度同源的亚基IDH1和IDH2构成。IDH1在酶活性的调节中起作用，而IDH2负责催化活性(Keys，D.A.& McAlister-Henn，L.，J.Bacteriol.，172，4280-4287，1990)。猪IDH分为三个亚单位，其同样以八聚物的活性形式存在(2(α2βγ))。
发现IDPm和IDPc具有两分结构，但是至于它们的功能却并不清楚。虽然两者都具有大约为45kDa的分子量并高度同源，但是使用多克隆抗体通过免疫反应实验进行的分析，这两种酶却被鉴定为不同的、独立的蛋白质(Plaut，G.W.E.等，Biochem.Biophys.Acta.，760，300-308，1983；Fantania，H.R.等，FEBS，322，245-248，1993)。特别地，IDPm和IDPc是高度组织特异的。例如在心肌组织中，全部的NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶中超过90％存在于线粒体中，剩余的10％发现在细胞质中。相反，据报道在肝脏组织中，在线粒体中仅发现有3％的全部的NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶，而剩余的97％存在于细胞质中(Plaut，G.W.E.，Current Topics in CellRegulation，2，1-27，1983)。
如上所述，已经表征了涉及异柠檬酸脱氢酶异构酶的结构的一些特征，但是没有涉及其功能。特别是，直到最近一些报道出版之前，还没有发现有关IDPm和IDPc精确机理的研究，这些最近的报道也仅仅是假设IDPm在TCA循环中催化一个逆反应，通过异柠檬酸到柠檬酸来转换α-酮戊二酸，这与提供作为脂肪酸和胆固醇生物合成的前体的乙酰辅酶A的三羧酸盐载体相关，伴随着同时将柠檬酸转换为草酰乙酸以提高细胞质磷酸烯醇丙酮酸的水平，从而促进了糖原异生(Des Rosiers，C.等，J.Biol.Chem.，269，27179-27182，1994；Fernandez，C.A.等，J.Biol.Chem.，270，10037-10042，1995)。
由于IDPm对TCA循环的逆反应的催化作用，暗示了其在糖原异生中的意义。相反，没有有关IDPc代谢功能方面的报道。已知IDPc在卵巢和乳腺中大量表达。在大鼠肝脏中存在的NADPH产生酶中，已经对IDPc进行了定量分析其比磷酸戊糖途径中的重要的酶产生更大量的NADPH；所述的这些重要的酶即，用于将葡萄糖-6-磷酸盐转换成6-磷酸葡糖酸-δ-内酯和NADPH的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、用于将6-磷酸葡萄糖酸盐转换成核酮糖-5-磷酸盐和NADPH的6-磷酸葡糖酸脱氢酶、和用于将苹果酸盐转换成丙酮酸盐和NADPH的细胞质苹果酸酶；分别是16、8和18倍(Veech，R.L.等，Biochem.J.，115，609-619，1969)。
在细胞质中，涉及脂肪酸、胆固醇和激素代谢的各种酶，它们的催化活性需要大量的NADPH。迄今为止，据信NADP产生酶如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸酶在向细胞质提供NADPH中起着主要的作用。但是，根据其产生细胞质NADPH的能力，预计IDPc更能调节NADPH的供应。最终，据认为IDPc在脂肪酸和胆固醇的生物合成中起着决定性的作用。在涉及脂肪酸生物合成的脂肪酸合酶中，β-酮酰基-ACP还原酶和烯酰基-SCP还原酶需要将NADPH作为其催化作用的辅助因子。在胆固醇的生物合成中，需要将大量的NADPH用于由HMG-CoA还原酶和角鲨烯合成酶催化的反应，并且需要将大量的NADPH用于从羊毛甾醇到胆固醇的最后19步反应中。因此，控制IDPc的活性对于调节脂肪酸及其衍生物、脂类、角鲨烯、和胆固醇及其衍生物的生物合成是非常重要的，所述IDPc的功能是提供细胞中所需的大多数NADPH。
在高等动物中，脂类的沉积遵循以下程序。当可以得到过剩能源的时候，脂肪细胞的分化加速，导致伴随着脂类沉积的白色脂肪组织在数量和大小上增加。依次，白色脂肪组织使得ob基因活性表达，这样引起体内的瘦素(leptin)水平增加。作为响应，脑中的激素作用向着食欲降低的方向改变。期间，使用解偶联剂蛋白质(UCP)消耗过剩的卡路里以保持体温。在白色脂肪组织中，编码用于脂肪细胞增殖的主转录因子基因的表达被激活，这些主转录因子例如过氧化物酶体增殖子激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ)(PPARγ)，C/EBPα和ADD1/SREBP1。这样，促进了脂肪细胞分化和脂类沉积，并且过量的身体能量以脂类的形式被储存起来，这样，身体能量被平衡(Hu，E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，9856-9860，1995；Keller，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，20，9856-9860，1993；Freytag S.O.，等，Genes Dev.，8，1654-1663，1994；Tontonoz，P.等，Mol.Cell.Biol.，13，4753-4759，1993；Spiegelman，B.M.，Cell，87，377-389，1996)。用于活化PPARγ(一种用于脂肪细胞分化的主转录因子)所必需的配基的实例，包括多不饱和的脂肪酸例如亚油酸、二十二碳六酸(DHA)、和花生四烯酸(Krey，G.等，Mol.Endocrinol.，11，779-791，1997；Yu等，J.Biol.Chem.，270，23975-23983，1995)。同样，已知前列腺素可作为主转录因子的配基(Forman B.M.等，Cell，83，803-812，1995；Kliewer S.A.等，Cell，83，813-819，1995)。
从此综述中，可以得出一个可能性很高的结论由于IDPc能够产生NADPH，它可能直接参与控制各种脂肪酸、胆固醇、和激素的生物合成。同样，可以认为在肥胖和脂肪肝中，IDPc通过刺激产生PPARγ的活化配体例如多不饱和脂肪酸和花生四烯酸，引发各种与脂肪细胞分化相关的各种基因表达，从而起到重要的作用。另外，对用于胆固醇生物合成的NADPH的大量需求，提供了这样的可能性对IDPc及其反应产物NADPH的细胞内水平的人工调控，可以提供一种控制胆固醇生物合成的方法。
发明概述为了完成本发明，发明者通过使用转染子动物细胞和转基因小鼠的分子生物学和生物化学实验，对脂类生物合成的机理进行了大量细致广泛的研究，结果发现IDPc及其反应产物NADPH的细胞内水平，不仅对脂肪细胞的分化率和脂类在脂肪细胞中的沉积、而且对脂类和胆固醇的生物合成都具有决定性的影响。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于产生NADPH的异柠檬酸脱氢酶，以及它的基因。
本发明的另一个目的是提供一种融合基因构建体，其含有编码异柠檬酸脱氢酶的基因、在其基因组中包含该基因的转染子细胞、和可以在其整个寿命期间连续地表达该基因的转基因动物。
本发明的另一个目的是提供异柠檬酸脱氢酶及其基因在防治肥胖、高脂血症、和脂肪肝中或者在脂类生物合成中的应用。
图1提供了示意图，这些示意图显示了基本LNCX-载体(顶部)、以有义方向将IDPc基因插入该载体以增加NIH3T3 F442A脂肪细胞中IDPc基因的表达的重组体载体(中间)、和以反义方向将IDPc基因插入该载体以降低NIH3T3 F442A脂肪细胞中IDPc基因的表达的重组体载体(底部)。
图2a提供了在平板上的、分化自正常NIH3T3 F442A的油红O染色的脂肪细胞(左边)；带有增强的IDPc基因表达的转化子FS1细胞(中间)；和带有降低的IDPc基因表达的转化子FS1细胞(右边)的光学照片(上组)，和局部放大200倍的光学照片(下组)。
图2b提供了显示脂肪细胞中脂类沉积的光学照片，这种沉积是NADPH剂量依赖模式的。
图3图解了用于生成转基因动物的重组表达载体的构建体，其中将IDPc cDNA插入到鼠源PEPCK(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)基因启动子下游。
图4提供了照片，这些照片显示了来自本发明转基因小鼠的F1后代与正常小鼠之间的身体大小和附睾脂垫沉积的比较。
图5提供了放射自显影照片，这些照片显示了与正常小鼠相比较，在本发明转基因小鼠的脂肪组织中肥胖显示基因表达水平的增加。
图6a是一张柱形图，其比较了转基因小鼠F1的体重与正常小鼠的体重。
图6b是一张柱形图，其比较了转基因小鼠F1的肝重与正常小鼠的肝重。
图6c是一张柱形图，其比较了转基因小鼠F1与正常小鼠的IDPc活性和血液IDPc水平。
图6d是一张柱形图，其比较了转基因小鼠F1与正常小鼠的[NADPH]/[NADPH+NADP+]。
图6e是一张柱形图，其比较了转基因小鼠F1与正常小鼠的附睾脂垫重量。
图6f是一张柱形图，其比较了转基因小鼠F1与正常小鼠的血液甘油三酯和胆固醇水平。
图6g是一张柱形图，其比较了转基因小鼠F1与正常小鼠的肝脏中的甘油三酯和胆固醇水平。
图6h是一张柱形图，其比较了转基因小鼠F1与正常小鼠的血液瘦素水平。
图7a提供了显示本发明转基因小鼠与对照小鼠的肝脏组织的照片。
图7b提供了显示本发明转基因小鼠与对照小鼠的脂肪细胞的照片。
图8a是一张图，其图解了乙二酸一酰基苹果酸对异柠檬酸脱氢酶活性的抑制活性。
图8b是一张图，其图解了甲基异柠檬酸对异柠檬酸脱氢酶活性的抑制活性。
图9提供了在平板上的、油红O染色的、分化自未经异柠檬酸脱氢酶抑制剂处理的NIH3T3 F442A的脂肪细胞(左边)；经乙二酸一酰基苹果酸处理的NIH3T3 F442A的脂肪细胞(中间)；和经甲基异柠檬酸处理的NIH3T3 F442A的脂肪细胞(右边)的光学照片，这些光学照片分别放大了100倍(上组)和200倍(下组)。
图10a是一张柱形图，其图解了给予了本发明的异柠檬酸脱氢酶抑制剂的大鼠与未给予该抑制剂的大鼠之间在肝脏重量和附睾脂垫重量上的比较。
图10b是一张柱形图，其图解了给予了本发明的异柠檬酸脱氢酶抑制剂的大鼠与未给予该抑制剂的大鼠之间在血液甘油三酯和胆固醇水平上的比较。
图10c是一张柱形图，其图解了给予了本发明的异柠檬酸脱氢酶抑制剂的大鼠与未给予该抑制剂的大鼠之间在血液HDL水平上的比较。
发明详述一方面，本发明涉及异柠檬酸脱氢酶，其催化对于脂肪酸和胆固醇生物合成以及脂类沉积所必需的NADPH的生成，并且涉及编码异柠檬酸脱氢酶的基因。
本发明使用分离自小鼠的IDPc。如No.3序列所列，本发明的鼠源IDPc基因具有大小为1,245bp的开放阅读框(ORF)，并存在推定poly-A信号——碱基序列AATAAA的不翻译区(UTR)。IDPc基因编码的IDPc蛋白有414个氨基酸组成，其分子量为46,575Da，列于No.4序列中。线性比较来自不同物种的IDPc氨基酸序列，结果显示本发明的小鼠IDPc与大鼠IDPc有97.8％的同源性、与牛IDPm有68.5％的同源性、与酵母IDPc有64.4％的同源性。特别是，小鼠IDPc从412-414的氨基酸序列与已知涉及脂肪酸与胆固醇生物合成与降解的过氧化物酶体的靶序列相同。因此，这暗示IDPc很可能移动到过氧化物酶体并在那里参与脂肪酸和胆固醇的合成。
除了IDPc和IDPm，依照本发明，也可以将一种具有与IDPc基因碱基序列的类似的基因用于生产NADPH，NADPH是脂肪酸和胆固醇生物合成以及脂类沉积所需要的。
另一方面，本发明涉及含有所述基因的融和基因构建体、锚定所述基因的新细胞株、和在其整个寿命期间持续表达所述基因的转基因动物。
所以，先要以特定方式将目的基因插入到哺乳动物细胞表达载体中，从而以有义方向或者反义方向转录该基因。
在这点上，优选将反转录病毒表达载体用作基因载体，最优选pLNCX反转录病毒载体。pLNCX衍生自MMLV(Moloney鼠白血病病毒)，其具有用于在哺乳动物细胞中表达外源基因的CMV(巨细胞病毒)启动子、作为选择性标记的新霉素、和反转录病毒载体的鉴定因子——LTR(长末端重复)序列。
在如此制备的融和基因构建体中，将那些由CMV启动子以有义方向转录的融和基因用来增强IDPc表达，而将那些被设计为反义转录的融和基因用来抑制IDPc表达。将所得到的重组载体引入一种前成脂肪细胞——NIH3T3 L1中。在那些被鉴定为在其基因组中已经整合了IDPc基因的转染子细胞中，将以有义方向插入的IDPc基因命名为FS1，其被保藏在韩国生物科学与生物技术研究院典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Culture of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB))，保藏号No.KCTC 0861BP，保藏日期2000年9月6日。另一方面，将以反义方向插入IDPc的基因命名为FAS1。
经测定，与只引入了pLNCX载体的鼠NIH3T3 L1细胞(对照)相比较，以有义方向引入IDPc基因的NIH3T3 L1转染子细胞(FS1)的酶活性要比对照组的酶活性高2倍，但是以反义方向引入IDPc基因的NIH3T3L1转染子细胞(FAS1)的酶活性要比对照组的酶活性低0.4倍。
IDPc对脂肪酸生物合成的影响可以通过使用一种脂类特异性的染料——油红O来定量测定，将油红O施用到经胰岛素处理后已经从转染子细胞分化的脂肪细胞上。结果发现在具有增强IDPc基因表达的转染子细胞FS1中，脂类产生要比对照细胞更加活跃。另一方面，在具有降低IDPc基因表达的转染子细胞FAS1中，与对照细胞相比只发现很少的脂类沉积。(见图2a)。虽然在IDPc的酶促反应产物NADPH存在时被分化成脂肪细胞，但是只被引入pLNCX的转染子细胞(即对照细胞)随着NADPH的浓度增高，显示出较高的分化率和较大的细胞内脂类沉积(见图2b)。这些结果显示IDPc、其基因、或者其酶促反应产物NADPH在决定细胞内脂类沉积上起着重要的作用。
接下来，为了检验异柠檬酸脱氢酶的活性，将融和基因构建体用于制备在其基因组中容纳IDPc基因的转基因动物。
1.融合基因构建体的制备为了永久地表达IDPc基因，需要将该基因整合到动物的基因组中。为了这一目的，首先有必要构建能够在哺乳动物中表达目的基因的重组体构建体。在所得到的融和基因构建体中，目的基因的表达处于合适的启动子基因的控制之下。此处使用的术语“融和基因构建体”，指的是在特定生物转化中使用的基因的功能性组合，其主要包含至少一种结构基因，和至少一种用于控制该结构基因表达的顺式作用调控元件。
通常，顺式作用调控元件可以是下列形式启动子、增强子、内含子、5′-UTR(不翻译区)、和3′-UTR。在融和基因构建体中，顺式作用调控元件可以位于结构基因5′-翼区(flanking region)，3′-翼区，5′-端或者3′-端的小于等于10kb距离内的任何位点，或者在结构基因内(内含子的情况下)。除了结构基因和顺式作用调控元件，融和基因构建体还含有各种组分，包括用于提高转录率和翻译率的多腺苷酰化信号、核糖体结合序列、内含子等等。除这些外，还可以给融和基因构建体提供用于提高目的基因插入基因组或者某些位点的效率的碱基序列、以及用于鉴定这种插入的标记基因。
在构建转基因动物中所使用的、用于融和基因构建体的启动子，包括CMV启动子、或者能够使基因在白色脂肪组织中可表达的表达调控区例如编码脂蛋白脂肪酶(LPL)、补体因子D(adipsin)、脂肪细胞蛋白2(aP2)和IDPc的基因。在本发明的优选实施方案中，使用了用于胞质磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因的大鼠源启动子，该基因在肝脏和白色脂肪组织中都表达。
更详细地说，永久表达IDPc基因的转基因动物的制备从大鼠的胞质PEPCK基因开始。从这个基因中获得了一个含有启动子的2.2kb的5′上游序列。在该序列的下游，以有义方向插入小鼠IDPc cDNA来制备融和基因构建体，将其命名为pPEPCKIDPc。存在两种PEPCK基因一种编码胞质酶，另一种编码线粒体酶。在本发明中，使用编码胞质PEPCK(以下称为″ PEPCK-C″)的基因的5′上游序列。在肝脏、肠和肾脏中，依赖于存在于5′上游序列中的调控区域，来确定PEPCK-C基因表达处于启动子调控下的组织。在本发明中使用的PEPCK-C基因的2.2kb的5′上游序列，包含靠近nt987的一个基因序列，已知该序列是在白色脂肪组织有效表达所必需的调控区(Hanson，R.W.Annu.Tev.Biochem.，66，581-611，1997)。
虽然使用小鼠构建转基因动物非常有益，但是由于IDPc是一种在所有高等动物中表达的酶，所以在本发明中可以使用任何动物，只要能够将其构建成转基因的。
2.胚胎的制备构建转基因动物的最重要的步骤之一是将融和基因构建体引入到胚胎中。通过微注射系统来进行这种引入。当将融和基因构建体显微注射到胚胎时，优选使用能够自动将DNA的量控制在4pl极限的自动显微注射系统，因为这种系统要比常规的手动显微注射系统在成功率方面更加优异。将含有IDPc融和基因构建体的小鼠胚胎保藏在韩国生物科学与生物技术研究院典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Culture of Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology(KRIBB))，保藏号No.KCTC0874BP，保藏日期2000年11月4日。
3.转基因动物的制备接下来，将包含融和基因构建体的胚胎移植给代孕母体以提供转基因动物。在本发明中，为了方便，在一细胞分裂期而不是二细胞分裂期将胚胎移植到代孕母体中。在显微注射融和基因构建体后，立刻将一细胞分裂期胚胎移植到代孕母体的输卵管，其目的是为了减少将胚胎培养到二细胞分裂期所必需的多个过程。对于在二细胞分裂期将胚胎移植到输卵管，例如，胚胎需要在培养箱内额外培养一天。为了将二细胞分裂期胚胎移植到输卵管漏斗，必须将胚胎深深地插入输卵管，或者必须通过使用针来刺穿输卵管。但是，尽管移植位点同样是输卵管漏斗，将一细胞分裂期胚胎移植给代孕母体却可以在类似于普通小鼠胚胎的条件下进行。
使用如此构建的转基因动物，依照下面的指示特征来检验IDPc的体内活性1.附睾脂垫的增大出生23星期以后，F1杂合转基因小鼠比对照小鼠长得更大。解剖后，经测量发现与对照小鼠比较，F1杂合转基因小鼠附睾脂垫的大小明显增加，且重量是对照小鼠的14倍。另外，与对照小鼠比较，当背部被磨破后，可以观察转基因小鼠的背部有大且多的表皮肥大细胞。将腹部皮肤去除，可以在转基因小鼠中观察到附睾脂垫有明显增加(见图4)。
2.肥胖指示基因的表达率对于IDPc是否对肥胖指示基因的表达有影响进行了检验。在IDPc基因转基因小鼠的附睾脂垫中，发现了被引入的重组IDPc基因的表达，同时表达的还有它们的内源性IDPc基因，这证明总体IDPc的表达被增加了。另外，还发现了肥胖指示基因的表达增加，所述的肥胖指示基因例如编码脂肪细胞蛋白2(aP2)、补体因子D、脂蛋白脂肪酶(LPL)、瘦素、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和过氧化物酶体增殖子活化受体γ(PPARγ)的基因。已知所有这些基因在肥大细胞的分化中显示出有效增加的表达(Hwang，C.S.等，Ann.Rev.Cell Eev.Biol.，13，231-259，1997；Lemberger，T.等，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，12，225-362，1996；Spiegelman，B.M.等，Cell，87，377-389，1996)。
近来一些报道揭示PPARγ在肥大细胞的分化中和脂类的生物合成中都充当主转录因子(Spiegelman，B.M.，等，Cell，87，377-389，1996)。根据这些报道，在IDPc转基因小鼠中的肥胖指示基因(例如编码aP2、补体因子D、LPL、瘦素、和/或TNF-α)表达的增加，是由PPARγ基因表达增加引起的。因此，可以得出结论归因于IDPc基因活跃表达和相伴随的NADPH水平增加的IDPc活性增加，引起PPARγ基因表达的急速增加，这对于脂肪细胞的分化和脂类的生物合成都是不可或缺的(见图5)。而且，有报道揭示PPARγ活化所必需的配体水平的增加，刺激PPARγ基因自身的表达(Kim，J.B.等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA.，95，4333-4337，1998)。当将这一报道和所述的那些结果一同考虑时还可以得出这样的结论IDPc的活性和酶产物NADPH水平的增加，首先刺激了作为能够诱导PPARγ活化的配体——多不饱和脂肪酸的产生，并其次反过来诱导了PPARγ基因本身的表达，从而提高了分化指示基因的表达水平，所述的分化指示基因例如编码aP2、补体因子D、LPL和瘦素的基因，这些基因涉及多种脂肪细胞的分化，并最后导致肥胖和脂肪肝。
3.脂类沉积在体内的鉴定已经发现IDPc活性在这些转基因小鼠的肝脏和附睾脂垫中分别要比对照小鼠中的IDPc活性高2.7和1.4倍(图6c)。相应地，NADPH与整个NADP库([NADPH]/[NADP+]+[NADPH])的比率随着IDPc酶活性的增加而增加(见图6d)。转基因小鼠的重量与正常小鼠相比，增加了35％或者更多(见图6a)，转基因小鼠的附睾脂垫与对照小鼠相比增加的更明显(见图6e)。但是肝脏的重量没有变化(见图6b)。
另外，经测量，转基因小鼠血液中甘油三酯和总胆固醇的水平比对照小鼠高1.8-2.4倍(见图6f)。与血液相似，转基因小鼠肝脏中的甘油三酯和胆固醇水平都有增加(见图6g)。瘦素是一种主要产自肥大细胞的蛋白，经检测发现其在转基因小鼠血液中的水平是对照小鼠中的两倍(见图6h)。
另外，与对照小鼠相比，已经观察到在转基因小鼠的肝脏中有较大量的脂肪沉积。另一个明显的增加是转基因小鼠附睾脂垫中脂肪细胞的大小大于对照小鼠(见图7a和7b)。
如上所述，表现出IDPc基因更加活跃表达的转基因小鼠的重量增大，是由于身体脂肪量的增加，而且在脂肪组织中，各种肥胖指示基因在转基因小鼠中的要比对照小鼠中更为活跃地表达。例如，PPARγ水平明显增加，PPARγ是一种激活编码酶的基因转录的转录因子，所述的酶负责脂类的生物合成。因此，IDPc基因表达的增加，主要导致更大量的、对于脂肪酸生物合成所必需的NADPH的产生，并且使得如此得到的丰富的脂类衍生物诱导PPARγ的活化和基因表达，PPARγ反过来又会活化肥胖指示基因的表达并最终导致IDPc转基因小鼠的肥胖。同时，IDPc基因表达和活性的增加以及NADPH细胞水平的增加，增加了这样的酶的活性，这些酶涉及胆固醇的生物合成，并通过脂类水平的增加活化脂蛋白的生物合成以产生更多量的胆固醇复合物，其中胆固醇与脂蛋白相关。
在另一方面，本发明涉及一种筛选物质的方法，所述的物质抑制异柠檬酸脱氢酶的酶活性和基因表达，并因此对于治疗代谢性疾病如肥胖、高脂血症、和脂肪肝有效。
基于以上公开的酶的功能，本发明提出了运用如下事实来治疗因体内脂肪水平增加而引起的代谢性疾病例如肥胖、高脂血症、和脂肪肝的治疗方法，所述的事实是异柠檬酸脱氢酶活性和表达的增加，促进了NADPH的生物合成，NADPH反过来活化PPARγ并升高脂肪酸、角鲨烯以及胆固醇的体内水平。
在这一点上，分光光度测定法非常有用。更详细地说，首先，使用10倍浓缩的反应缓冲液加上三蒸水的混合物，在340nm处将分光光度计调节到吸光度为0。在将含有10×缓冲液的水晶比色皿，测试样品和三蒸水放置在分光光度计中之后，将异柠檬酸脱氢酶加入比色皿并随时间测量在340nm处的吸光度变化。
由于在含有较高浓度酶活性抑制样品的比色皿中，吸光度降低得较快，所以对分光光度法数据的分析能够筛选异柠檬酸脱氢酶抑制剂。
使用5种样品，即烟酸、烟碱酰胺(nicotine amide)、丁氨苯丙酮、甲基异柠檬酸和乙二酸一酰基苹果酸来测试对异柠檬酸脱氢酶的抑制活性。在前两种样品中没有发现抑制活性，而丁胺苯丙酮显示出一些抑制作用。相反，却测定出甲基异柠檬酸和乙二酸一酰基苹果酸对异柠檬酸脱氢酶活性具有明确的抑制活性。
在另一方面，本发明涉及使用NADPH来促进脂类、胆固醇和角鲨烯的生物合成和活化PPARγ，这基于本发明的第一发现人工增加细胞的NADPH水平，会很大程度上引发肥胖和高脂血症，并升高了甘油三酯的细胞水平。
实施例根据下面的实施例，可以更好地理解本发明，这些实施例的目的是为了阐述，不能将其理解为对本发明的限制。
实施例1IDPc基因的分离和测序1-1.小鼠IDPc cDNA的分离使用新近报道的大鼠IDPc cDNA来制备鉴定小鼠IDPc cDNA的探针(Jennings等，J.Biol.Chem.，169，21328-23134，1994)。基于大鼠IDPc cDNA基因核苷酸532-550合成No.1序列中所列的有义引物，并且基于核苷酸1263-1245合成No.2序列中所列的反义引物。分别地，通过使用反转录酶将分离自大鼠肝脏的mRNA转换成cDNA。使用这些引物进行PCR，首先在94℃预变性4分钟；然后执行25个循环在94℃下变性1分钟、在50℃退火1分钟、并在72℃延长2分钟；最后再在72℃进一步延长10分钟，100ng的cDNA文库被用作模板。作为结果，扩增了0.8kb的DNA序列。将此PCR产物克隆到pCR II(Invitrogen Co.)。测序克隆插入物以鉴定大鼠IDPc基因。
小鼠IDPc cDNA分子克隆的起始步骤是用标记了[α-32p]dCTP-的大鼠IDPc cDNA基因作为探针，与小鼠NIH3T3细胞(Stratagene)的cDNA文库进行斑块杂交。所有的杂交步骤和清洗过程都在65℃下进行。对于初步筛选，将具有5×104PFU的cDNA文库噬菌体与3×108个E.coli XL1-blue细胞在37℃混合15分钟。在与7ml的软琼脂糖培养基(0.7％琼脂糖，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)均匀混合后，将噬菌体和宿主培养物倒在150mm的TYM-Ap琼脂糖平板上(1.5％琼脂糖，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，10mM MgSO4，50μg/ml氨苄青霉素)，固化，并在37℃下培育12小时。在噬斑形成后，将平板储存在4℃1个小时，而后，将噬菌体转移到硝酸纤维素膜上。关于使用此噬菌体杂交，将所述的硝酸纤维素膜顺次用蒸馏水和1M NaCl浸泡，并在3MM的滤纸上干燥。用此硝酸纤维素膜覆盖涂布有噬菌体的软琼脂平板并且随后用另一张硝酸纤维素膜覆盖以复制。将这些复制的膜浸入变性缓冲液(0.5M NaOH，0.5M NaCl)5分钟以使得那些宿主细胞溶胞中的噬菌体和噬菌体DNA变性，并且使其处于中和缓冲液(0.5M Tris-Cl，pH8.0，0.5M NaCl)中5分钟，最后在3MM的滤纸上干燥。
通过在80℃烘烤2小时以将噬菌体DNA固定到膜上，随后用含有1％SDS的6×SSC(1x SSC；0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)清洗膜，而后在65℃预杂交2小时。将用[α-32P]dCTP-标记的大鼠IDPc基因用作探针，杂交在含有5×Denhardt溶液(0.1％ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％BSA)，鲑精DNA 100μg/ml，和0.01％SDS的6×SSC溶液中进行。在杂交完成后，将膜与X射线胶片直接接触12小时。所得到的反射自显影照片能够使单斑分离。
用EcoR1切割提取自独立噬菌体的6个DNA克隆，并使用[α-32P]dCTP-标记的IDPc基因作为探针进行DNA印迹杂交。鉴定出这6个噬菌体颗粒的片段大小为1.9-2.2kb。选择它们当中最大的cDNA片段来分离小鼠IDPc cDNA片段，而后将其亚克隆到pGEM7(+)载体(Promega)。
1-2小鼠IDPc cDNA的测序在Sequenase 2.0版试剂盒(美国生化药品)的帮助下，分析从实施例1-1中分离出来的小鼠IDPc cDNA基因的碱基序列。从所获得的碱基序列确定氨基酸序列。使用基因库数据来查找类似氨基酸序列并比较同源性。
从DNA碱基序列分析数据中发现，小鼠IDPc cDNA具有列于No.3序列中的1,245bp的ORF，并在其3′-UTR存在有被认作poly(A)+信号的AATAAA序列。由该IDPc基因的碱基序列所推导出的氨基酸序列被描述为由414个残基组成并且其分子量为46,575Da，其显示于No.4序列。
线性比较小鼠IDPc和其它种类源的异柠檬酸脱氢酶蛋白的结果显示本发明的小鼠IDPc与大鼠IDPc有97.8％的同源性、与牛IDPm有68.5％的同源性、并且与酵母IDPc有64.4％的同源性。
在小鼠IDPc的氨基酸中，发现序列核苷酸412-414与一种过氧化物酶体靶序列相同。已知过氧化物酶体参与脂肪酸和胆固醇的生物合成以及降解。这些结果提供了这样一种很高的可能性IDPc移动到过氧化物酶体并在那里参与脂肪酸和胆固醇的合成。
实施例2用IDPc基因转化的细胞系的构建
2-1用于表达IDPc基因的重组反转录病毒载体的构建关于在细胞中表达IDPc基因，将从实施例1中获得的IDPc cDNA以有义和反义方向亚克隆到逆转录病毒载体pLNCX(Miller，A.D.and Rosman，G.T.，Biotechniques，7，980-990，1989)中。
用ClaI在IDPc cDNA的两端进行切割，而后将被切割的DNA连接到反转录病毒载体。把重组体质粒引入E.coli DH5α并通过培养该微生物来进行扩增。通过使用限制性酶的消化，鉴定克隆插入物的方向。在所得到的重组体载体构建体中，如图1所示，通过使用巨细胞病毒启动子来指导IDPc cDNAs的有义或者反义表达。将通过限制性酶消化确定的、IDPc cDNA以有义方向插入的重组体载体用来增强目的基因的表达，而将被IDPc cDNA以反义方向插入的重组体载体用来限制目的基因的表达。使用不锚定该基因的反转录病毒载体pLNCX作为对照。将如此获得的重组载体引入一种成纤维细胞系小鼠NIH3T3。作为鉴定该转染的标志，还将含有GFP(绿色荧光蛋白)cDNA的pLNCX载体同时引入该细胞。
2-2转染子细胞系的构建利用BOSC23细胞，通过使用反转录病毒包装系统来将重组载体转染到NIH3T3细胞。在这一点上，将BOSC23细胞以2×106细胞/ml的密度培养在补充了10％FBS的DMEM(Dulbecco′s改良的Eagle培养基)中，而后，在将其用于转染前，将其保持在补充有25μM氯奎(chloroquin)和10％FBS的DMEM中。使用磷酸钙方法进行转染(Pear，W.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，8392-8396，1993)。在混合了2x HBS(20mM NaCl，1.5mM Na2HPO4，50mM HEPES，pH7.1)后，将含有10μg重组体载体DNA和0.25M CaCl2的溶液均匀地加入到生长BOSC23细胞的平板上，并在CO2培养箱内温育。温育10小时以后，给细胞提供补充有10％FBS的新鲜DMEM并继续培养24小时。仅将培养基在1,200rpm下离心并且将上清液通过45μm的滤器。向只含有重组体载体的过滤物中加入聚凝胺(Sigma)至浓度为4μg/ml。
在用于转染的重组病毒载体的制备中，以5×105细胞/ml的细胞密度接种NIH3T3细胞，并将其培养在补充了10％FBS的DMEM中。当细胞数量增加50％的时候，去除培养基并且将分离自包装细胞的反转录病毒颗粒加入到NIH3T3。接种5小时以后，给细胞提供新鲜的培养基并培养2天。
测定被重组反转录病毒体感染的NIH3T3的计数，随后以50细胞/孔的密度将细胞等分接种到96孔板中，在板孔中包含有添加了400μg/ml G-418(Gibco BRL)的DMEM。每隔一天更换一次G-418培养基，重新分离并培养每个孔中的NIH3T3细胞并且对其进行培养来选择第一NIH3T3转染子。关于次级筛选，对基因组DNA进行PCR来确证IDPc cDNA整合到基因组。
在最终在其基因组中鉴定出具有IDPc基因的细胞中，将被IDPc基因以有义和反义方向插入的转染子分别被命名为FS1和FAS1。将在其基因组中以有义方向容纳IDPc基因的细胞系FS1保藏在韩国生物科学与生物技术研究院典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Culture of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB))，保藏号No.KCTC 0861BP，保藏日期2000年9月6日。
实施例3在转染子细胞中IDPc和IDPm的酶活性为了确定转染子NIH3T3细胞中的酶活性，将细胞质从细胞中分离出来，使用Bradford分析来确定蛋白质的浓度。首先，用1×PBS将3×107细胞/ml清洗两遍，并用蔗糖缓冲液(0.32M蔗糖，0.01MTris-Cl，pH7.4)溶解。在1,000xg下离心细胞溶解物以去除细胞碎片，并随后在15,000xg下离心以沉淀线粒体。向含有细胞质碎片的移出上清液中，以1/10总溶液体积加入含有0.1％Triton X-100的PBS，随后使用Bradford分析来进行定量。通过在保持为25℃的缓冲液(50mM MOPS，pH7.2，35.5mM三乙醇胺，pH7.2，2mM NADP+，2mM MgCl2，5mM异柠檬酸，和1μg/ml鱼藤酮)中测量NADPH产量的变化来确定IDPc的酶活性。使用分光光度计，在340nm处的测量吸光度2分钟以确定由包含在胞浆蛋白中的IDPc所产生的NADPH的数量。关于该酶的定量，将在一分钟内可以产生1μM NADPH的量定义为1单位。
与只被引入LNCX-载体的对照细胞相比，被以有义方向引入IDPc基因的转染子FS1细胞的IDPc酶活性增加了大约2倍，而被以反义方向引入IDPc基因的转染子FAS1细胞的IDPc酶活性降低了大约0.4倍。
实施例4根据IDPc活性的脂肪酸在转染子细胞系中的合成为了检验IDPc对脂肪酸合成的影响，将转染子细胞系培养在补充了10％FBS、含有5μg/ml胰岛素，0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，Sigma)，1μM地塞米松(DEX)，和青霉素-链霉素(Gibco BRL)各50,000单位的DMEM中两天，以将细胞计数增加到大约3×104细胞/cm2的密度。此后，将细胞进一步在没有IBMX和DEX的DMEM中培养12天，期间每隔一天更换一次培养基。细胞培养在温度为37℃、潮湿的、5％CO2氛围的CO2培养箱中进行。
培养结束后，通过使用特定染油——油红O进行细胞处理来观察形成在脂肪细胞中的油的沉积。在这一方面，倒空培养基，而后将10ml的二甲胂酸盐缓冲液(90mM二甲胂酸盐，pH7.2，2％甲醛，2.5％戊二醛，0.025％CaCl2，5％蔗糖)加入细胞中，随后使其在4℃静置1小时。去除缓冲液以后，将5ml 40％异丙醇中的油红O加入这些细胞中并缓慢混合超过1小时，随后用40％异丙醇清洗。
图2a是对油红O染色的脂肪细胞的观察结果。如图2中的照片所示，与对照细胞相比，IDPc基因表达增加的转染子FS1细胞产生了更多数量的油。另一方面，相对于对照细胞，IDPc基因表达降低的转染子FAS1细胞显示出数量明显减少的油沉积。放大200倍的照片进一步显示了细胞组中脂肪细胞大小的差别。这些观察结果显示IDPc基因表达与水平和该酶的代谢产物NADPH的增加或者减少，对细胞脂肪沉积的增加或者减少有明显的影响。
实施例5根据NADPH浓度的细胞内的油沉积和脂肪细胞分化的改变使用脂类特异性染料——油红O来定量测定IDPc的代谢产物——NADPH对细胞油沉积的影响。只引入pLNCX载体的对照细胞NIH3T3 L1的培养条件与实施例4中的培养条件相同，以0μM，25μM和50μM的量加入培养基以使这些细胞分化成脂肪细胞。分化之后，用油红O溶液对这些细胞进行染色以显现细胞中形成的油沉积。被显现的结果见图2b。可以从图2b的照片中看出，存在外部NADPH的细胞比不存在外部NADPH的细胞累积了更多的油量。另外，当提供更多数量的外部NADPH时，可以观察到更广泛的油沉积。因此，我们认定NADPH即使是在被人工添加的情况下，也对脂肪细胞的分化和伴随产生的油沉积具有直接的正影响，所述的NADPH不但可以作为IDPc和IDPm异柠檬酸同工酶的反应产物获得，而且可以作为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的反应产物获得。
实施例6使用在其基因组中含有IDPc基因的转基因动物来鉴定IDPc的体内活性6-1构建转基因小鼠6-1-1制备用于显微注射的融和基因构建体为了在肝脏和脂肪细胞中组织特异地、永久地表达IDPc基因，在PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)的帮助下，使用列于No.5和6序列的一组探针，从大鼠胞浆PEPCK基因扩增包含启动子的2.2kb 5′-上游序列。使用BglII和SmaI，随后使用I-Pop-I来消化PCR产物，并用Mung Bean核酸酶处理以产生平端，其中一个平端用BglII切割。将该DNA消化产物插入到包含CMV启动子的哺乳动物表达载体pCI-neo中。用已经被XhoI和SalI双消化过的IDPc cDNA连接到此载体上。所得到的、其IDPc基因处于PEPCK 5′-上游序列调控下的重组载体被命名为pPEPCKIDPc。重组过程图示在图3中。
6-1-2制备用于显微注射的融和基因构建体将在实施例6-1-1中得到的小鼠IDPc融和基因构建体(约10μg)用限制性酶BglII和NsiI消化，随后将消化溶液在0.7％琼脂糖凝胶上解体以分离出4.9kb的含有目的基因的DNA片段。使用苯酚和CIAA(氯仿∶异戊醇＝24∶1 v/v)的体积比为1∶1的混合物处理被切割下来的、含有DNA片段的凝胶部分。将上面的部分以12,000rpm离心3分钟。回收上清液，向此上清液中加入等体积的醚，随后以10,000rpm离心5秒钟。去除上面的醚部分以后，向下面的DNA部分加入两体积的无水乙醇以沉淀DNA。将DNA沉淀以2-10μg/2.4ml的浓度良好地溶解于显微注射溶液(10mM Tris pH7.4，0.1mM EDTA)中。在4℃用显微注射溶液透析所得到的溶液24小时。为了显微注射，将总DNA浓度控制到2-4ng/μl并在-20℃储存以备使用。
6-1-3胚胎的制备FVB/N世系小鼠可以产生许多可收获的卵子并且其胚胎在显微注射时只受到很少的损伤，将孕雄性血清促性腺激素(PMSG)和人绒膜促性腺激素(hCG)以每只5IU的剂量经腹膜注射到这些小鼠中以诱导超数排卵。在注射PMSG和hCG20小时以后，毁坏小鼠的输卵管壶腹以回收卵丘细胞团，随后通过使用透明质酸酶(300μg/ml)处理3分钟来剥去卵丘细胞。在这些细胞中，选择一细胞分裂期胚胎用来进行显微注射，在一细胞分裂期胚胎中可以观察到每个细胞中有两个真核。
在使用装备有Normarski差异干扰对照(DIC)镜头的倒置显微镜来观察核膜的时候，在显微操作器的帮助下，将融和基因构建体显微注射到被选择的胚胎中。显微注射完成后，将存活者在37℃、5％CO2氛围的CO2培养箱内在M16培养基中进行培养。将含有IDPc融和基因构建体的所得到的小鼠胚胎保藏在韩国生物科学与生物技术研究院典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Culture of KoreaResearch Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB))，保藏号No.KCTC0874BP，保藏日期2000年11月5日。
6-1-4小鼠胚胎的移植和转基因小鼠的鉴定由于FVB/N世系小鼠的大子宫面积、高增殖及高哺育的能力，将它们用作试验受体。在雄鼠的发情期(该时期允许其与雌鼠交配)，切除雄鼠的输精管。第二天早上，将表现出阴道塞的雌鼠选作最终的试验受体。用剪刀在试验受体的输精管下的皮下组织解剖到1cm，随后在肌肉层进行解剖，而后将实施例6-1-3中的胚胎移植到如此暴露的相对输卵管中。
用PCR检查这些试验受体的后代，检查其基因组中是否有显微注射的小鼠IDPc融合基因构建体DNA的插入物，即pPEPCKIDPc。为此，从试验受体繁殖的2或3周龄小鼠身上切下2-3cm长度的尾部，在35μl蛋白酶K(10mg/ml)存在的情况下，在55℃，伴随着搅动作用将此尾部浸入700μl的溶解缓冲液(50mM Tris-Cl，pH8.0，100mM EDTA，100mM NaCl，1％SDS)中15-18小时。在用20μl的RNA酶(13μg/ml)将RNA水解后，向水解溶液添加等体积的苯酚，随后离心。用苯酚对上清液重复再抽提2或3次。向次最后上清液中加入两体积的无水乙醇以沉淀DNA。将CMV启动子的3′-翼区用作有义引物P1(No.7序列)并将IDPc基因的5′-翼区用作反义引物P2(No.8序列)，通过PCR来部分扩增作为模板的如此得到的小鼠基因组DNA(1μg)。PCR的起始步骤是在95℃变性5分钟，随后进行下列步骤的30个循环在95℃变性1分钟，在51℃退火1分钟，和在72℃延长1.5分钟。将PCR溶液在1.5％琼脂糖凝胶上解体，以将出现0.5kb DNA带的小鼠鉴定为转基因小鼠。将被选择的转基因雄性小鼠与野生型雌性FVB/N小鼠的交配后代的尾部切掉，并以相同的方式检验其转基因性以选择转基因小鼠，这些转基因小鼠在种系中被遗传了重组体IDPc基因。在用PCR鉴定为具有重组体基因以后，转基因小鼠后代被维系在杂合F2系中。与杂合F1转基因小鼠类似，发现这些F2杂合转基因小鼠显示出肥胖、高脂血症、和脂肪肝。
为了管理该转基因小鼠物种，部分切下2周龄小鼠的尾巴并由这些尾部来制备基因组DNA，分析外源目的基因的插入。一旦被鉴定为是转基因的，就根据性别分开这些小鼠并在它们的耳朵内作标记。
6-2脂肪组织的重量增加和转基因动物中的IDPc活性6-2-1转基因动物中附睾脂垫的增大将同为28周龄、由相同亲本繁殖的转基因小鼠通过脊柱分离处死，随后在用镊子夹住的同时用剪刀部分分离其外皮层。剥去外皮层以后，再剥去内皮以暴露出附睾脂垫，随后将其与野生型FVB/N小鼠的附睾脂垫比较大小。此后，同时从转基因小鼠和野生型小鼠中取出全部脂肪组织以比较它们之间的总重量。测量体重后不久，在福尔马林中固定被分离的全部脂肪组织并将其快速冷却。使用切片机，在-20℃将冷冻的脂肪组织切成10μm的厚度，使用苏木精和曙红染色以使其在显微镜下可见。
显微镜观察结果见图4。如图4a所示，出生26周以后，杂合的转基因小鼠比对照小鼠生长得更大。如图4b所示，经磨损后观察，发现转基因小鼠的背部比对照小鼠具有大且多的表皮肥大细胞。另外，鉴定出转基因小鼠具有明显较大的附睾脂垫。如图4c所示，经过进一步解剖，测量出F1杂合转基因小鼠具有比对照小鼠明显更大的附睾脂垫。如图4d所示，与对照小鼠相比，在完全去除腹部皮肤以后，转基因小鼠白细胞脂肪组织的总量有显著增加。用肉眼观察，没有发现转基因小鼠和正常小鼠的肝脏在大小和颜色上有差别。
6-2-2根据转基因小鼠IDPc基因表达的肥胖指示基因的表达水平的变化为了检验IDPc基因是否对肥胖指示基因的表达有影响，定量地如下测定每个肥胖指示基因的表达水平具体地说，将从每只IDPc基因转基因小鼠和正常小鼠中取出的1g附睾脂垫添加到9ml的胞溶溶液(4M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸(sarkosyl)，0.72％β-巯基乙醇)中并且使用匀浆器匀浆。在冰上冷却2-3分钟后，向匀浆中添加下列物质的混合物1ml的提取液(2M乙酸钠，pH4.0)、和10ml DEPC-水饱和的酚、2ml氯仿-异戊醇(24∶1)，并将其置于冰上15分钟。于4℃在3,000xg下将溶液离心15分钟，而后用苯酚/氯仿再次抽提上清液。将等体积的异丙醇加入提取物，随后离心15分钟以得到RNA沉淀。在用36％甲醛水溶液将其溶解后，在电场中、在含有6.7％甲醛的1％的琼脂糖凝胶中分离该RNA。电泳过后，将分离的RNA带转移到20×SSC溶液中的尼龙膜上，干燥并用UV交联。将尼龙膜在6×SSC溶液中清洗5分钟并随后在合适量的杂交溶液(50％甲酰胺，6x SSC，5x Denhardt′s溶液，1.2％SDS，10μg/ml鲑精DNA)中在42℃预杂交2小时。为了将它们用作RNA印迹的探针，用[α-32p]dCTP标记各种肥胖指示基因的cDNAs(dP2，补体因子D，LPL(脂蛋白脂肪酶)，瘦素，肿瘤坏死因子α[TNFα]，和PPARγ)。使用这些放射标记的探针实施杂交12个小时。杂交完成后，在65℃用含有0.1％SDS的6×SSC溶液清洗尼龙膜30分钟并随后用含有0.1％SDS的2×SSC清洗20分钟，并以上述的相同方法至少再清洗一次。最后，用0.2×SSC溶液在室温下将该尼龙膜清洗两次。将膜在-70℃下暴露于X射线胶片得到反射自显影照片，此照片可以鉴定转录自附睾脂垫中肥胖指示基因的mRNAs。
图5显示了杂交结果的放射自显影照片。从这些照片中可以看出，发现了被引入转基因小鼠中的重组IDPc基因的表达，以及内源性IDPc基因的表达，这证实总IDPc活性被增加。另外，发现肥胖指示基因表达的增加，肥胖指示基因例如aP2，补体因子D，LPL，瘦素，TNF-α，和过氧化物酶体增殖子活化受体γ(PPARγ)，已知这些基因优先在肥大细胞的分化中增加表达。即，因IDPc基因表达而引起的IDPc活性增加，显示出刺激了所有肥胖指示基因的表达。如图2b所示，这些结果显示NADPH涉及了肥胖指示基因的表达。
近来有报道描述了PPARγ的正反馈机制，其中PPARγ的活化进一步刺激了其基因的表达(Kim，J.B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，95，4333-4337，1998)，还有报道涉及多不饱和脂肪酸和脂类衍生物作为配体活化PPARγ的功能，根据上述这些报道，可以将上述的结果解释为归因于细胞IDPc活性增加的NADPH细胞水平的增加，刺激了独立地需要NADPH用于其酶反应的脂肪酸合成酶的活性，从而升高了脂肪酸的细胞水平。另外，有报道显示因NADPH供应不足而导致的增加的脂肪酸衍生物的细胞水平，引起PPARγ的活化，PPARγ作为主转录因子，不但负责肥大细胞分化所必需的脂肪酸的合成，而且负责涉及胆固醇生物合成的蛋白编码基因的合成，据信肥胖指示基因如编码ap2，补体因子D，LPL，瘦素，和TNFα的表达增加，归因于PPARγ基因表达的增加。因此，可以得出这样的结论，归因于IDPc基因活跃表达的IDPc活性增加和伴随的NADPH水平增加，引起PPARγ基因表达的急速增加，这对脂肪细胞的分化和脂类的生物合成都是不可或缺的。
6-2-3根据在转基因动物中IDPc表达的重量增加和脂类与胆固醇在细胞内水平的增加和对其的生化检验比较出生26周后的肥胖转基因小鼠F1与正常小鼠的细胞内脂类沉积。
1.体重的测量将适合用于容纳小鼠的容器放置在天平上，随后将天平调零，而后将小鼠小心地放置于容器中。因为每当小鼠移动时天平的读数发生变化，所以将小鼠不移动时的所测定的重量数值设定为小鼠的体重。
2.IDPc酶活性的确定在缓冲液(0.32M蔗糖，0.01M Tris-Cl pH7.4)中匀浆取自转基因小鼠和正常小鼠的肝脏和脂肪组织，并在3,000xg下离心15分钟。作为上清液得到了纯胞浆部分。通过测量维持于25℃的缓冲液(50mM MOPS，pH7.2，35.5mM三乙醇胺，pH7.2，2mM NADP+，2mMMgCl2，5mM异柠檬酸，和1μg/ml鱼藤酮)中的NADPH产量的变化来确定IDPc的酶活性。使用分光光度计，在340nm处测量2分钟以定量由包含在细胞质蛋白中的IDPc所产生的NADPH，从而确定IDPc的酶活性。对于酶的定量，将在一分钟内可以产生1μM NADPH的量定义为1单位。
3.[NADPH]/[NADPH+NADP+]的测量NADPH的定量基于这样的原理NADPH与MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑反应并伴随有颜色变化。制备两种含有100μg蛋白的胞浆提取物一种经过在60℃反应30分钟并冷却到0℃的预处理，以降解所有的NADP+来测量预先存在的NADPH[NADPH](样品1)的量；另一种未经预处理储存在0℃下，并用于测量总NADP库[NADPH+NADP+](样品2)。将两种样品中的每一种加入到反应溶液(0.1MTris-HCl缓冲液，pH8.0，5mM EDTA，2mM吩嗪乙硫酸盐(phenazine ethosulfate)，0.5mM MTT)中，随后向该溶液中添加1.3个单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶并在37℃温育5分钟以从存在于反应溶液中的全部NADP+转换NADPH。就此，以1mM的量将葡萄糖-6-磷酸盐加入到每种样品(样品1和2)中，但不加到对照样品中。反应完成后，测量因与MTT进行反应而引起的、在570nm处吸光度的改变，以定量NADPH。由于在样品1和2中检测到的吸光度变化分别归因于[NADPH]和[NADPH+NADP+]，所以可以确定NADPH对总NADP库([NADPH]/[NADP+]+[NADPH])的比率。
4.血液水平甘油三酯和总胆固醇的定量为了测量血液水平的甘油三酯和总胆固醇，使用由AsanPharmaceutics.Co.Ltd制造的分析试剂盒。用抗凝血剂处理取自转基因小鼠和正常小鼠的血样，并离心该血样以获得血清。将10μl的每种血清与1.5ml的甘油三酯分析试剂盒[10800U脂蛋白酶，5.4U甘油激酶，135,000U过氧化物酶，和160U L-α-甘油磷酸氧化酶在72ml N，N-二(2-羟乙基)-2-氨基甲烷磺酸缓冲液中的溶液]或者1.5ml的胆固醇酶分析试剂盒(百分比为1∶1的酶溶液(20.5KU/l胆固醇酯酶，10.7KU/l胆固醇氧化酶，和1.81g/l氢氧化钠)和缓冲液(13.6g/l单磷酸钾，1.88g/l苯酚)的混合物)混合，并且在37℃温育5min用于反应。在微量反应板读出器中，在500nm处测量胆固醇的吸光度、在540nm处测量甘油三酯的吸光度，以定量甘油三酯和总胆固醇的血液水平。通过利用标准曲线来对甘油三酯和胆固醇进行定量，此标准曲线是通过将上述已知的各种标准溶液浓度应用于上述步骤得到的。
5.血液水平甘油三酯和总胆固醇的定量同时从转基因小鼠和正常小鼠中取出预定量的肝脏，并将其在1ml的CIAA(氯仿∶异戊醇＝2∶1 v/v)中匀浆。把100μl的匀浆溶解在200μl的无水乙醇中，并与500μl的用于甘油三酯和胆固醇的、由Asan Pharmaceutics，Co.Ltd.，制造的、含有0.5％Triton X-100和3mM胆酸钠的每个分析试剂盒混合，随后将其在37℃下温育10分钟。在被加入800μl水之后，在微量反应板读出器的帮助下，以与上述相同的方法测量样品的肝脏甘油三酯和总胆固醇水平。同样，可以将上面的步骤用于各种已知浓度的标准溶液以获得标准曲线，此标准曲线可以用来确定肝脏中的甘油三酯和胆固醇水平。
6.血液瘦素水平的定量在2-8℃过夜凝固后，将取自转基因小鼠和正常小鼠中的血液在53,000xg下离心20min以分离血清。将该血清冷冻在-20℃直到用于瘦素的浓度测量。根据生产厂商的说明书、通过使用ELISA试剂盒(小鼠瘦素[OB]比色试剂盒，R&D Systems)来确定血液瘦素水平。开始，将50μl的血清与等体积的2.5N乙酸/10M尿素混合，将该混合物在室温静置10分钟。为了中和，将50μl的2.7N NaOH/1M HEPES加入到该混合物。在浓度测量前，用标定稀释剂(RD5-3)把所得到的样品混合物稀释到1/20。将50μl的分析稀释剂(RD1W)加入到96孔板的每个孔中，随后加入50μl的血清样品或者50μl的对照材料。将所得到的溶液在每个孔中充分混合1分钟并在室温下温育2小时以进行反应。去除每个孔中的液体以后，用清洗缓冲液将每个孔清洗4-5遍。将每个孔中的残留物在室温下与100μl的小鼠瘦素共扼物反应2小时并再次清洗4-5遍。在30分钟内，通过在微量反应板读出器中测定在450nm处的吸光度来定量血液瘦素水平。
分析并将在实施例6-2-3中得到的测量结果图解在图6中。如图6a所示，饲养26周后，经测量发现转基因小鼠(Tg)比正常小鼠(Non-Tg)的体重高23-35％。另外，如图6c所示，发现在转基因小鼠肝脏和脂肪组织中的IDPc活性，分别比正常小鼠高1.4和2.7倍。图6d比较了转基因小鼠与正常小鼠的脂肪组织与肝脏之间的、NADPH对总NADP库([NADPH]/[NADP+]+[NADPH])的比率。相对于正常小鼠，转基因小鼠肝脏和脂肪组织中的浓度比率分别增加了1.2和1.3倍。发现附睾脂垫的重量有很大增加。如图6e所示，测量到的转基因小鼠的附睾脂垫要比正常小鼠的附睾脂垫重13.6倍。但是如图6b所示，没有发现正常小鼠与转基因小鼠的肝脏重量有明显差别。对于甘油三酯和胆固醇，如图6f所示，与正常小鼠相比，转基因小鼠中甘油三酯和总胆固醇的血液水平分别高了1.8和2.4倍。类似的，如图6g所示，与正常小鼠相比，转基因小鼠重的甘油三酯和总胆固醇的在肝脏中的水平分别高了1.8和2.4倍。图6h显示了瘦素的血液水平，瘦素是一种主要由肥大细胞产生的蛋白质，它的血液水平在转基因小鼠中是正常小鼠中的2倍。
另外，在显微镜下观察取自肥胖基因转基因小鼠F1和正常小鼠的肝脏和脂肪组织。为了观察方便，将组织切成切片。如图7a所示，鉴定出转基因小鼠的肝脏是脂肪肝，其累积了比正常小鼠更多的脂肪。同样观察到转基因小鼠的脂肪细胞在大小上要比正常小鼠的脂肪细胞大5倍(图7b)。
如上所述，IDPc基因活跃表达的转基因小鼠，其重量的增大是由于身体脂肪的积累。另外，与正常小鼠相比，包括PPARγ在内的各种肥胖指示蛋白的细胞水平在转基因小鼠脂肪组织中显著上升，所述的PPARγ是一种促进编码酶基因表达的转录因子，这些酶涉及脂类和胆固醇的物质代谢。因此，IDPc基因表达增加主要引起产生较高量的、脂肪酸生物合成所必需的NADPH，并允许所得到的丰富的脂类衍生物诱导PPARγ基因表达，PPARγ基因表达依次又活化肥胖指示基因的表达，并最后导致IDPc转基因小鼠的肥胖。
实施例7异柠檬酸脱氢酶抑制剂的筛选为了选择能够调控异柠檬酸脱氢酶活性的物质，进行下列操作程序。
均以10×的浓度制备分析缓冲液(50mM MOPS，pH7.2，35.5mM三乙醇胺，pH7.2，2mM NADP+，2mM MgCl2，5mM异柠檬酸，鱼藤酮1mg/ml)和测试样品。在25℃，在水晶比色皿中，在1ml的终体积中进行对此选择所必需的酶反应。为了使用，用三蒸水稀释浓缩的测试样品。分析缓冲液、酶抑制剂和异柠檬酸脱氢酶均被以10×浓度保存在低温即在冰中。
使用10×分析缓冲液和三蒸水，首先在340nm处将分光光度计调零。在水晶比色皿中加入100μl的样品和100μl 10x的分析缓冲液，并且与600μl的三蒸水混合。调零完成以后，将样品比色皿放置在分光光度计中，随后加入200μl异柠檬酸脱氢酶并用移液管使之混合。随着时间监测在340nm处的吸光度。原则上，在含有较高浓度抑制酶活性的样品的比色皿中，吸光度降低得较快。基于这一原理，分光光度测定法数据的量化能够筛选异柠檬酸脱氢酶抑制剂。
使用5种样品，即烟酸、烟碱酰胺、丁氨苯丙酮、甲基异柠檬酸和乙二酸一酰基苹果酸来测试对异柠檬酸脱氢酶的抑制活性。在前两种样品中没有发现抑制活性，而丁胺苯丙酮显示出一些抑制作用。相反，却测定出乙二酸一酰基苹果酸(图8a)和甲基异柠檬酸(图8b)对异柠檬酸脱氢酶活性具有明确的抑制活性。
实施例8异柠檬酸脱氢酶抑制剂预防肥胖的作用8-1用异柠檬酸脱氢酶抑制剂防止3T3-L1中的油沉积在用异柠檬酸脱氢酶抑制剂——甲基异柠檬酸和乙二酸一酰基苹果酸处理后，检验保持未分化的3T3-L1细胞向脂肪细胞的分化。异柠檬酸脱氢酶抑制剂对脂肪酸合成的影响可以通过使用一种油特异染料——油红O的显象来鉴定。所得到的结果提供在图9中，图9提供的照片显示了未经异柠檬酸脱氢酶抑制剂处理细胞(左边)；经乙二酸一酰基苹果酸处理的细胞(中间)；和经甲基异柠檬酸处理的细胞(右边)的油红O染色的油沉积，这些照片分别放大了100倍(上组)和200倍(下组)。从这些光学照片中可见，IDPc抑制剂在体内的脂类代谢中和降低细胞油沉积中起着重要的作用。
8-2异柠檬酸脱氢酶抑制剂对大鼠肥胖的限制性作用大鼠出生26周后，比较未经异柠檬酸脱氢酶抑制剂处理的大鼠与使用甲基异柠檬酸处理的大鼠的细胞脂类沉积。
1.体重的测量将适合用于容纳大鼠的容器放置在天平上，随后将天平调零，而后将大鼠小心地放置于容器中。因为每当大鼠移动时天平的读数发生变化，所以将大鼠不移动时的所测定的重量数值设定为大鼠的体重。
2.IDPc酶活性的确定在缓冲液(0.32M蔗糖，0.01M Tris-Cl pH7.4)中匀浆取自给予抑制剂的大鼠和未给予抑制剂的大鼠的肝脏和脂肪组织，并在3,000xg下离心10分钟。再在10,000×g下离心15分钟。作为上清液得到了纯胞浆部分。通过测量维持于25℃的缓冲液(50mM MOPS，pH7.2，35.5mM三乙醇胺，pH7.2，2mM NADP+，2mM MgCl2，5mM异柠檬酸，和1μg/ml鱼藤酮)中的NADPH生产量的变化来确定IDPc的酶活性。使用分光光度计，在340nm处测量2分钟以定量由包含在细胞质蛋白中的IDPc所产生的NADPH，从而确定IDPc的酶活性。对于酶的定量，将在一分钟内可以产生1μM NADPH的量定义为1单位。根据Bradford分析来进行蛋白质的定量。
3.血液水平甘油三酯和总胆固醇的定量为了测量血液水平的甘油三酯和总胆固醇，使用由AsanPharmaceutics.Co.Ltd制造的分析试剂盒。用抗凝血剂处理取自给予抑制剂的大鼠和未给予抑制剂的大鼠的血样，并离心该血样以获得血清。将10μl的每种血清与1.5ml的甘油三酯分析试剂盒[10800U脂蛋白酶，5.4U甘油激酶，135,000U过氧化物酶，和160U L-α-甘油磷酸氧化酶在72ml N，N-二(2-羟乙基)-2-氨基甲烷磺酸缓冲液中的溶液]或者1.5ml的胆固醇酶分析试剂盒(百分比为1∶1的酶溶液(20.5KU/l胆固醇酯酶，10.7KU/l胆固醇氧化酶，和1.81g/l氢氧化钠)和缓冲液(13.6g/l单磷酸钾，1.88g/l苯酚)的混合物)混合，并且在37℃温育5min用于反应。在微量反应板读出器中，在500nm处测量胆固醇的吸光度、在540nm处测量甘油三酯的吸光度，以定量甘油三酯和总胆固醇的血液水平。通过利用标准曲线来对甘油三酯和胆固醇进行定量，此标准曲线是通过将上述已知的各种标准溶液浓度应用于上述步骤得到的。
4.肝脏水平甘油三酯和总胆固醇的定量同时从给予抑制剂的小鼠和未给予抑制剂的小鼠中取出预定量的肝脏，并将其在1ml的CIAA(氯仿∶异戊醇＝2∶1 v/v)中匀浆。把100μl的匀浆溶解在200μl的无水乙醇中，并与500μl的用于甘油三酯和胆固醇的、由Asan Pharmaceutics，Co.Ltd.，制造的、含有0.5％Triton X-100和3mM胆酸钠的每个分析试剂盒混合，随后将其在37℃下温育10分钟。在被加入800μl水之后，在微量反应板读出器的帮助下，以与上述相同的方法测量样品的肝脏甘油三酯和总胆固醇水平。同样，可以将上面的步骤用于各种已知浓度的标准溶液以获得标准曲线，此标准曲线可以用来确定肝脏中的甘油三酯和胆固醇水平。
在实施例8-2中得到的测量结果被分析并图示在图10中。同样是10周龄的大鼠，给予抑制剂的大鼠与未给予抑制剂的大鼠之间没有发现明显的体重差异。如图10a所示，经测量发现给予抑制剂的大鼠与未给予抑制剂的大鼠相比，附睾脂垫的重量降低了大约12％，而这两种大鼠的肝脏重量没有差别。对于甘油三酯和胆固醇，如图10b所示，与未给予抑制剂的大鼠相比，给予抑制剂的大鼠中甘油三酯和总胆固醇的血液水平分降低了20％和11％。同样，动脉硬化指数降低了10。另外，如图10c所示，与未给予抑制剂的大鼠相比，给予抑制剂的大鼠中检测到的高密度脂蛋白(HDL)升高了11％，高密度脂蛋白通过胆固醇反转运(counter-transport)通路将胆固醇从组织运输到肝脏并因此帮助胆固醇的降解和释放。
如上所述，给予IDPc抑制剂的大鼠，其附睾脂垫的水平以及甘油三酯和总胆固醇的水平降低。另外，在给予IDPc抑制剂的大鼠中发现了动脉硬化指数的降低。将这些结果综合起来，说明IDPc抑制剂对动物的肥胖具有负面影响并且降低了患动脉硬化的可能性。此外，鉴定出IDPc抑制剂抑制了高胆固醇血症，因为它们增加了HDL的细胞水平，其参与胆固醇的降解和释放。
本发明揭示了IDPc基因在其体内活跃表达的转基因小鼠，其体重的增加是由于身体脂肪的累积，而且，与正常小鼠相比，包括PPARγ在内的各种肥胖指示蛋白的细胞水平在转基因小鼠脂肪组织中显著上升，所述的PPARγ是一种促进编码酶基因表达的转录因子，这些酶涉及脂类和胆固醇的物质代谢。因此，IDPc基因表达增加主要引起产生较高量的、脂肪酸生物合成所必需的NADPH，并允许所得到的丰富的脂类衍生物诱导PPARγ基因表达，PPARγ基因表达本身又活化肥胖指示基因的表达，并最后导致IDPc转基因小鼠的肥胖。
基于这些研究结果，证实了IDPc抑制剂在治疗代谢性疾病中有用。即，当将异柠檬酸脱氢酶抑制剂给予小鼠时，除了可以使这些小鼠表现出较小的附睾脂垫、较低水平的甘油三酯和总胆固醇以及较低的动脉硬化指数之外，还可以限制小鼠变肥胖。因此，异柠檬酸脱氢酶抑制剂可以抑制肥胖诱导的动脉硬化。同样，归因于IDPc抑制剂的HDL水平增加证实了在给予IDPc抑制剂的时候，总胆固醇水平的降低是由于HDL水平的增加。
工业适用性如前所述，在本发明中，我们确定IDPc基因的表达和伴随的IDPc水平的增加，引起NADPH细胞水平的增加，这样依次又引起在脂肪细胞中的脂类沉积，从而导致肥胖和脂肪肝。同时，我们还发现作为IDPc基因表达的结果，血液甘油三酯水平和总胆固醇增加。另一方面，由IDPc的基因表达抑制和伴随的IDPc水平的细胞内降低而引起的NADPH细胞水平的降低，对抑制脂肪细胞中的脂类沉积有作用。因此IDPc基因，IDPc和NADPH可以被用于合成脂类，包括脂肪酸、角鲨烯、DHA等等，并可以被用于活化PPARγ。另外，由于本发明的转基因小鼠明显地显示出肥胖、高脂血症和脂肪肝的特征，所以可以将包括IDPc在内的产生NADPH的异柠檬酸脱氢酶，和它们的基因直接用来鉴定肥胖和脂肪肝的抑制物质，以及甘油三酯和胆固醇生物合成的抑制物质。另外，通过利用异柠檬酸脱氢酶抑制剂对肥胖和甘油酯与胆固醇生物合成的影响，可以研制用于防治肥胖、高脂血症、和脂肪肝的药学上有效的物质。
已经以例证性的方式对本发明进行了描述，应该理解，所使用的术语学的目的是为了自然描述本发明而不是限制本发明。根据上述的教导，可以对本发明进行许多变体和改型。因此，应当理解，在本发明权利要求的范围内，可以除具体描述的以外实践本发明。
微生物国际保藏证明
微生物国际保藏证明
序列表序列表<110>TG生命工学株式会社，许太噒<120>异柠檬酸脱氢酶，其基因，以及其在肥胖、高脂血症、和脂肪肝治疗和在脂类生物合成中的用途<130>1fpo-02-04<160>8<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>有义引物<400>1atcgtgatgt agatagtcg19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反义引物<400>2ctagctagct ggtaccatga 20<210>3<211>2091<212>DNA<213>小鼠IDPc<220>
<221>CDS<222>(71)..(1255)<400>3gagctaactg gggccggctt attacagctt gtgtgtacgc gcgggtgtga ccgggttat60
tgaagtaaaa atg tcc aga aaa atc caa gga ggt tct gtg gtg gag atg caa 120Met Ser Arg Lys Ile Gln Gly Gly Ser Val Val Glu Met Gln1 5 10gga gat gaa atg aca cga atc att tgg gaa ttg att aag gaa aaa ctt 160Gly Asp Glu Met Thr Arg Ile Ile Trp Glu Leu Ile Lys Glu Lys Leu15 20 25 30att ctt ccc tat gtg gaa ctg gat ctg cat gca gag gct ata aag aaa 208Ile Leu Pro Tyr Val Glu Leu Asp Leu His Ala Glu Ala Ile Lys Lys35 40 45tac aac gtg ggc gtc aag tgt gct acc atc acc ccc gat gag aag agg 256Tyr Asn Val Gly Val Lys Cys Ala Thr Ile Thr Pro Asp Glu Lys Arg50 55 60gtt gaa gaa ttc aag ttg aaa caa atg tgg aaa tcc cca aat ggc acc 304Val Glu Glu Phe Lys Leu Lys Gln Met Trp Lys Ser Pro Asn Gly Thr65 70 75atc cga aac att ctg ggt ggc act gtc ttc agg gaa gct att atc tgc 352Ile Arg Asn Ile Leu Gly Gly Thr Val Phe Arg Glu Ala Ile Ile Cys80 85 90aaa aat atc ccc cgg cta gtg aca ggc tgg gta aaa ccc atc atc att 400Lys Asn Ile Pro Arg Leu Val Thr Gly Trp Val Lys Pro Ile Ile Ile95 100 105110ggc cga cat gca tat ggg gac caa tac aga gca act gat ttt gtt gtt 448Gly Arg His Ala Tyr Gly Asp Gln Tyr Arg Ala Thr Asp Phe Val Val115120 125cct ggg cct gga aaa gta gag ata acc tac aca cca aaa gat gga act 496Pro Gly Pro Gly Lys Val Glu Ile Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Gly Thr130135 140cag aag gtg aca tac atg gta cat gac ttt gaa gaa ggt ggt ggt gtt 544Gln Lys Val Thr Tyr Met Val His Asp Phe Glu Glu Gly Gly Gly Val145 150155gcc atg ggc atg tac aac cag gat aag tca att gaa gac ttt gca cac 592Ala Met Gly Met Tyr Asn Gln Asp Lys Ser Ile Glu Asp Phe Ala His160165170agt tcc ttc caa atg gct ctg tcc aag ggc tgg cct ttg tat ctc agc 640Ser Ser Phe Gln Met Ala Leu Ser Lys Gly Trp Pro Leu Tyr Leu Ser175180 185 190acc aag aac act att ctg aag aag tat gat ggg ggt ttc aaa gac atc 688
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325330335Lys Ala Leu Glu Asp Val Cys Ile Glu Thr Ile Glu Ala Gly Phe Met340 345350Thr Lys Asp Leu Ala Ala Cys Ile Lys Gly Leu Pro Asn Val Gln Arg355 360365Ser Asp Tyr Leu Asn Thr Phe Glu Phe Met Asp Lys Leu Gly Glu Asn370375380Leu Lys Ala Lys Leu Ala Gln Ala Lys Leu ***385390 395<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>5agatctcctt gactaatata ac22<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物P1<400>7ctagctacca agcacggttg 20
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<223>引物P2<400>8tcagttgctc tgtattggtc 2016
(按照条约第19条的修改)1.一种细胞株(保藏号No.KCTC 0861 BP)，该细胞株被含有巨细胞病毒启动子，新霉素基因，长末端重复序列和SEQ ID NO3的IDPc(胞质NADP+-依赖性异柠檬酸脱氢酶)基因的表达载体转化，并且它显示出提高的脂生物合成能力。
2.一种小鼠胚胎(保藏号No.KCTC 0874 BP)，它含有一种融合基因构建体，该融合基因构建体含有大鼠胞质磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的启动子、新霉素基因和SEQ ID NO；3的IDPc基因。
3.一种转基因小鼠，在其基因组中含有一种融合基因构建体，该融合基因构建体含有大鼠胞质磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的启动子、新霉素基因和SEQ ID NO；3的IDPc基因，并且它显示出诸如肥胖，高脂血症或脂肪肝的代谢疾病。
4.一种通过施用IDPc，IDPc基因或NADPH提高过氧化物酶体增殖子活化受体γ(PPARγ)活性的方法，其中，NADPH是一种IDPc酶反应的产物。
5.一种通过施用IDPc或IDPc基因用于提高脂类、例如甘油三脂、胆固醇或者角鲨烯生物合成的方法。
6.一种通过添加作为IDPc酶反应产物的NADPH体内提高脂类、例如甘油三脂、胆固醇或者角鲨烯生物合成的方法。
7.一种使用IDPc筛选抑制脂肪沉积或甘油三脂和胆固醇产生的抑制剂的方法，其中，该抑制剂与IDPc反应，降低该酶的活性，然后降低作为IDPc酶反应产物的NADPH的细胞水平。
8.一种使用IDPc基因筛选抑制脂肪沉积或甘油三脂和胆固醇产生的抑制剂的方法，其中，该抑制剂与IDPc基因相关联，抑制该基因的表达，然后降低作为IDPc酶反应产物的NADPH的细胞水平。
9.一种体内筛选IDPc活性的调控物质的方法，包含将未知物质加入到培养液中的步骤，所述的培养液含有被IDPc基因转化的权利要求1的动物细胞系。
10.一种通过给予IDPc的抑制剂来治疗代谢性疾病的方法，其中该抑制剂能够与IDPc反应以降低该酶的活性，而且所述的代谢性疾病是肥胖、高脂血症和脂肪肝。
11.一种通过给予IDPc基因的抑制剂来治疗代谢性疾病的方法，其中该抑制剂抑制IDPc基因的表达，而且所述的代谢性疾病是肥胖、高脂血症和脂肪肝。
权利要求
1.用于催化NADPH产生的异柠檬酸脱氢酶，其在脂肪酸与胆固醇的生物合成和脂肪沉积中有用。
2.根据权利要求1的异柠檬酸脱氢酶，其中的异柠檬酸脱氢酶具有由No.4序列代表的小鼠源氨基酸序列。
3.一种基因，其具有由No.3序列代表的碱基序列，其编码权利要求1的异柠檬酸脱氢酶。
4.一种融和基因构建体，其包含以有义方向插入其中的权利要求3的基因。
5.一种融和基因构建体，其包含以反义方向插入其中的权利要求3的基因。
6.一种细胞株(保藏号No.KCTC 0861 BP)，其被权利要求4的融和基因构建体所转化。
7.一种融和基因构建体，其基于图3的基因图谱，其具有权利要求3的基因，其中将该基因以有义方向插入在大鼠胞质磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因启动子的下游。
8.一种胚胎(保藏号No.KCTC 0874 BP)，其含有权利要求7的融和基因构建体。
9.一种转基因动物，在其基因组中容纳有权利要求7的融和基因构建体。
10.根据权利要求9的转基因动物，其中所述的动物是小鼠。
11.一种促进NADPH生物合成的制剂，其包含权利要求1的异柠檬酸脱氢酶或者权利要求3的基因作为有效组分。
12.一种激活过氧化物酶体增殖子活化受体γ(PPARγ)活性的制剂，其包含权利要求1的异柠檬酸脱氢酶、权利要求3的基因、或者这些基因的产物NADPH作为有效组分。
13.一种用于促进脂类、角鲨烯或者胆固醇生物合成的制剂，其包含权利要求1的异柠檬酸脱氢酶或者权利要求3的基因。
14.用于防治肥胖、高脂血症、或者脂肪肝的制剂，其包含权利要求3的基因作为治疗学上的活性组分。
15.NADPH在促进甘油三酯、胆固醇、和角鲨烯生物合成上的用途。
16.一种用于促进甘油三酯、胆固醇、和角鲨烯生物合成的方法，其中在体内加入权利要求1的异柠檬酸脱氢酶的产物NADPH。
17.一种用于筛选对脂肪沉积和甘油三酯与胆固醇产生的抑制剂的方法，其中利用该抑制剂与异柠檬酸脱氢酶反应的能力来降低该异柠檬酸脱氢酶的酶活性，从而降低NADPH的细胞水平。
18.一种用于筛选对脂肪沉积和甘油三酯与胆固醇产生的抑制剂的方法，其中利用该抑制剂与编码异柠檬酸脱氢酶基因相关联的能力来抑制该基因的表达，从而降低NADPH的细胞水平。
19.一种体外筛选调控异柠檬酸脱氢酶活性的物质的方法，其中利用该物质抑制NADPH在酶促反应系统中产生的能力，所述的酶促反应系统含有异柠檬酸脱氢酶、作为酶底物的异柠檬酸，和作为辅酶的NADP+。
20.一种体内筛选调控异柠檬酸脱氢酶活性的物质的方法，其中利用该物质抑制NADPH在培养基中的产生的能力，所述的培养基含有被编码异柠檬酸脱氢酶的基因转化的动物细胞系。
21.一种体内筛选调控异柠檬酸脱氢酶活性的物质的方法，其中利用该物质抑制NADPH在动物中的产生的能力，所述的动物在其基因组中容纳有异柠檬酸脱氢酶基因。
22.一种用于治疗代谢性疾病的方法，其中将能够与异柠檬酸脱氢酶反应以降低酶活性的物质用作治疗剂，而且所述的代谢性疾病是肥胖、高脂血症和脂肪肝。
23.一种用于治疗代谢性疾病的方法，其中将能够与编码异柠檬酸脱氢酶的基因相关联以抑制酶活性的物质用作治疗剂，而且所述的代谢性疾病是肥胖、高脂血症和脂肪肝。
全文摘要
本发明涉及一种异柠檬酸脱氢酶，其基因，以及其在肥胖、高脂血症、和脂肪肝治疗中的用途。IDPc基因的表达和伴随的IDPc水平的增加，引起NADPH的细胞水平的增加，这样导致脂类沉积在脂肪细胞中而引起肥胖和脂肪肝。因IDPC的基因表达抑制而引起的NADPH在细胞水平的降低，对抑制脂类在脂肪细胞中沉积具有作用。另外，通过利用异柠檬酸脱氢酶抑制剂的压制或者抑制作用，可以研制防治肥胖、高脂血症和脂肪肝的药学上有效的物质。
文档编号A61K45/00GK1524122SQ01817492
公开日2004年8月25日 申请日期2001年7月26日 优先权日2000年10月20日
发明者许太辚, 高豪振, 崔明淑, 郑运珠 申请人:Tg生命工学株式会社, 许太辚