抗原特异细胞毒性t细胞的扩大培养方法

专利名称：抗原特异细胞毒性t细胞的扩大培养方法
技术领域：
本发明涉及在医疗领域非常有用的、对具有抗原特异的细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞进行诱导、维持以及扩大培养的方法。
T细胞被亚分类为辅助T细胞(以下称TH)和细胞毒性T细胞[也称Tc；细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte)、杀伤性T细胞。以下有时称CTL]，TH具有CD(Cluster Designation)4标记、主要参与抗体产生的协助和各种免疫应答的诱导，CTL具有CD8标记、主要显示细胞毒性。在识别、破坏以及除去肿瘤细胞和病毒感染细胞等中发挥最主要作用的CTL，并不是象B细胞那样产生对抗原具有特异反应的抗体，而是直接识别源于与存在于靶细胞膜表面的主要组织相容性抗原复合体(MHC对人而言，也有时称为人白血球抗原(HLA))ClassI分子会合的靶细胞的抗原(抗原性肽)而发挥作用。此时，CTL膜表面的T细胞受体(以下称TCR)特异识别前述的抗原性肽和MHCClassI分子，判断出抗原性肽是否源于自己。而且，通过CTL特异地破坏、除去经判断并非来源自己的靶细胞。
近年来，人们对诸如药物疗法、放射疗法等患者身体负担过重的治疗法进行了重新考虑，越来越关心对患者身体负担较轻的免疫治疗法。人们特别关注的是，在生物体外(in vitro)由源于免疫机能正常的人的CTL或T细胞诱导出对抗原有特异反应的CTL后，移入到患者体内的继承免疫疗法的有效性。例如，有使用动物模型的继承免疫疗法，其对病毒感染和肿瘤很有效[Greenberg，P.D.著、Advances inImmunology、1992年出版]，此外还有，通过对免疫缺陷的患者给药CTL，重新构筑不显示毒性的、快速且持续地排出巨细胞病毒的特异的CTL应答[Blood、第78卷、第1373～1380页(1991)]等，而引起人们对其用于先天性、后天性以及医原性T细胞免疫缺陷症患者的关注。此疗法中很重要的是，在维持或增强CTL的抗原特异的毒性的状态下维持和增加其细胞。
此外，对于CTL的细胞数的维持和增加来说，由对动物模型的研究推测人的继承免疫疗法中的有效细胞数，则发现必需109～1010个抗原特异T细胞[greenberg著，Advances in Immunology，1992年出版]。也就是说，继承免疫疗法中最大的问题是短时间内在体外获得这样的细胞数。
对于CTL的抗原特异杀伤活性的维持和增强来说，通常的方法是，在诱导对CTL的抗原特异应答时，反复进行使用目的抗原的刺激。但是这种方法中，有时细胞数会突然增加，而最终细胞数减少，得不到必需的细胞数。目前对此的应对方法只能是，在反复进行由抗原引起的刺激的初期阶段时冻结保存细胞，或者将进行克隆繁殖而得到的抗原特异CTL克隆的一部分进行冻结保存，然后通过长期培养使细胞数和抗原特异毒性降低，此时再使冻结了的细胞融解，再次重复抗原刺激。
虽然也有人报道了使用小鼠T细胞通过长期培养来建立T细胞的方法[Nature、第294卷、第697～699页(1981)]，但是这种方法是对T细胞进行离析·株化的方法，使用此方法不可能将T细胞增殖到109～1010个细胞。还有，在美国专利第5,057,423号中，公开了大量使用高浓度白介素2(IL-2)诱导淋巴因子活性化杀伤(LAK)细胞，3～4天内使细胞数增加到100的方法。如果考虑到通常1个细胞分裂增殖为两个需要24个小时，则此方法提供了飞跃增加的细胞数。此外还尝试，同样使用高浓度的IL-2诱导肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，进行继承免疫疗法[New Engl.J.Med.、第316卷、第1310～1321(1986)；New Engl.J.Med.、第319卷、第1676～1680页(1988)；Blood、第81卷、第2093～2101页(1993)]。但是前种方法是取得对抗原非特异性的T细胞的方法，而后种方法尽管由于使用了活化的多克隆淋巴细胞团而具有了特异性，但也只是一点点。此外，在上述方法中，为了促进细胞增殖都使用了高浓度的IL-2，有报告指出，经高浓度的IL-2处理的T细胞在没有IL-2存在下接受特异抗原刺激时有可能引起编程性细胞死亡[Nature、第353页、第858～861页(1991)；(Eur.J.Immunol)、第23卷。第1552～1560页(1992)]，由此报告可见，在由上述方法得到的LAK细胞和TIL的有效性方面存在问题。
此外，将T细胞和T细胞增殖因子在IL-2存在下以低密度(5×103～1×104个/ml)进行培养，经过7天后急速增殖，最终细胞数增殖达到饱和密度3～5×105个/ml。不过，也有报告指出，一旦到达此饱和密度，细胞常常会死亡。[Immunological Rev.、第54卷、第81～109页(1981)]。因此，以LAK细胞、TIL以及低密度培养T细胞方法，无论在实用方面还是在有效方面都存在问题。
此外，关于抗原特异CTL，曾经报道过如下方法，将同系异种来源的巨细胞病毒(CMV)特异CTL体外培养5～12周，使CTL增殖后，对免疫缺陷的患者静脉给药的继承免疫疗法(Riddell等，Science，257238～240，1992)，使用自体CMV感染成纤维细胞和IL-2[J.Immunology、第146卷、第2795～2804页(1991)]以及使用抗CD3单克隆抗体(抗CD3mAb)和IL-2[J.Imm.Methods、第128卷、第189～201页(1990)]离析出CMV特异CTL克隆并大量培养的方法。可是这些方法存在很大的问题。即，得到1×109个/ml抗原特异CTL需要大约3个月，由于这期间患者的病情还在进行，所以对症治疗比较困难。
为了解决这样的问题，国际公开第96/06929号文本公开了REM法(快速增殖法，rapid expansion method)。此REM法是使含有抗原特异CTL和TH的T细胞初期团块在短时间内增殖(expand)。总之，其特征是增殖各个T细胞克隆从而可以得到大量的T细胞，但是其还存在以下的问题。REM法中，使用抗CD3抗体、IL-2以及由放射线照射而失去增殖性的PBMC(外周血单核细胞)和非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)感染细胞使抗原特异CTL数增殖，但是还存在以下的问题，即，这无法否定EBV转化B细胞(EBV-B细胞)混入T细胞的危险性(安全性问题)，还有需要大量的PBMC(必需的抗原特异CTL数目的至少约40倍的PBMC)作为饲养细胞，增殖了的CTL抗原特异细胞毒性并未充分满足，使用T细胞克隆以外的T细胞团增殖时，T细胞所具有的抗原特异毒性随细胞的增殖而降低等问题。
也就是说，以往的抗原特异CTL调制方法中，对于在短时间内且充分量地调制用于治疗的具有抗原特异细胞毒性的CTL的继承免疫疗法，目前尚有很多必不可少的问题没有解决。
本发明旨在提供适用于继承免疫疗法的诱导、维持以及扩大培养保持高水平抗原特异细胞毒性的CTL的方法。

发明内容
本发明涉及(l)诱导具有抗原特异的细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，包含在选自酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖以及它们的盐中的至少1种化合物的存在下，将具有细胞毒性T细胞分化能力的前体细胞和抗原呈递细胞孵育的工序。(2)前述(1)所述的方法，其中化合物为选自岩藻依聚糖、肝素、褐藻酸、硫酸化软骨素A、硫酸化软骨素B、果胶酸、透明质酸、岩藻依聚糖分解物、硫酸化葡萄糖、硫酸化岩藻糖以及它们的盐中的至少一种化合物。(3)维持具有抗原特异的细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，包含在选自酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖以及它们的盐中的至少1种化合物的存在下，继续培养细胞毒性T细胞的工序。(4)前述(3)所述的方法，其中化合物为选自岩藻依聚糖、肝素、褐藻酸、硫酸化软骨素A、硫酸化软骨素B、果胶酸、透明质酸、岩藻依聚糖分解物、硫酸化葡萄糖、硫酸化岩藻糖以及它们的盐中的至少一种化合物。(5)扩大培养具有抗原特异的细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，包含在选自酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖以及它们的盐中的至少1种化合物的存在下，对细胞毒性T细胞进行孵育的工序。(6)前述(5)的方法，其中，所述工序中进一步在抗CD3抗体的存在下孵育细胞毒性T细胞。(7)前述(5)或(6)的方法，其中，所述工序中将细胞毒性T细胞与饲养细胞一起孵育。(8)前述(7)的方法，其中饲养细胞为非病毒感染细胞。(9)前述(5)～(8)任一的方法，其中化合物为选自岩藻依聚糖、肝素、褐藻酸、硫酸化软骨素A、硫酸化软骨素B、果胶酸、透明质酸、岩藻依聚糖分解物、硫酸化葡萄糖、硫酸化岩藻糖以及它们的盐中的至少一种化合物。(10)回收细胞毒性T细胞的方法，其包含从前述(1)～(9)任一的方法得到的含细胞毒性T细胞的培养物中选择出具有抗原特异的细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞含量高的细胞团的工序。(11)用前述(1)～(10)中任一所述的方法调制的具有抗原特异的细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞。(12)治疗剂，其特征在于，含有前述(11)所述的细胞毒性T细胞作为有效成分。
发明的最佳实施方式本发明意外地发现，选自酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖以及它们的盐中的至少一种化合物可以发挥维持或增强(以下有时称为作用于)CTL抗原特异细胞杀伤活性的能力，从而完成了本发明。本发明中，使用前述化合物作为有效成分，提供适用于继承免疫疗法的、诱导、维持以及扩大培养保持高水平抗原特异细胞杀伤活性的CTL的方法。作为本发明有效成分使用的化合物有D体和L体时，两者都可使用，不过优选使用L体。
以下具体说明本发明。(1)本发明的细胞毒性T细胞诱导方法通常已知，经抗原呈递细胞诱导的CTL，在维持、增殖期间其抗原特异细胞杀伤活性会降低。本发明提供的抗原特异CTL诱导方法，诱导后的细胞即使经过长时间的维持或增殖，以往观察到的抗原特异细胞杀伤活性显著降低也不会发生。
本发明的CTL诱导方法，其一大特征在于，在前述有效成分存在下诱导CTL。为了在适当有效成分的存在下，使所得CTL具有识别所希望的抗原能力，CTL诱导是通过将具有CTL分化能力的前体细胞和适当的抗原呈递细胞一起孵育来实施的。在成为CTL的前期阶段，前体细胞只要是起到分化CTL作用的细胞即可，没有特别的限制，例如可举出，外周血单核细胞(PBMC)、原初T细胞、记忆T细胞等。抗原呈递细胞只要是具有向T细胞呈递应识别抗原的能力的细胞即可，没有特别的限制。例如本发明中可以使用单核细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞等呈递所希望的抗原。
抗原呈递细胞可以通过如此调制，即，将抗原肽附着于具有抗原呈递能力的细胞，抗原肽呈递在其表面[例如参见文献Bednarek M.A.等、J.Immunology 147 P4047～4053(1991)]。此外，当具有抗原呈递能力的细胞具有加工(process)抗原能力时，由于对此细胞附着抗原，抗原进入细胞内接受加工，断裂的抗原肽呈递在细胞表面。此外，向具有抗原呈递能力的细胞附着抗原肽时，使用与所使用的抗原呈递细胞、待诱导的CTL的HLA限制性相匹配的抗原肽。
还有，本发明中使用的抗原没有特别的限制，例如可举出细菌、病毒等外来性抗原或肿瘤关联抗原(癌抗原)等内源性抗原等。
本发明中，抗原呈递细胞优选为非增殖性。为了使细胞为非增殖性，例如可以使用X射线等放射线照射或丝裂霉素(mitomycin)等药物进行处理。
本发明CTL诱导方法中使用的培养基没有特别的限定，可以使用将CTL、其前体细胞以及抗原呈递细胞的维持、生长发育所必需的成分混合所制成的公知的培养基，例如可以使用市售的培养基。这些培养基除了其原有的构成组分外，还可含有适当的蛋白质、细胞因子类、其它成分。本发明优选使用含有白介素-2(IL-2)的培养基。
作为本发明有效成分使用的酸性多糖，可以使用源于动物、植物、微生物、藻类以及合成的酸性多糖中的任一种。此外，本发明的酸性多糖还包括磷酸化多糖类，例如核酸。
源于动物的酸性多糖例如可以使用，透明质酸或各种硫酸化多糖，作为硫酸化多糖可以使用硫酸化软骨素、硫酸化角质素、硫酸化皮肤素、硫酸化类肝素、肝素等。此外本发明还可使用源于海参、海胆、海星等棘皮动物的硫酸化多糖、源于软骨鲨目等鱼类的硫酸化多糖。作为含有硫酸化多糖的海参，例如有特开平4-91027号公报中所述的海参，可以按此公报中提供的方法由海参调制硫酸化多糖。
源于植物的酸性多糖，例如可使用果胶酸。
源于微生物的酸性多糖，例如可使用透明质酸或呫吨。
源于藻类的酸性多糖，例如可使用源于褐藻类、红藻类、绿藻类、蓝藻类的酸性多糖。
源于褐藻类的酸性多糖，例如可使用各种硫酸化多糖，例如岩藻依聚糖、硫酸化岩藻半乳聚糖、硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖、葡糖醛酸木岩藻聚糖(グルクロノキシロフカン)、马尾藻聚糖、葡糖醛酸甘露半乳聚糖、木岩藻葡糖醛酸聚糖(キシロフコグルクロナン)、囊叶藻聚糖(ァスコフィラン)、葡糖醛酸半乳岩藻聚糖、硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖等。
作为原料的褐藻类可举出，例如伽高迈海带、日本海带(マコンブ)、托罗罗海带(トロロ昆布)、岩藻、海蕴、冲绳海蕴、裙带菜、黑藻、羽叶藻、翅藻、巨藻黑、泡叶藻、巨型海草(ジャィァントケルプ)等海带目、索藻目、岩藻目的褐藻。
源于褐藻类的硫酸化多糖，例如由伽高迈海带调制岩藻依聚糖，可以将此岩藻依聚糖分离为含有葡糖醛酸的岩藻依聚糖(称为U-岩藻依聚糖)和不含葡糖醛酸的岩藻依聚糖(称为F-岩藻依聚糖)，可以分别使用这些岩藻依聚糖作为本发明的有效成分。此外，本发明中还可以使用由伽高迈海带调制的硫酸化岩藻半乳聚糖(以下称G-岩藻依聚糖)。
由伽高迈海带调制得到岩藻依聚糖以后，使用阴离子交换树脂、表面活性剂等分离出U-岩藻依聚糖和F-岩藻依聚糖。源于伽高迈海带的U-岩藻依聚糖和F-岩藻依聚糖之比为1∶2，U-岩藻依聚糖含有岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡糖醛酸等，硫酸含量约为20％，F-岩藻依聚糖含有岩藻糖和半乳糖，硫酸含量约为50％，两种物质的分子量均以约20万为中心分布(第18次糖质讨论会内容集、第159页、1996年)。
例如，将由伽高迈海带调制的岩藻依聚糖溶液经过DEAE-セルトファィンA-800柱后，用含有NaCl的缓冲液、由浓度梯度法进行洗脱，由此可以分离得到U-岩藻依聚糖和F-岩藻依聚糖。

图1表示了其中一例。即，图1表示了U-岩藻依聚糖与F-岩藻依聚糖的分离，图中前面的峰为U-岩藻依聚糖，后面的峰为F-岩藻依聚糖。
源于红藻类的酸性多糖，可以使用例如硫酸化半乳聚糖、角叉菜胶、海萝聚糖、琼脂胶等。此外，本发明还可使用源于红藻类的琼脂类、琼脂糖。
红藻类可举出，例如饲草(マクサ)、青丝菜、鸡毛菜等。
源于绿藻类的酸性多糖，例如可使用硫酸化鼠李聚糖。绿藻类可举出，石莼、浒苔、伞藻、小球藻等。此外，本发明中还可使用由螺旋藻等蓝藻类得到的酸性多糖。
本发明中，可以直接将褐藻酸、果胶酸、透明质酸等用作本发明的有效成分酸性多糖，也可以使用它们加成了例如硫酸基后所形成的合成酸性多糖。此合成酸性多糖例如可举出，合成硫酸化多糖，可以使用纤维素、淀粉、甘露聚糖、木聚糖、褐藻酸、果胶、果胶酸、透明质酸、果聚糖、阿拉伯糖胶、壳多糖、茁霉多糖(プルラン)、木葡聚糖、葡聚糖、淀粉等的硫酸化物。还可以使用，硫酸化呋喃核聚糖(リボフラナン硫酸化)、硫酸化呋喃木聚糖、硫酸化香菇聚糖、硫酸化凝胶多糖、硫酸化吡喃甘露聚糖、硫酸化淀粉、硫酸化果胶等合成硫酸化多糖和具有十六烷酰基的硫酸化呋喃核聚糖等合成硫酸化烷基多糖。此外，还可以将硫酸化多糖进一步硫酸化，调制成高硫酸化硫酸化多糖，作为合成酸性多糖在本发明中使用。这些合成酸性多糖可以分别按公知方法调制，在本发明中使用。此外，本发明中还可使用市售的硫酸化葡聚糖、硫酸化纤维素。此外本发明还可以使用这些合成酸性多糖的盐。
这些酸性多糖可以按各自公知的方法调制，本发明中可使用精制物或含有此酸性多糖的物质等。作为含酸性多糖物质，例如优选使用源于藻类的酸性多糖级分，藻类则优选使用前述藻类作为原料。
此外，如果这些酸性多糖分解所得的低分子化酸性多糖对细胞毒性T细胞的抗原特异细胞杀伤活性也具有维持或增强能力，则也可用作本发明的酸性多糖。
作为可用于本发明的酸性寡糖、酸性单糖，只要是对细胞毒性T细胞的抗原特异细胞杀伤活性也具有维持或增强能力的酸性寡糖、酸性单糖即可，没有特别的限制，可以使用前面列举的酸性多糖的分解物、合成酸性寡糖和合成酸性单糖。作为酸性寡糖、酸性单糖，例如可举出硫酸化寡糖和硫酸化单糖。这些硫酸化寡糖、硫酸化单糖的调制可以以分别对应的寡糖、单糖为原料、按公知的方法进行硫酸化。还有，使用它们的盐也是很理想的。另外，本发明中的酸性单糖例如可举出，硫酸化岩藻糖、硫酸化葡萄糖、硫酸化半乳糖、硫酸化木糖、硫酸化2-脱氧-葡萄糖、硫酸化甘露糖、硫酸化塔罗糖等硫酸化单糖。这些硫酸化单糖可以用合成法合成，也可以将由天然物中得到的硫酸化多糖分解，由此分解物中精制而调制得到。此外，按常规方法调制出它们的盐，也可用于本发明。还有，和前述硫酸化多糖相同，本发明还可以使用将这些硫酸化寡糖和硫酸化单糖进一步硫酸化而得的高硫酸化硫酸化多糖和高硫酸化硫酸化单糖。本发明中寡糖是指2～10个单糖相连的糖化合物，多糖是指11个以上单糖相连的糖化合物。
本发明中，对细胞毒性T细胞的抗原特异细胞毒害性具有维持或增强能力的酸性多糖的分解物，可以用酶学方法、化学方法、物理方法等公知的方法调制，选择使用对细胞毒性T细胞的抗原特异细胞毒害性具有维持或增强能力的酸性多糖的分解物。
这里所说的分解物，由作为分解对象的酸性多糖决定，不过，分解酸性多糖所得的大体分子量优选为10万～200、更优选3万～1000的范围。
调制本发明使用的酸性多糖分解物的适宜方法有酸分解法，将对应的酸性多糖进行酸分解，可以得到对细胞毒性T细胞的特异细胞杀伤活性具有维持或增强能力的酸性多糖的分解物。
作为本发明使用的酸性多糖的酸分解条件，只要是可以生成对细胞毒性T细胞的抗原特异细胞杀伤活性具有维持或增强能力的酸性多糖的分解物(以下，也称为本发明的分解物)的条件即可，没有特别的限制。
例如，将酸性多糖溶解或悬浊在酸水溶液等中，进行酸分解反应，生成本发明的分解物。还可在反应时加热，以缩短生成本发明的分解物所需的时间。
溶解或悬浊酸性多糖的酸的种类没有特别的限制，可以使用盐酸、硫酸、硝酸等无机酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乳酸、抗坏血酸等有机酸、以及阳离子交换树脂、阳离子交换纤维、阳离子交换膜等固体酸。
酸的浓度也没有特别的限定，可优选使用0.0001～5当量、更优选0.01～1当量左右的浓度。反应温度也没有特别的限定，可优选设计为0～200℃、更优选20～130℃。
反应时间也没有特别的限定，优选设计为数秒～数天。酸种类和浓度、反应温度以及反应时间可根据本发明所用分解物的生成量、分解物的聚合度而适当选择。例如，制备岩藻依聚糖的分解物时，使用柠檬酸、乳酸、苹果酸等有机酸，酸浓度选择为数10mM～数M，加热温度选为50～110℃、优选70～95℃，加热时间选择为数分钟～24小时，如此可以调制得到本发明的分解物。岩藻依聚糖的酸分解物可举出源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的酸分解物。
本发明的分解物可以以对细胞毒性T细胞的特异的细胞杀伤活性具有维持或增强作用作为指标进一步分级，例如可以通过凝胶过滤法、使用分子量分级膜的分级法等对酸分解物进行分子量分级。
凝胶过滤法的例子有，使用Cellulofine GCL-300，可以调制得到例如分子量大于25000、分子量25000～大于10000、分子量10000～大于5000、分子量5000以下等任意的分子量级分，使用CellulofineGCL-25，例如可以将分子量5000以下的级分调制成分子量5000～大于3000、分子量3000～大于2000、分子量2000～大于1000、分子量1000～大于500、分子量500以下等任意的分子量级分。
此外，使用超滤膜可以进行工业的分子量分级，例如使用ダィセル公司制造的FE10-FUSO382可以调制得到分子量30000以下的级分，使用此公司制造的FE-FUS-T563可以调制得到分子量6000以下的级分。还有，使用纳滤(nanofilter)膜也可以得到分子量500以下的级分，通过将这些凝胶过滤法、分子量分级法组合起来，可以调制得到任意的分子量级分。
可用于本发明的酸性多糖的分解物，例如岩藻依聚糖的分解物，可以举出式(I)所示化合物、式(II)所示化合物、式(III)所示化合物，这些化合物可以用国际公开第99/41288号小册子、国际公开第96/34004号小册子、国际公开第00/50464号小册子记载的方法进行调制。此外，以式(I)所示化合物为基本骨架、具有其重复结构的岩藻依聚糖和寡糖、式(II)所示化合物为基本骨架，具有其重复结构的岩藻依聚糖如寡糖、以及以式(III)所示化合物为基本骨架、具有其重复结构的岩藻依聚糖和寡糖，也可分别作为本发明的酸性多糖和酸性寡糖使用。此外，作为本发明的酸性多糖的分解物，例如岩藻依聚糖的分解物，可举出国际公开第99/41288号小册子、国际公开第96/34004号小册子、国际公开第00/50464号小册子记载的岩藻依聚糖的分解物。 (式中，R为OH或OSO3H。) (式中，R为OH或OSO3H。) (式中，R为OH或OSO3H。)式(I)所示化合物可通过如下方法得到，即，用交替单胞菌属sp.SN-1009(FERM BP-5747)产生的内切型硫酸化多糖分解酶(F-岩藻依聚糖特异分解酶)处理前述F-岩藻依聚糖，由其分解物精制得到。对于此化合物中硫酸基的含量、位置，可以从其分解物中调制出任意的物质。此外，此分解物中还含有式(I)所示化合物的多聚体，可以根据需要进行分离、精制。
式(II)所示化合物可通过如下方法得到，即，用黄杆菌属sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的内切型硫酸化多糖分解酶(U-岩藻依聚糖特异分解酶)处理前述U-岩藻依聚糖，由其分解物精制得到。对于此化合物中硫酸基的含量、位置，可以从其分解物中调制出任意的物质。此外，此分解物中还含有以式(II)所示化合物为基本骨架的多聚体，可以根据需要进行分离、精制。
作为式(I)所示化合物的例子有后式(IV)所示化合物。作为式(II)所示化合物的例子有后式(VI)所示化合物。作为式(III)所示化合物的例子有后式(V)所示化合物。
可以用交替单胞菌属sp.SN-1009(FERM BP-5747)产生的F-岩藻依聚糖分解酶和黄杆菌属sp.SA-0082(FERM BP-5402)产生的U-岩藻依聚糖分解酶分解源于伽高迈海带的岩藻依聚糖，除去分解物，以此精制前述G-岩藻依聚糖。
黄杆菌属sp.SA-008 2(FERM BP-5402)产生特异分解G-岩藻依聚糖的内切型硫酸化多糖分解酶(G-岩藻依聚糖分解酶)，将此G-岩藻依聚糖分解酶作用于G-岩藻依聚糖，调制此G-岩藻依聚糖的分解物，由这些分解物中根据需要精制分解物。式(III)所示化合物就是其中一例。对于此化合物中硫酸基的含量、位置，可以从其分解物中调制出任意的物质。此外，这些分解物中还含有以式(III)所示的化合物为基本骨架的其多聚体，可以根据需要分离、精制。
此外，上述各酶在国际公开第97/26896号小册子或国际公开第00/50464号小册子中有记载。
在有机酸存在下，对源于伽高迈海带的岩藻依聚糖进行加热处理可以得到葡糖醛酸和甘露糖的聚合物，此聚合物也可用作本发明的对细胞毒性T细胞的抗原特异细胞杀伤活性具有维持和增强能力的酸性多糖。此外通过调整加热处理条件、加热时间，可以调制得到任意聚合度的聚合物。
以上，本发明中使用的有效成分，只要对CTL的抗原特异细胞杀伤活性具有维持和增强作用即可，没有特别的限定，可以使用各种酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖和/或它们的盐，特别优选使用岩藻依聚糖、肝素、褐藻酸、硫酸化软骨素A、硫酸化软骨素B、果胶酸、透明质酸、岩藻依聚糖分解物、硫酸化葡萄糖、硫酸化岩藻糖以及它们的盐中的至少一种化合物。本发明中，优选迄今为止可用作药品的酸性多糖，例如可以使用硫酸化葡聚糖钠、透明质酸、肝素等。硫酸化葡聚糖钠是将经根据肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroidesvan Tieghem)的蔗糖发酵而产生的葡聚糖的部分分解物硫酸化后得到的硫酸化酯的钠盐。
用于本发明的酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖的盐，只要对CTL的抗原特异细胞杀伤活性具有维持和增强作用即可，没有特别的限定，例如可举出，碱金属盐、碱土金属盐、与有机碱等的盐。例如与钠、钾、钙、镁、铵或二乙醇胺、乙二胺等的盐。这些盐可以如此得到，例如可以按公知方法将存在于酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖中的酸性基团、例如存在于岩藻依聚糖等中的硫酸基和羧基转换成盐。这里的盐优选可药用盐。
本发明中作为有效成分使用的酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖和/或它们的盐可以单独或2种以上混合使用。此外，还可使用这些有效成分的衍生物，例如脂肪酸衍生物等，只要它们也具有维持或增强CTL特异细胞杀伤活性的能力即可，没有特别的限制。
本发明中，将对CTL具有分化能力的前体细胞与抗原呈递细胞一起孵育(共培养)，诱导CTL的一般条件可以根据公知的条件[例如，参见文献Bednarek M.A.等、J.Immunology 147 p4047-4053(1991)]。共培养条件没有特别的限定，可以使用通常细胞培养所使用的条件，例如，可以在37℃、5％CO2等条件下培养。此共培养通常实施2～15天左右，这期间可以将抗原呈递细胞更换成重新调制的细胞，进行再刺激。此外，还可以适当的时间间隔将培养基更换成新鲜的培养基。
进行共培养的培养基中，本发明有效成分的含量只要可以得到所希望的效果即可，没有特别的限制，不过，优选0.001～1000μg/ml、更优选0.01～100μg/ml。有效成分优选溶解存在于培养基中。
如此诱导的CTL，对所希望的抗原具有特异识别能力，例如利用该细胞杀伤活性对具有此抗原的细胞进行特异破坏。此CTL的细胞杀伤活性可以按公知方法评价。例如对于由经抗原呈递细胞呈递的肽和经放射性物质、荧光物质等标记的靶细胞的杀伤性，通过放射能的摄入所能测定的CTL增殖的抗原特异的增加或通过测定从CTL和靶细胞中抗原特异游离出来的GM-CSF；IFN-γ等细胞因子量来评价(参见后述实施例1-1-(3))。此外，也可以使用经荧光色素等标记的抗原肽和复合物进行直接确认。这种情况可以如此进行，即，例如将CTL和与CTL特异抗体偶联的第1荧光标记物接触后，和与第2标记物偶联的抗原肽-MHC复合物接触，且在双标记细胞的存在下进行FACS(荧光激活细胞分类术)。
按本发明方法诱导的CTL具有如此优异的性质，即使长时间维持诱导后的细胞或使其增殖，也不会出现以往观察到的抗原特异细胞杀伤性明显降低的情况。因此，通过将诱导后的CTL克隆化，也可以保持为具有稳定的细胞杀伤活性的淋巴细胞。例如，可以通过给予诱导后的CTL以抗原、各种细胞因子、抗CD3抗体刺激，从而使其增殖、扩大培养。对于此CTL的维持、扩大培养，优选使用后述的本发明的细胞毒性T细胞的维持方法、扩大培养。
将按本发明方法诱导的CTL用适当的方法维持或扩大培养后，按前面记载的方法测定其细胞杀伤活性，可以确认本发明的效果。(2)本发明的细胞毒性T细胞的维持方法本发明的细胞毒性T细胞的维持方法是，将CTL在保持抗原特异细胞杀伤活性的状态下进行维持。此方法的一大特征在于，在含有本发明有效成分的培养基中继续培养CTL，可以继续维持此细胞所具有的抗原特异的细胞杀伤活性。
适用于上述方法的CTL没有特别限制，可以将用公知方法得到的CTL在维持其抗原特异杀伤活性的状态下，用本发明方法进行维持。此外，也可很好地用于按上述(1)中叙述的本发明的细胞毒性T细胞的诱导方法得到的CTL的维持。
本发明中，CTL继续培养的一般条件可以根据公知的条件[例如，参见文献Carter J.等、Immunology 1986 Jan.57(1)p123-129]。在本发明的细胞毒性T细胞的维持方法中使用的培养基没有特别的限制，例如可以使用上述CTL诱导方法中所使用的培养基。
本发明的方法是通过向培养基中添加前述有效成分而实施的。在进行培养的培养基中，本发明的有效成分的含量只要可得到所希望的效果即可，没有特别的限制，不过，优选0.001～1000μg/ml、更优选0.01～100μg/ml。有效成分优选溶解存在于培养基中。前述有效成分优选岩藻依聚糖、肝素、褐藻酸、硫酸化软骨素A、硫酸化软骨素B、果胶酸、透明质酸、岩藻依聚糖分解物、硫酸化葡萄糖、硫酸化岩藻糖以及它们的盐中的至少一种化合物。进一步地，根据需要还可在培养基中添加细胞因子和其它公知组分。本发明中优选使用含有IL-2的培养基。培养条件没有特别限制，可以使用通常细胞培养所用的条件，例如可以在37℃、5％CO2等条件下培养。此外，还可以适当的时间间隔将培养基更换为新鲜的培养基。
如上所述，在含有本发明有效成分的培养基中继续培养CTL，可以抑制其特异细胞杀伤活性的降低，维持CTL。本发明的这一效果可以通过如下方法确认，即，用前述(1)所述方法测定用本发明方法维持的CTL所具有的细胞杀伤活性。此外，用此方法维持的CTL可以用公知的扩大培养方法增殖，如此增殖的CTL也保持有特异细胞杀伤活性。作为扩大培养CTL的方法，优选使用后述的本发明扩大培养CTL的方法。(3)本发明的细胞毒性T细胞的扩大培养方法在适当的条件下，对细胞毒性T细胞进行培养，可以使其细胞数增加(扩大培养)。以往已经开发出几个扩大培养CTL的方法，已知，可在短时间有效增殖CTL的方法有，Riddell等人开发的前述REM法。该方法为，使用经X线照射成非增殖性PBMC(用作饲养细胞)和经EBV转化的B细胞(EBV-B细胞)，在IL-2、抗CD3单克隆抗体的存在下培养CTL。不过，该方法中存在EBV-B细胞有可能混入到T细胞的危险性问题。
本发明的细胞毒性T细胞的扩大培养方法为，可以在保持抗原特异细胞杀伤活性的状态下，使其细胞数增加的方法。该方法的特征在于，在本发明的前述有效成分的存在下孵育(培养)细胞。
对于本发明方法，其可适用的CTL没有特别的限定，优选用于按公知方法得到的CTL、按上述(1)所述的本发明的诱导CTL方法得到的CTL、按上述(2)所述的本发明的维持CTL的方法得到CTL的扩大培养。本发明中，CTL扩大培养的一般条件可以根据公知条件[例如，参见文献Uberi J.P.等、Clin.Immunol.Immunophathol.1994Mar.70(3)p234-240]。
本发明细胞毒性T细胞的扩大培养方法，优选在除了含有前述有效成分以外还进一步含有抗CD3抗体、优选抗CD3单克隆抗体的培养基中培养CTL。此外，进一步优选将CTL与适当的饲养细胞共培养。
上述方法所用的培养基没有特别的限制，可以使用混合了培养、发育CTL所必需的成分而制成的公知的培养基，例如可以使用市售的培养基。将CTL与饲养细胞共培养时，优选使用对维持、发育CTL、饲养细胞都适合的培养基。这些培养基除了含有原有的构成组分外，还可以含有适当的蛋白质、细胞因子类、其它公知组分等。例如本发明优选使用含有IL-2的培养基。为了使CTL上的T细胞受体活化，可以添加抗CD3抗体、特别是抗CD3单克隆抗体。抗CD3抗体在培养基中的含量可以根据公知条件决定，例如，优选0.01～1μg/ml。
本发明的CTL的扩大培养方法是通过将前述有效成分添加到培养基中而实施的。前述有效成分优选岩藻依聚糖、肝素、褐藻酸、硫酸化软骨素A、硫酸化软骨素B、果胶酸、透明质酸、岩藻依聚糖分解物、硫酸化葡萄糖、硫酸化岩藻糖以及它们的盐中的至少一种化合物。在进行培养的培养基中，本发明的有效成分的含量只要可得到所希望的效果即可，没有特别的限制，不过，优选0.001～1000μg/ml、更优选0.01～100μg/ml。有效成分优选溶解存在于培养基中。
本发明方法中所用的饲养细胞，只要可以与抗CD3抗体协同刺激CTL，使T细胞受体活化即可，没有特别的限制。本发明中，例如使用PBMC和EBV-B细胞。通常饲养细胞是在用放射线照射等方法剥夺其增殖能力后使用的。饲养细胞在培养基中的含量可以根据公知条件决定，例如优选1×105～1×107细胞/ml。
本发明特别优选的实施方式中，使用非病毒感染细胞、例如EBV-B细胞以外的细胞作为饲养细胞。由此，可以排出EBV混在扩大培养后的CTL中的可能性，可以提高诸如继承免疫疗法的使用CTL的医疗安全性。
本发明的扩大培养细胞毒性T细胞的方法中，其培养条件没有特别的限制。可以使用通常细胞培养所用的条件，例如可以在37℃、5％CO2等条件下培养。此外，还可以适当的时间间隔将培养基更换为新鲜的培养基。
对于CTL的扩大培养方法，只要将本发明的有效成分添加到所使用的培养基中即可，没有特别的限制，对于上述以外的以往的CTL扩大培养方法，将本发明有效成分添加到培养基中的方式也包含在本发明中。
根据本发明的扩大培养方法，例如通过14天的扩大培养可以得到细胞数增加了100～1000倍的CTL。进而，与用以往的CTL扩大培养方法、例如REM法得到的CTL相比较，本发明的如此得到的CTL保持有高的抗原特异细胞杀伤活性。
本发明的这种效果可以通过如下方法确认，即，用上述(1)所述的方法测定按本发明扩大培养的CTL所具有的细胞杀伤活性。
此外，本发明所用有效成分可以用作发挥维持或增强CTL的抗原特异细胞杀伤活性作用的CTL诱导剂、CTL维持剂或CTL扩大培养剂(以下将这些称为CTL培养剂)。此CTL培养剂由有效成分直接、或进一步地含有其它任意成分、例如包含在CTL诱导方法所用的培养基中、CTL维持方法所用的培养基中、或CTL扩大培养方法所用的培养基中的、培养、发育CTL和饲养细胞所必需的成分、以及适当的蛋白质、细胞因子类(适宜的是IL-2)、所希望的其它成分构成。此外，含有这些CTL培养剂的培养基可以用作CTL诱导用、维持用或扩大培养用培养基(以下，称这些为CTL用培养基)。这些培养基除了含有细胞培养所需的基本成分和上述化合物以外，还可以任意含有针对各种用途的适宜成分。前述CTL培养剂和CTL用培养基可以用公知方法制备。
使用上述本发明的CTL诱导方法、维持方法以及扩大培养方法而得到的含有CTL的培养物中，通常还混有辅助T细胞等CTL以外的细胞。本发明中，可以通过离心分离等由该培养物回收此培养物中的细胞，作为由本发明方法得到的CTL使用、例如直接使用。
此外，还可由该培养物中分离出含有大量具有抗原特异细胞杀伤活性的CTL的细胞团(或培养物)，作为由本发明方法所得的CTL使用。也就是说，在本发明中，通过实施将前述含有CTL培养物中的CTL以外的细胞(例如，辅助T细胞)与CTL分离的操作，可以调制使用经与抗原特异细胞杀伤活性有关的浓缩后的细胞团。在以往的REM法中，必须进行通过分离前述细胞团的抗原特异细胞杀伤活性的浓缩。作为本发明的一个实施方式，其提供细胞毒性T细胞的回收方法，此方法包含由按本发明的CTL诱导方法、维持方法以及扩大培养方法中任一方法而得的含有CTL的培养物中选择出含有大量具有抗原特异细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的细胞团。本发明的CTL回收方法，其一可以称为可选择得到具有高抗原特异细胞杀伤活性的CTL的细胞团的方法，广义地讲，其可称为生产或获得此CTL的细胞团的方法。对于此细胞团的选择方法，没有特别的限制，例如，使用与CTL细胞表面上表达的细胞表面抗原对应的抗体、例如抗CD8抗体结合的磁珠或玻璃，从由使用上述的CTL的诱导方法、维持方法以及扩大培养方法所得的含有CTL的培养物中只选择回收出CTL，可以得到含大量CTL的细胞团。使用流式细胞计数器可以选择性地分离CTL。此外，通过由按本发明的CTL的诱导方法、维持方法以及扩大培养方法所得的含有CTL的培养物中除去CTL以外的细胞，可以得到含大量CTL的细胞团。例如，为了由培养物中除去辅助T细胞，使用与辅助T细胞表面上表达的细胞表面抗原对应的抗体、例如抗CD3抗体、抗CD4抗体结合的磁珠或玻璃，选择除去辅助T细胞，可以得到含大量CTL的细胞团。使用流式细胞计数器也可以除去辅助T细胞。如此得到的含有大量CTL的细胞团，与非选择地由含有CTL的培养物中回收所得的细胞团相比较，具有很强的细胞杀伤活性，更适于作为由本发明方法所得的CTL使用。还有，本发明中含有大量CTL的细胞团也包括只含CTL的细胞团。
此外，还可以使用根据本发明的CTL维持方法以及扩大培养方法得到的CTL，进一步根据本发明的CTL维持方法以及扩大培养方法进行CTL的维持或扩大培养。例如，由按本发明的扩大培养方法而得的CTL得到含有大量CTL的级分，使用该级分进行本发明的扩大培养方法，由此可以得到细胞杀伤活性更高的CTL。此外，也可以使用本发明的维持方法维持按本发明的扩大培养方法得到的CTL的细胞杀伤活性。
还有，本发明提供用上述本发明的CTL诱导方法、维持方法以及扩大培养方法得到的CTL。所述CTL具有如下性质，即，都具有抗原特异的细胞杀伤活性，即使经过长时间的继续培养和扩大培养，其细胞杀伤活性的降低也很少。此外，本发明提供含有此CTL作为有效成分的治疗剂。此治疗剂特别适用于继承免疫疗法。继承免疫疗法中，将适于治疗患者的具有抗原特异细胞杀伤活性的CTL例如通过静脉给药的方式施用给患者。此治疗剂可以根据制药领域的公知方法调制，例如以按本发明方法调制的CTL作为有效成分，与例如适用于公知的非经口给药的有机和无机载体、赋形剂、稳定剂等混合。为此，此CTL特别优选根据本发明的CTL扩大培养方法而不使用EBV感染细胞而调制得到的CTL。治疗剂中CTL的含量、治疗剂的给药量等涉及该治疗剂的诸多条件，可以根据公知的继承免疫疗法作出适宜决定。
以下，举出实施例来更具体地说明本发明，不过，本发明并不只限于这些实施例。此外，如无特别解释，实施例中的％均代表重量％。制备例1将伽高迈海带充分干燥后，用自由粉碎机(奈良机械制作所制)将干燥物20kg粉碎。将氯化钙二水合物(日本曹达社制)7.3kg溶解于自来水900升中，接着混合伽高迈海带粉碎物20kg。通入水蒸气使之由液体温度12℃升温40分钟达到液体温度90℃，接着搅拌条件下在90～95℃保温1小时，接着冷却，得到冷却物1100升。接着，使用固液分离装置(West Farrier Separator公司制CNA型)，对冷却物进行固液分离，制备约900升的固液分离上清液。使用DAICEL公司制FE10-FC-FUS0382(级分分子量3万)，将固液分离上清液360升浓缩至20升。接着，加入自来水20升，再浓缩至20升，这种操作进行5次，进行脱盐处理，配制源于伽高迈海带的萃取液25升。冷冻干燥该溶液1升，得到源于伽高迈海带的岩藻依聚糖干燥物13g。制备例2将制备例1记载的岩藻依聚糖干燥物7g溶解于含有50mM氯化钠和10％乙醇的20mM的咪唑缓冲液(pH8.0)700ml中，通过离心分离除去不溶物。用同样的缓冲液将DEAE-Cellulofine A-800柱(φ11.4cm×48cm)(生化学工业社制)平衡化，供给离心分离上清液后，用同样的缓冲液洗涤，按照氯化钠50mM至1.95M的浓度梯度进行洗脱(1级分250ml)。用酚硫酸法以及咔唑硫酸法求出总糖量和糖醛酸含量，按洗脱顺序得到级分43～49、级分50～55、级分56～67。接着，通过电透析将这些级分脱盐后进行冷冻干燥，分别由级分43～49制得I级分(340mg)，由级分50～55制得II级分(870mg)，由级分56～67制得III级分(2.64g)。图1表示源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的DEAE-Cellulofine A-800柱洗脱曲线。图1中纵轴表示按咔唑硫酸法得到的530nm处的吸光度(图中黑圆圈)、按酚硫酸法得到的480nm处的吸光度(图中白圆圈)以及电导率(mS/cm图中白方块)，横轴表示级分序号。图中前峰表示U-岩藻依聚糖、后峰表示F-岩藻依聚糖。制备例3(1)在分别注入了含有葡萄糖0.25％、蛋白胨1.0％、酵母提取物0.05％的人工海水(Jamarin Laboratory公司制)pH8.2构成的培养基600ml并灭菌(120℃，20分钟)后的2升锥形瓶中接种交替单胞菌属SN-1009(FERM BP-5747)，在25℃下培养26小时，得到种培养液。将含有蛋白胨1.0％、酵母提取物0.02％、下述实施例2-(2)记载的硫酸化多糖0.2％以及消泡剂(信越化学工业社制KM70)0.01％的人工海水pH8.0构成的培养基20升装入30升容量的发酵罐中，在120℃下杀菌20分钟。冷却后，接种上述种培养液600ml，在每分钟10升的通气量和每分钟250转的搅拌速度的条件下，在24℃培养24小时。培养结束后，离心分离培养液，得到菌体和培养上清液。用装有排除分子量1万的全纤维的超滤器浓缩得到的培养上清液，之后用85％饱和硫酸铵盐析，通过离心分离收集生成的沉淀，对含有十分之一浓度人工海水的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.2)充分透析，配制600ml选择性作用于F-岩藻依聚糖的F-岩藻依聚糖分解酶液。
(2)用装有直径1mm的筛网的切磨机(增幸产业社制)将干燥后的伽高迈海带2Kg粉碎，将得到的海带碎片悬浊于20升的80％乙醇中，在25℃下搅拌3小时，用滤纸过滤后，充分洗涤残渣。将得到的残渣悬浊于加热至95℃的40升含有50mM氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液pH6.5中，不断搅拌的同时在95℃下处理2小时，提取硫酸化多糖。
过滤提取液中的悬浊物，制得滤液后，用3.5升100mM氯化钠洗涤过滤残渣，再得到滤液。
将两次的滤液合并后，将温度降低至30℃，添加3000U的褐藻酸裂合酶(Nagase生化学工业社制)后，加入乙醇4升，在25℃下搅拌24小时。接着，进行离心分离，用具备排除分子量10万的全纤维的超滤器将得到的上清液浓缩至4升，再用含有10％乙醇的100mM氯化钠继续超滤，直到着色性物质不再过滤。
通过离心分离除去非滤液中生成的沉淀，将该上清液的温度降低至5℃，用0.5N盐酸调节pH至2.0后，通过离心分离除去生成的蛋白质等沉淀，迅速用1N氢氧化钠将得到的上清液的pH调节至8.0。
接着，用装有排除分子量10万的全纤维的超滤器进行超滤，用20mM氯化钠pH8.0完全取代溶剂后，再调节pH至8.0，离心分离后，进行冷冻干燥，制得约95g的硫酸化多糖。
(3)用装有直径1mm筛网的切磨机粉碎干燥的伽高迈海带2Kg，将得到的海带碎片悬浊于20升的80％乙醇中，在25℃下搅拌3小时，用滤纸过滤后，充分洗涤残渣。将得到的残渣悬浊于含有30mL上述制备例3-(1)制得的F-岩藻依聚糖分解酶、10％乙醇、100mM氯化钠、50mM氯化钙以及50mM咪唑的20升缓冲液(pH8.2)中，在25℃下搅拌48小时。用网眼的直径为32μm的不锈钢金属网过滤该悬浊液，用含有50mM氯化钙的10％乙醇洗涤残渣。再将该残渣悬浊于10升含有50mM氯化钙的10％乙醇中，搅拌3小时后，用不锈钢金属网过滤，洗涤。再将该残渣在同样的条件下悬浊后，搅拌16小时，用直径32μm的不锈钢金属网过滤，洗涤。
收集这样得到的滤液和洗涤液，用装有排除分子量3000的全纤维的超滤器进行超滤，分离成滤液和非滤液。
用旋转式蒸发器将该滤液浓缩至约3升后，离心分离得到上清液。用装有排除分子量300的膜的电透析器将得到的上清液脱盐后，向该溶液中添加醋酸钙达到0.1M，离心分离除去生成的沉淀。将该上清液装入预先用50mM醋酸钙平衡后的DEAE-Cellulofine(树脂量4升)，用50mM醋酸钙和50mM氯化钠充分洗涤后，按50mM～800mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。这时的收集量按每1管500ml进行。用醋酸纤维素膜电泳法〔Analytical Biochemistry，第37卷，第197～202页(1970)〕分析收集后，经氯化钠浓度为约0.4M的洗脱的硫酸化糖(级分序号63附近)是均一的。
然后，首先将级分序号63的溶液浓缩至150mL后，添加氯化钠使浓度达到4M，装入预先用4M氯化钠平衡后的Phenyl-Cellulofine(树脂量200mL)(生化学工业社制)，用4M氯化钠充分洗涤。收集非吸附性的硫酸化糖级分，用装有排除分子量300的膜的电透析器脱盐，得到脱盐液505mL。
将得到的脱盐液中40mL装入用含有10％乙醇的0.2M氯化钠平衡后的Cellulofine GCL-90柱(4.1cm×87cm)中，进行凝胶过滤。收集按每1级分9.2mL进行。
按照酚硫酸法〔Analytical Chemistry，第28卷，第350页(1956)〕对总级分进行总糖量的分析。
结果，由于硫酸化糖形成了1个峰，收集其峰的中央部分，即级分序号63～70，用装有排除分子量300的膜的电透析器脱盐后，冷冻干燥，得到112mg下述式(IV)表示的化合物的干燥品。以下将该化合物称为7-12SFd-F。 (4)向制备例2制得的III级分(F-岩藻依聚糖)的2.5％水溶液80mL中添加1M Tris-盐酸缓冲液(pH7.6)16mL、1M CaCl2水溶液16mL、4M NaCl水溶液24mL、实施例3-(1)得到的F-岩藻依聚糖分解酶8mL、蒸馏水176mL，在30℃下加热3小时。用旋转式蒸发器将该酶处理F-岩藻依聚糖溶液浓缩至酶处理F-岩藻依聚糖的最终浓度达到2％，之后在蒸馏水中进行透析操作，制得2％酶处理F-岩藻依聚糖水溶液。用HPLC(柱SB 802.5，柱温度35℃，移动相50mM NaCl，流速0.5mL/min，检测RI ATT＝8)分析该试样。结果得知试样中的约40％为式(IV)记载的7-12SFd-F。制备例4(1)用装有孔径1mm筛网的切磨机(增幸产业社制)粉碎干燥伽高迈海带2Kg，在20升的80％乙醇中25℃下搅拌3小时后过滤，洗涤。将得到的残渣悬浊于含有50mM氯化钙、100mM氯化钠、10％乙醇以及制备例3-(1)制得的交替单胞菌属SN-1009(FERM BP-5747)F-岩藻依聚糖分解酶1U的20升30mM咪唑缓冲液(pH8.2)中，在25℃下搅拌2天，接着用孔径32μm的不锈钢金属网过滤，洗涤。将得到的残渣悬浊于含有100mM氯化钠、10％乙醇以及4g褐藻酸裂合酶(Nagase生化学工业制)的40升磷酸钠缓冲液(pH6.6)中，在25℃搅拌4天后，离心分离得到上清液。为了除去所得上清液中含有的褐藻酸的低分子化物，用装有排除分子量10万的全纤维的超滤器浓缩至2升后，用含有10％乙醇的100mM氯化钠进行溶液交换。向该溶液中添加等量的400mM醋酸钙搅拌后，离心分离，将得到的上清液用冰冷却，同时用1N盐酸调节至pH2。通过离心分离除去生成的沉淀，用1N氢氧化钠将得到的上清液调节至pH8.0。通过超滤将该溶液浓缩至1升后，用100mM的氯化钠进行溶液交换。通过离心分离除去这时产生的沉淀。为了除去得到的上清液中的疏水性物质，向上清液中加入氯化钠达到1M，装入用1M氯化钠平衡后的3升Phenyl-Cellulofine柱(生化学工业制)，收集流出的级分。通过超滤器将该级分浓缩后，用20mM的氯化钠进行溶液交换，冷冻干燥。冷冻干燥物的重量为29.3g。
(2)将上述冷冻干燥物15g溶解于含有培养国际公开第97/26896号说明书记载的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)SA-0082(FERM BP-5402)、由该培养物得到的内切型硫酸化多糖分解酶(U-岩藻依聚糖分解酶)9U以及500mM氯化钠的1.5升50mM Tris-盐酸缓冲液中，在25℃下反应6天后，用蒸发器浓缩至约300ml。将浓缩液加入到排除分子量3500的透析管中彻底透析，将残留在透析管内的液体装入用50mM氯化钠平衡后的4升DEAE-Cellulofine A-800中，用50mM氯化钠充分洗涤后，按照50～650mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。再用650mM的氯化钠充分洗脱同一柱。收集洗脱级分中用650mM氯化钠洗脱出的级分作为硫酸化岩藻半乳聚糖级分，用排除分子量10万的超滤器浓缩后，用10mM的氯化钠更换溶液，冷冻干燥，得到硫酸化岩藻半乳聚糖的冷冻干燥物0.85g。得到的硫酸化岩藻半乳聚糖(G-岩藻依聚糖)含有半乳糖和岩藻糖作为构成糖，其摩尔比为约2∶1。
(3)为了生产G-岩藻依聚糖分解酶，将含有葡萄糖0.1％、蛋白胨1.0％、酵母提取物0.05％的人工海水(Jamarin Laboratory公司制)pH7.5构成的培养基600ml在120℃灭菌20分钟后，在该培养基中接种黄杆菌属SA-0082(FERM BP-5402)，在24℃下培养23小时，得到种培养液。将含有按实施例4-(1)的方法制得的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖级分0.2％、蛋白胨2.0％、酵母提取物0.01％以及消泡剂(KM70，信越化学工业制)0.01％的人工海水(pH7.5)构成的培养基20升装入30升容量的发酵罐中，在120℃下杀菌20分钟。冷却后，接种上述种培养液600ml，在每分钟10升的通气量和每分钟125转的搅拌速度的条件下，在24℃培养23小时。培养结束后，离心分离培养液，得到菌体。
将得到的菌体悬浊于1200mL含有0.4M氯化钠的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中，超声波粉碎后，进行离心分离，得到菌体提取液。用相同缓冲液对得到的菌体提取液进行充分透析，离心分离得到上清液。向得到的上清液中添加硫酸铵使最终浓度达到90％饱和，离心分离收集生成的沉淀。将得到的沉淀溶解于150mL含有50mM氯化钠的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中，用相同的缓冲液进行充分透析，离心分离。将得到的上清液装入用相同缓冲液平衡后的500mLDEAE-Cephalose FF(Amasiam Pharmasia社制)柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照50mM至600mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱，收集活性级分。
用含有0.1M氯化钠的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)对得到的活性级分进行充分透析，装入用相同缓冲液平衡后的100mL DEAE-Cellulofine A-800(生化学工业社制)柱中，用相同缓冲液洗涤后，按0.1M至0.4M氯化钠的浓度梯度进行洗脱，收集活性级分。向得到的活性级分中添加氯化钠使之达到4M，装入用含有4M氯化钠的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)平衡后的20mL苯基-Cellulofine(生化学工业社制)柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照4M至1M氯化钠的浓度梯度洗脱后，再用含有1M氯化钠的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)充分洗脱，收集活性级分。向得到的活性级分中添加氯化钠使之达到3M，装入用含有3M氯化钠的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)平衡后的10mL苯基-Cellulofine(生化学工业社制)柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照3M至0.5M氯化钠的浓度梯度进行洗脱后，再用含有0.5M氯化钠的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)充分洗脱，收集活性级分。使用这样得到的纯化酶作为G-岩藻依聚糖分解酶。
(4)使上述纯化G-岩藻依聚糖分解酶作用于制备例4-(2)记载的G-岩藻依聚糖，制备低分子化物。也就是说，将1.94g的G-岩藻依聚糖溶解于含有0.2M氯化钠的25mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)后，加入186mU的G-岩藻依聚糖分解酶，在25℃下使之反应6天。用蒸发器将反应液浓缩至80mL，采用Cellulofine GCL-1000(生化学工业社制)的柱(4×90cm)进行分子量分级。收集分子量15000以下的级分，作为G-岩藻依聚糖酶消化物级分。
(5)用蒸发器将上述G-岩藻依聚糖酶消化物级分浓缩至500mL后，通过电透析装置进行脱盐，装入预先用含有10mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH8)平衡后的1升DEAE-Cellulofine A-800(生化学工业社制)柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照10mM至900mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。洗脱级分每次收集61mL，采用酚硫酸法测定每一级分的糖含量。用270mM左右的氯化钠洗脱的级分形成了糖含量的峰，因此收集这些级分作为270mM洗脱级分(ロ)。
另外，关于上述270mM洗脱级分(ロ)，添加水使之达到与含有150mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH8)相同的导电率，装入预先用含有150mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH8)平衡后的200mLDEAE-Cellulofine A-800(生化学工业社制)柱中，用相同缓冲液洗涤后，采用150mM至300mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。洗脱级分每次收集12mL，采用酚硫酸法测定每一级分的糖含量。收集用160mM至180mM左右的氯化钠洗脱的级分，用Speed Back(SavantInstruments公司制)浓缩至2mL后，装入预先用10％乙醇平衡后的200mL Cellulofine GCL-25(生化学工业社制)柱中，用相同溶液洗脱。洗脱级分每次收集2mL，采用酚硫酸法测定每一级分的糖含量。收集糖含量形成峰的级分，作为(D)。
对于上述(D)级分，采用电透析装置进行脱盐后，冷冻干燥，分析糖组成和分子量。另外，按照常规方法用重水取代后，采用NMR分析进行结构解析。(D)的理化性质分子量13581H-NMR(D2O)δ；5.19(1H，d，J＝4.3Hz，F1-1-H)，4.93(1H，d，J＝3.7Hz，F2-1-H)，4.62(1H，与HOD重复，G1-1-H)，4.59(1H，与HOD重复，G2-1-H)，4.54(1H，d-d，J＝10.6，2.7Hz，F1-3-H)，4.46(1H，d，J＝7.6Hz，G3-1-H)，4.46(1H，m，F2-3-H)，4.41(1H，br-s，G2-4-H)，4.41(1H，d，J＝7.6Hz，G4-1-H)，4.37(1H，q，J＝6.4Hz，F2-5-H)，4.27(1H，m，G2-3-H)，4.24(1H，br-s，G3-4-H)，4.21(1H，m，G3-3-H)，4.19(1H，m，G4-3-H)，4.15(1H，br-s，G4-4-H)，4.13(1H，q，J＝6.7Hz，F1-5-H)，4.09(1H，d，J＝2.7Hz，F1-4-H)，4.04(1H，d，J＝2.8Hz，F2-4-H)，3.98(1H，m，G2-6-H)、3.96(1H，d-d，J＝10.6，4.3Hz，F1-2-H)，3.93(1H，m，G3-6-H)，3.88(1H，br-s，G1-4-H)，3.86(1H，m，G2-5-H)，3.81(1H，m，G2-6-H)，3.81(1H，m，F2-2-H)，3.80(1H，m，G3-5-H)，3.80(1H，m，G3-6-H)，3.66(1H，m，G1-3-H)，3.65(1H，m，G2-2-H)，3.64(1H，m，G1-6-H)，3.64(1H，m，G4-6-H)，3.61(1H，m，G4-5-H)，3.58(1H，m，G1-2-H)，3.56(1H，m，G1-6-H)，3.56(1H，m，G4-6-H)，3.55(1H，m，G4-2-H)，3.54(1H，m，G1-5-H)，3.54(1H，m，G3-2-H)，1.20(3H，d，J＝6.7，F1-6-H)，1.14(3H，d，J＝6.4，F2-6-H)糖组成L-岩藻糖∶D-半乳糖＝2∶4(摩尔比)
硫酸基 5分子另外，1H-NMR的峰所归属的序号如下述式(V)所示。以下，将该化合物称为6-5SFd-G。 制备例5将制备例3-(2)制得的硫酸化多糖120g悬浊于含有20mM氯化钙、300mM氯化钠、10％乙醇以及10U的制备例3-(1)制得的F-岩藻依聚糖分解酶的8升20mM咪唑缓冲液(pH7.5)中，在25℃下搅拌3天，使用装有排除分子量10万的全纤维的超滤装置，在添加上述缓冲液的同时进行超滤。
向超滤内液中添加制备例4-(2)记载的U-岩藻依聚糖分解酶，在25℃下搅拌2天，进行装有排除分子量10万的全纤维的超滤，在添加水的同时进行超滤。
收集滤液后，用蒸发器浓缩至1.5升后，采用脱盐装置完全脱盐，装入预先用含有30mM氯化钠的5mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.5)平衡后的3升DEAE-Cellulofine A-800柱中，用6升相同缓冲液洗涤后，按照30mM至500mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。洗脱需要的液量为48升。洗脱液每次收集180mL，采用酚硫酸法测定其糖含量。另外，同时测定232nm处的吸光度。由于130mM至170mM氯化钠的洗脱级分形成了一个峰，因此收集这些级分，用脱盐装置进行脱盐后，冷冻干燥，得到5.85g的寡糖。该寡糖通过质量分析确认分子量为1128，通过NMR分析确认为下述式(VI)表示的化合物。以下，将该化合物称为6-2SFd-U。 制备例6(1)将D-(+)-葡萄糖200mg(1.1mmol)溶解于吡啶10mL中，在室温下添加吡啶Sulflr三氧化物复合物(Pyr·SO3东京化成制)1.05g(6.6mmol)后，在室温下搅拌数分钟，再在60℃下搅拌1小时。用水稀释反应液，用饱和氢氧化钡水溶液将pH调节为中性附近，减压干燥固化。向得到的浓缩物中再次添加水，再次进行减压干燥固化。该操作再反复一次。向得到的浓缩物中加入少量水，离心除去硫酸钡沉淀，将得到的上清液施于阳离子交换柱〔Amberlite IRA-120(Na+)(organo)〕上。最终，减压浓缩得到的流过柱的级分，得到硫酸化D-(+)-葡萄糖钠盐700mg。(2)L-岩藻糖500mg(3.05mmol)溶解于吡啶10mL中，在室温下添加Pyr·SO32.33g(14.6mmol)后，在室温下搅拌数分钟，再在60℃下搅拌1小时，以下进行与制备例6-(1)同样的操作，得到硫酸化岩藻糖钠盐。实施例1保持有抗原特异细胞杀伤活性的CTL的继续培养方法对保有HLA-A24或A2.1的人的健康供血者进行成分采血后，用PBS(-)稀释2倍，在Ficoll-paque(ファルマシァ社制)上复层后，进行500g×20分的离心。用移液管回收洗净中间层的外周血单核细胞(PBMC)。收集的PBMC悬浊在由90％FCS(JRHバィォサィェンシズ社制)/10％二甲亚砜(SIGMA社制)构成的保存液中，保存在液氮中。诱导CTL时，在37℃水浴中时这些保存的PMBC快速融解，用含有10μg/ml Dnase(Calbiochem社制)的RPMI1640培养基(BioWhittaker社制)洗净后，用锥虫蓝染色法计算出活细胞数，供给各实验。(2)抗流感病毒记忆CTL的诱导对Bednarek等的方法(Bednarek M.A.et al.(1991)J.Immunology.147 4047-4053)作部分修改后，以此来实施抗流感病毒记忆CTL的诱导。也就是说，在含有5％人AB型血清、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺(均为Bio Whittaker社制)、10mM HEPES(ナカラィテスク社制)、1％链霉素-青霉素(ギブコBRL社制)的RPMI1640培养基(Bio Whittaker社制)(以下简称5HRPMI)中悬浊实施例1-1-(1)中制得的PBMC，使其达到4×106细胞/ml，然后按1ml/孔将其倒入24孔细胞培养板(Falcon社制)，在5％CO2湿式孵育器中，在37℃下孵育1.5小时，分离出塑料粘接性单核细胞。然后使用RPMI1640培养基回收非粘接性细胞，作为应答细胞保存在冰上。向分离出的单核细胞中各添加含有5μg/ml作为抗原肽的源于流感病毒蛋白质的抗原决定肽[序列表的序列号1中记载的源于核蛋白的HLA A24结合性肽(FluNPA24)RFYIQMCTEL或序列表的序列号2中记载的源于基质蛋白的HLA A2.1结合性肽(FluNPA2.1)GILGFVFTL]和1μg/ml β2微球蛋白(スクリプス社制)的5HRPMI 0.5ml，在室温孵育2小时后，用X线照射(5500R)，作为抗原呈递细胞。从各孔中吸取除去肽液，使用RPMI1640培养基洗净孔后，使在冰上保存的应答细胞悬浊在5HRPMI中以达到1～2×106细胞/ml，1ml/孔地添加到抗原呈递细胞上。此时添加试样，使其最终浓度为10μg/ml。使用未添加试样一组作为对照。试样使用的是制备例1中制得的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖。将板在37℃下、5％CO2中培养。在培养开始后的第二天，向各孔中添加含有60U/ml IL-2(盐野义制药社制)和10μg/ml与最初添加的试样相同的试样的(对照组只含有IL-2)5HRPMI 1ml，此外，在第5天，将培养上清液除去一半后，添加含有同样的IL-2和试样培养基(对照组只含有IL-2)各1ml。在第7天，与前述相同地调制抗原呈递细胞后，将培养了一周的应答细胞悬浊在5HRPMI中，使其达到1～2×106cells/ml，向与前述同样调制的抗原呈递细胞中各添加1ml/孔，进行再刺激。此时添加试样，使其最终浓度未10μg/ml(对照组为未添加的)。再刺激后的第二天，向各孔中添加含有60U/ml IL-2和10μg/ml试样的(对照组只含有IL-2)5HRPMI 1ml，此外，在第5天，将培养上清液除去一半后，添加与除去前所含物质相同的培养基各1ml，然后再继续培养2天，诱导CTL。
(3)CTL细胞杀伤活性的测定根据使用Calcein-AM的细胞杀伤活性测定法(RudolfLichtenfels等人J.Immunological methods 172(1994)227-239)对实施例1-1-(2)中制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。
将与抗原决定肽共培养一夜、或在无抗原决定肽存在培养一夜的保持有HLA-A24或A2.1的EBV转化B细胞(TISI或221A2.1)悬浊在含有5％FCS(JRHバィォサィェンシズ社制)RPMI1640培养基中，使其达到1×106细胞/ml，然后添加使最终浓度为25μM的Calcein-AM(ド-タィト社制)，在37℃下培养1小时。将细胞用不含Calcein-AM的培养基洗净后，与20倍量的K562细胞混合，作为Calcein标记靶细胞。这里使用K562细胞是为了排除因NK细胞混入应答细胞中而引起的非特异杀伤活性。
用5HRPMI对作为效应物细胞的实施例1-1-(2)中制得的记忆CTL进行阶段稀释，使其达到1×105～9×106细胞/ml，然后向96孔细胞培养板的各孔中分别注入100μl/孔，向其中添加调制为1×105/ml的Calcein标记靶细胞100μl/孔。对加入了上述细胞悬浊液的板进行400g×1分钟的离心后，在37℃的湿式CO2孵育器内孵育4小时。
4小时后，从各孔中收集培养上清液100μl，用荧光板式读取器(485nm/538nm)测定培养上清液中放出的calcein量。特异细胞杀伤活性按下式(1)求出。
特异细胞杀伤活性(％)＝[(各孔的测定值-最小放出量)/(最大放出量-最小放出量)]×100上式中，最小放出量为只含有靶细胞和K562细胞的孔的calcein放出量，表示来自靶细胞的calcein自然放出量。此外，最大放出量表示，在靶细胞中添加表面活性剂屈立通(triton)X-100(ナカラィテスク社制)完全破坏细胞时的calcein放出量。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，诱导时添加或不添加试样，其细胞杀伤活性没有差别。(4)CTL的继续培养用5HRPMI将在实施例1-1-(2)中制得的、在实施例1-1-(3)中确认了抗原决定肽特异细胞杀伤活性的CTL洗净后，在含有30U/ml IL-2的5HRPMI中进一步继续培养10～14天。此时，对于CTL诱导时添加了试样的组，将与CTL诱导时相同的试样以同浓度添加到培养基中，进行培养。此外，对于CTL诱导时未添加试样的对照组，则继续不添加试样地进行培养。这期间完全未附着由肽引起的刺激，每2～3天除去一半培养上清液后，添加与除去前相同组成的培养基各1ml。继续培养后，用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异细胞杀伤活性。测定结果如表1所示。表中，E/T表示效应细胞数(E)与靶细胞数(T)之比，附着肽表示有或没有对靶细胞附着肽。
表1添加试样 细胞杀伤活性(％)肽 试样 附着肽CTL IL-2E/T比诱导时 培养时1 3 10FluMPA 对照 - - -N.T.N.T.02.1 - - +N.T.N.T.0E/T比0.7 2.2 7源于伽高迈+ + -0 0 0海带的岩藻+ + +22.952.780.6依聚糖FluNPA E/T比24 1 3 10对照 - - - 0 0 11.8- - + 5.7 21 65.1源于伽高迈+ + - 1.6 0 7.5海带的岩藻+ + + 28.666.996.9依聚糖(N.T.表示未评价)结果表明，在CTL诱导时和继续培养时这两个阶段添加了试样的组，在10～14天的继续培养之后，其活性维持在很高的水平上。而对于在CTL诱导和继续培养中的任一过程都没有添加源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的对照组来说，其活性明显降低。
由此可知，由于在CTL诱导时和继续培养时添加了源于伽高迈海带的岩藻依聚糖，所以不必在继续培养时附着由肽等引起的刺激，就可以完成保持了抗原特异细胞杀伤活性状态的CTL的继续培养。
实施例1-2(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导使用按与实施例1-1-(1)同样的方法进行PBMC的分离、保存后的PBMC，按与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆CTL的诱导。此时，分别使用制造例1中制得的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖、制造例2中制得的III级分(F-岩藻依聚糖)和II级分(U-岩藻依聚糖)、制造例3中制得的7-12SFd-F作为试样以最终浓度10μg/ml添加到培养基中。以未添加试样的组作为对照。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出抗原特异细胞杀伤活性，但诱导时添加或不添加试样，其细胞杀伤活性没有差别。(2)CTL的继续培养用与实施例1-1-(4)相同的方法对实施例1-2-(1)中制得的CTL进一步进行10～14天的继续培养。此时，以实施例1-2-(1)中诱导时添加的试样作为试样，以最终浓度10μg/ml添加到培养基中。对CTL诱导时未添加试样的对照组，继续不添加试样地进行培养。继续培养后，用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异细胞杀伤活性。测定结果如表2所示。
表2添加试样细胞杀伤活性(％)肽试样 附着肽CTLIL-2 E/T比诱导时 培养时 31030FluMPA对照 - - - 4.6 5.0 13.12.1 - - +11.0 23.4 47.9源于伽高迈+ + - 5.9 4.9 12.3海带的岩藻+ + +53.3 86.0 100.9依聚糖F-岩藻依 + + - 2.1 2.4 7.2聚糖 + + +41.1 66.8 82.8U-岩藻依 + + - 1.6 4.1 9.2聚糖 + + +46.3 75.2 92.37-12S + + - 0.3 2.2 11.7Fd-F + + +12.0 37.9 60.7
结果表明，在CTL诱导时和继续培养时这两个阶段添加了试样的组，在10～14天的继续培养之后，其活性维持在很高的水平上。而对于在CTL诱导和继续培养中的任一过程都没有添加试样的对照组来说，其活性明显降低。
由此可知，由于在CTL诱导时和继续培养时添加了源于伽高迈海带的岩藻依聚糖、F-岩藻依聚糖、U-岩藻依聚糖和7-12SFd-F，所以不必在继续培养时附着由肽等引起的刺激，就可以完成保持了抗原特异细胞杀伤活性状态的CTL的继续培养。
实施例1-3(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导使用按与实施例1-1-(1)的方法进行分离、保存后的PBMC，按与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆CTL的诱导。此时，分别使用L.M.W.肝素(商品名Ardeparin sodium；CELSUSLABORATORIES INC.社制)、非膨润性褐藻酸(和光纯药社制)、膨润性褐藻酸(和光纯药社制)、制备例6-(1)制得的硫酸化葡萄糖钠盐、硫酸软骨素A钠(生化学工业社制)作为试样，以最终浓度10μg/ml添加到培养基中。以未添加试样的组作为对照。使用FLuMPA2.1作为抗原肽。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，但诱导时添加或不添加试样、试样不同，其细胞杀伤活性没有差别。(2)CTL的继续培养用与实施例1-1-(4)相同的方法对实施例1-3-(1)中制得的CTL进一步进行10～14天的继续培养。此时，以实施例1-3-(1)中诱导时添加的试样作为试样，以最终浓度10μg/ml添加到培养基中。对CTL诱导时未添加试样的对照组，继续不添加试样地进行培养。继续培养后，用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异细胞杀伤活性。测定结果如表3所示。
表3添加试样 细胞杀伤活性(％)试样附着肽CTLIL-2 E/T比诱导时 培养时 13 10对照 -- -17.4 26.5 35.2-- +28.0 43.8 63.7L.M.W.肝素 ++ - 11.7 14.2++ + 49.0 71.7非膨润性褐藻酸 ++ -12.9 24.8 14.0++ +28.1 52.7 77.1膨润性褐藻酸 ++ -12.5 26.5 22.2++ +39.8 75.3 86.9硫酸化葡萄糖 ++ -14.3 27.8 21.0++ +34.0 67.8 92.1硫酸化软骨素A++ -21.1++ +75.5结果表明，在CTL诱导时和继续培养时这两个阶段添加了试样的组，即使在继续培养后，其活性也维持在很高的水平上。而对于在CTL诱导和继续培养中的任一过程都没有添加试样的对照组来说，其活性明显降低。
由此可知，由于在CTL诱导时和继续培养时添加了与岩藻依聚糖同为硫酸化多糖的肝素、硫酸化软骨素A钠，所以不必在继续培养时附着由肽等引起的刺激，就可以完成保持了抗原特异细胞杀伤活性状态的CTL的继续培养。也就是说，即使是岩藻依聚糖以外的硫酸化多糖，也具有同样的活性。还可看出，由于除了硫酸化多糖以外，连作为硫酸化单糖的硫酸化葡萄糖钠盐也具有与岩藻依聚糖同样的活性，所以经硫酸化的糖，无论其大小如何，都具有维持细胞杀伤活性的效果。另一方面，由于并非硫酸化糖的非膨润性和膨润性褐藻酸也具有与岩藻依聚糖同样的活性，所以可以看出，上述活性并非硫酸化糖所特有，只要是酸性糖即可，无论糖的种类如何，均可发现其维持细胞杀伤活性的效果。
实施例1-4(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导使用按与实施例1-1-(1)的方法进行分离、保存后的PBMC，按与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆CTL的诱导。此时，分别使用果胶酸(ナカラィテスク社制)、制备例6-(2)制得的硫酸化岩藻糖钠盐、硫酸软骨素B钠(生化学工业社制)作为试样，以最终浓度10μg/ml添加到培养基中。以未添加试样的组作为对照。使用FLuMPA2.1作为抗原肽。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，但诱导时添加或不添加试样、试样不同，其细胞杀伤活性没有差别。(2)CTL的继续培养用与实施例1-1-(4)相同的方法对实施例1-4-(1)中制得的CTL进一步进行10～14天的继续培养。此时，将与实施例1-4-(1)中CTL诱导时添加的试样相同的试样，以最终浓度10μg/ml添加到培养基中。对CTL诱导时未添加试样的对照组，继续不添加试样地进行培养。继续培养后，用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异细胞杀伤活性。测定结果如表4所示。
表4添加试样细胞杀伤活性(％)试样 附着肽CTL IL-2 E/T比诱导时 培养时 2.5 510对照 - - - 0.5 4.0 N.T.
- - +10.919.7 N.T.果胶酸 + + - 3.4 5.5 N.T.
+ + +32.049.4 N.T.硫酸化岩藻糖 + + - 0 0 0.2+ + +17.636.6 55.3硫酸软骨素B+ + - 0 0 0.8+ + +28.138.1 60.7(N.T.表示未评价。)结果表明，在CTL诱导时和继续培养时这两个阶段添加了试样的组，即使在继续培养后，其活性也维持在很高的水平上。而对于在CTL诱导和继续培养中的任一过程都没有添加试样的对照组来说，其活性明显降低。
由此可知，属于硫酸化多糖的硫酸化软骨素B钠、属于硫酸化单糖的硫酸化岩藻糖钠盐、属于酸性多糖的果胶酸都具有维持细胞杀伤活性的效果。
实施例1-5(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导使用按与实施例1-1-(1)的方法进行分离、保存后的PBMC，按与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆CTL的诱导。此时，完全不添加上述实施例中所用的试样。使用FLuMPA2.1作为抗原肽。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。
(2)CTL的继续培养用与实施例1-1-(4)相同的方法对实施例1-5-(1)中制得的CTL进一步进行10～14天的继续培养。此时，分别以制备例1中制得的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖、制备例2中制得的III级分(F-岩藻依聚糖)、II级分(U-岩藻依聚糖)、L.M.W.肝素(商品名Ardeparin sodium；CELSUS LABROATORIES INC.社制)、果胶酸(ナカラィテスク社制)、非膨润性褐藻酸(和光纯药社制)、膨润性褐藻酸(和光纯药社制)、制备例6-(1)制得的硫酸化葡萄糖钠盐、制备例6-(2)制得的硫酸化岩藻糖钠盐、硫酸软骨素B钠(生化学工业社制)作为试样，以最终浓度10μg/ml添加。继续培养后，用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异细胞杀伤活性。测定结果如表5和6所示。
表5添加试样细胞杀伤活性(％)试样 附着肽CTL IL-2 E/T比诱导时 培养时 1 3 10对照 ---0 1.64.9--+5.67.013.7源于伽高迈海带 -+-0 0 3.1的岩藻依聚糖 -++7.011.0 27.9F-岩藻依聚糖 -+- 0 1.6-++ 7.420.4II-岩藻依聚糖 -+- 0 0-++ 7.617.5L.M.W.肝素 -+- 0-++ 18.3果胶酸 -+- 0-++ 16.5
表6添加试样 细胞杀伤活性(％)试样附着肽CTL IL-2 E/T比诱导时培养时 1 3 10对照 -- - 0 1.6 4.9-- + 5.6 7.0 13.7非膨润性褐藻酸 -+ - 3.9 4.6 6.1-+ + 9.5 13.824.9膨润性褐藻酸 -+ - 3.3 1.3 8.8-+ + 12.618.735.6硫酸化葡萄糖 -+ - 2.2 2.4 7.5-+ + 8.1 17.832.5硫酸化岩藻糖 -+ - 0 0.4 3.3-+ + 8.9 12.626.4硫酸软骨素B -+ - N.T.N.T.4.6-+ + N.T.N.T.24.0(N.T.表示未评价。)结果表明，对于CTL诱导时不添加试样，继续培养阶段添加了上述试样的组，即使在继续培养后，其活性也维持在很高的水平上。而对于在继续培养中没有添加试样的对照组来说，其活性明显降低。
由此可知，由于在继续培养时添加了源于伽高迈海带的岩藻依聚糖、F-岩藻依聚糖、U-岩藻依聚糖、L.M.W.肝素、果胶酸(ナカラィテスク社制)、非膨润性褐藻酸、膨润性褐藻酸、硫酸化葡萄糖钠盐、硫酸化岩藻糖钠盐、硫酸软骨素B钠，所以不必在继续培养时附着由肽等引起的刺激，就可以完成保持了抗原特异细胞杀伤活性状态的CTL的继续培养。也就是说，通过只在继续培养时添加酸性糖，可以继续培养保持了抗原特异细胞杀伤活性的CTL。
实施例1-6(1)抗流感病毒记忆CTL的诱导使用按实施例1-1-(1)的方法进行分离、保存后的PBMC，按与实施例1-1-(2)同样的方法进行抗流感病毒记忆CTL的诱导。此时，分别以制备例1中制得的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖、制备例2中制得的III级分(F-岩藻依聚糖)、II级分(U-岩藻依聚糖)为试样，以最终浓度10μg/ml添加到培养基中。使用FLuMPA2.1作为抗原肽。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，但诱导时添加或不添加试样、试样不同，其细胞杀伤活性没有差别。
(2)CTL的继续培养用与实施例1-1-(4)相同的方法对实施例1-6-(1)中制得的CTL进一步进行10～14天的继续培养。此时，设计将与实施例1-6-(1)中CTL诱导时添加的试样相同的试样，以最终浓度10μg/ml添加到培养基中的组和未添加试样的组。此外，对CTL诱导时未添加试样的对照组，继续不添加试样地进行培养。继续培养后，用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL的特异细胞杀伤活性。测定结果如表7所示。
表7添加试样 细胞杀伤活性(％)试样 附着肽CTL IL-2 E/T比诱导时 培养时 21030对照 - -- 4.6 5.0 13.1- -+11.0 23.4 47.9源于伽高迈+ +- 5.9 4.9 12.3海带的岩藻+ ++53.3 86.0 100.9依聚糖+ -- 0 0 4.5+ -+46.0 78.5 98.7F-岩藻依聚糖 + +- 2.1 2.4 7.2+ ++41.5 66.8 82.8+ -- 0 0 3.2+ -+37.6 63.5 86.3U-岩藻依聚糖 + +- 1.6 4.1 9.2+ ++46.3 75.2 92.3+ -- 0 0 4.5+ -+43.5 71.9 91.1
结果表明，对于在CTL诱导时添加了这些试样的组，无论继续培养是否添加了试样，继续培养后，其活性也维持在很高的水平上。而对于在CTL诱导和继续培养中的任一过程都没有添加这些试样(源于伽高迈海带的岩藻依聚糖)的对照组来说，其活性明显降低。
由此可知，对于CTL诱导时添加源于伽高迈海带的岩藻依聚糖等酸性多糖，继续培养时未添加的情况，不必附着由肽等引起的刺激，就可以在保持抗原特异细胞杀伤活性的状态下完成CTL的继续培养。
由上述结果可知，通过在CTL诱导时和继续培养时添加酸性糖，可以在长期保持抗原特异细胞杀伤活性的状态下继续培养CTL。另外，即使只在CTL诱导时或只在继续培养时添加酸性糖，也可以在长期保持抗原特异细胞杀伤活性的状态下继续培养CTL。实施例2保持了特异细胞杀伤活性的CTL的扩大培养按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，但诱导时添加或不添加试样，其细胞杀伤活性没有差别。(2)CTL的扩大培养用5HRPMI洗净实施例2-1-(1)制得的CTL后，得到5×104细胞/ml。另一方面，对用与实施例1-1-(1)同样的方法采取的HLA-A24和A2.1非保持异源(allogenic)PBMC进行X线照射(3300R)，用培养基洗净后，得到5×106细胞/ml。将这些CTL(2.5×104细胞)和异源PBMC(1.25×107细胞)悬浊在10ml的5HRPMI中，进一步添加最终浓度为50ng/ml的抗CD3抗体(ャンセン协和社制)，放入12.5cm2的烧瓶(ファルコン社制)中，在37℃湿式CO2孵育器中培养14天。此时，设计添加和未添加最终浓度为10μg/ml的来源于伽高迈的岩藻依聚糖试样的组。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2的5HRPMI 5ml。此时，向添加了试样的组的培养基中添加同浓度的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表8所示。用扩大培养后的细胞数除以扩大培养前的细胞数，从而求出扩大增殖率(×倍率)。
表8添加试样 细胞杀伤活性(％)肽试样 扩大 附着肽CTL 扩大 增殖率 E/T比诱导时 培养时 1 3 1030FluMPA对照- - ×494 - 2.5 1.2 2.0 8.42.1 - - ×494 + 5.214.738.8 70.3源于伽高迈 + + ×513 - 1.6 3.2 5.4 7.8海带的岩藻 + + ×513 + 22.247.487.0 108.3依聚糖 + - ×694 - 2.5 3.2 7.2 18.5+ - ×694 + 21.044.784.2 102.8- + ×488 - 2.1 2.2 5.8 7.8- + ×488 + 10.526.462.3 83.8FluNPA 对照 - - ×316 - 13.0 7.3 N.T.24- - ×316 + 22.750.8 N.T.
源于伽高迈 + + ×360 -0 0 N.T.
海带的岩藻 + + ×360 + 35.776.7 N.T.
依聚糖 + - ×338 - 4.8 9.4 N.T.
+ - ×338 + 48.685.1 N.T.
- + ×448 - 2.9 0 N.T.
- + ×448 + 26.776.2 N.T.(N.T.表示未评价。)结果表明，在CTL诱导时和扩大培养时添加了源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的组，其CTL即使在14天的扩大培养后还是具有特异且高的细胞杀伤活性。而在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程都没有添加了源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的组，其活性明显降低。此外，对于CTL诱导时未添加源于伽高迈海带的岩藻依聚糖而在用抗CD3抗体进行扩大培养时添加了源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的组，以及CTL诱导时添加了源于伽高迈海带的岩藻依聚糖而扩大培养时未添加的组，他们都可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。总之，由于至少在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程中添加源于伽高迈海带的岩藻依聚糖，从而可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，但诱导时添加或不添加试样、试样不同，其细胞杀伤活性没有差别。(2)CTL的扩大培养使用实施例2-2-(1)制得的CTL用与实施例2-1-(2)相同的方法进行CTL的扩大培养。此时，设计添加了与实施例2-2-(1)中CTL诱导时所添加的试样相同的试样且最终浓度分别为10μg/ml的组以及从诱导时开始就完全未添加试样的组。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2和10μg/ml试样的5HRPMI5ml。此时，对未添加试样的组，在更换培养基时不添加试样。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表9所示。
表9添加试样细胞杀伤活性(％)试样扩大附着肽CTL 扩大增殖率E/T比诱导时 培养时 10对照 - - ×332 -3.1- - ×332 + 59.7源于伽高迈海带+ + ×388 -2.4的岩藻依聚糖 + + ×388 + 85.2F-岩藻依聚糖 + + ×340 -2.1+ + ×340 + 77.7U-岩藻依聚糖 + + ×290 -1.2+ + ×290 + 81.6结果表明，在CTL诱导时和扩大培养时添加了这些试样的组，其CTL即使在14天的扩大培养后还是具有特异性高的细胞杀伤活性。而在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程都没有添加这些试样的组，其活性明显降低。总之，与岩藻依聚糖的结构、种类无关，通过在CTL诱导时和扩大培养时添加源于岩藻依聚糖，可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，但诱导时添加或不添加试样，其细胞杀伤活性没有差别。(2)CTL的扩大培养使用实施例2-3-(1)制得的CTL用与实施例2-1-(2)相同的方法进行CTL的扩大培养。此时，设计添加了与实施例2-3-(1)中CTL诱导时所添加的试样相同的试样且最终浓度分别为10μg/ml的组以及从诱导时开始就完全未添加试样的组。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2和10μg/ml 7-12SFd-F的5HRPMI 5ml。此时，对未添加试样的组，在更换培养基时不添加试样。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表10所示。
表10添加试样 细胞杀伤活性(％)试样扩大 附着肽CTL 扩大 培养率E/T比诱导时 培养时3 10对照 - - ×260 - 2.5 5.0- - ×260 + 54.284.37-12S + + ×178 - 2.8 0Fd-F + + ×178 + 67.093.7结果表明，在CTL诱导时和扩大培养时添加了7-12SFd-F的组，其CTL即使在14天的扩大培养后还是具有特异性高的细胞杀伤活性。而在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程都没有添加试样的组，其活性明显降低。总之，不只是诸如岩藻依聚糖等的高分子硫酸多糖，就连诸如作为F-岩藻依聚糖构成单元的7-12SFd-F的分子量小的硫酸化糖，通过在CTL诱导时和扩大培养时添加它们，也可以在长期保持特异且高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，但诱导时添加或不添加试样、试样不同，其细胞杀伤活性没有差别。(2)CTL的扩大培养使用实施例2-4-(1)制得的CTL用与实施例2-1-(2)相同的方法进行CTL的扩大培养。此时，设计添加了与实施例2-4-(1)中CTL诱导时所添加的试样相同的试样且最终浓度分别为10μg/ml的组以及从诱导时开始就完全未添加试样的组。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2和10μg/ml试样的5HRPMI5ml。此时，对未添加试样的组，在更换培养基时不添加试样。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表11所示。
表11添加试样 细胞杀伤活性(％)试样 扩大 附着肽CTL 扩大 增殖率E/T比诱导时 培养时 3 10对照 - - ×274 - 17.0 32.2- - ×274 + 44.2 66.0L.M.W.肝素 + + ×240 - 5.2 19.6+ + ×240 + 56.4 92.9果胶酸 + + ×160 - 11.6 7.3+ + ×160 + 47.0 69.8非膨润性褐藻酸 + + ×220 - 26.2 26.8+ + ×220 + 63.5 81.4膨润性褐藻酸 + + ×176 - 14.3 21.3+ + ×176 + 65.0101.6硫酸化葡萄糖 + + ×220 - 10.3 25.6+ + ×220 + 62.3127.4硫酸化岩藻糖 + + ×240 - 23.3+ + ×240 + 70.2硫酸软骨素A+ + ×280 - 0 5.3+ + ×280 + 56.7 89.0硫酸软骨素B+ + ×178 - 1.0 10.7+ + ×178 + 57.8 98.2结果表明，在CTL诱导时和扩大培养时添加了这些试样的组，其CTL即使在14天的扩大培养后还是具有特异性高的细胞杀伤活性。而在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程都没有添加试样的组，其活性明显降低。总之，不只是硫酸化糖，与糖的种类、修饰等无关，通过在CTL诱导时和扩大培养时添加酸性糖，可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。
(2)CTL的扩大培养使用实施例2-5-(1)制得的CTL用与实施例2-1-(2)相同的方法进行CTL的扩大培养。此时，设计添加了最终浓度分别为10μg/ml的试样的组以及未添加试样的组。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2和10μg/ml试样的5HRPMI 5ml。此时，对未添加试样的组，在更换培养基时不添加试样。使用制备例2中制得的III级分(F-岩藻依聚糖)作为试样。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表12所示。
表12添加试样 细胞杀伤活性(％)试样 扩大 附着肽CTL 扩大 增殖率 E/T比诱导时 培养时 1 3 10 30对照 -- ×393 - 1.51.03.15.9-- ×393 + 3.8 15.7 36.7 60.2F-岩藻依聚糖 -+ ×475 - 01.7-+ ×475 +40.7 76.3结果表明，在扩大培养时添加了F-岩藻依聚糖的组，其CTL即使在14天的扩大培养后还是具有特异性高的细胞杀伤活性。而在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程都没有添加试样的组，其活性明显降低。总之，即使不从诱导时就开始添 F-岩藻依聚糖，而是只在扩大培养时添加，也可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。
(2)CTL的扩大培养使用实施例2-6-(1)制得的CTL用与实施例2-1-(2)相同的方法进行CTL的扩大培养。此时，设计添加了最终浓度分别为10μg/ml的试样的组以及未添加试样的组。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2和10μg/ml试样的5HRPMI 5ml。此时，对未添加试样的组，在更换培养基时不添加试样。使用制备例1中制得的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖、制备例2中制得的II级分(U-岩藻依聚糖)、制备例3中制得的7-12SFd-F、L.M.W.肝素(商品名Ardeparin sodium；CELSUS LABORATORIES INC.社制)、果胶酸(ナカラィテスク社制)、非膨润性褐藻酸(和光纯药社制)、膨润性褐藻酸(和光纯药社制)、制备例6-(1)制得的硫酸化葡萄糖钠盐、制备例6-(2)制得的硫酸化岩藻糖钠盐、硫酸软骨素A钠(生化学工业社制)、硫酸软骨素B钠(生化学工业社制)作为试样。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表13和14所示。
表13添加试样细胞杀伤活性(％)试样 扩大 附着肽CTL 扩大 增殖率 E/T比诱导时 培养时 1 31030对照 - - ×403 - 0.8 1.9 4.5 9.9- - ×403 + 6.5 16.0 31.9 53.2源于伽高迈海带- + ×425 - 0 0 3.9 12.3的岩藻依聚糖 - + ×425 + 13.1 18.3 40.3 72.4U-岩藻依聚糖 - + ×358 - 0 0 2.9 5.3- + ×358 + 13.2 25.9 45.6 69.47-12S - + ×310 - 2.7 0 1.0 3.5Fd-F - + ×310 + 14.1 20.1 41.7 64.6L.M.W.- + ×353 - 1.4 0 0.6 2.5肝素 - + ×353 + 11.3 22.2 43.9 71.2果胶酸- + ×350 - 2.3 4.1 8.2 15.9- + ×350 + 18.2 33.3 64.2 87.8
表14添加试样 细胞杀伤活性(％)试样扩大 附着肽CTL 扩大 增殖率E/T比诱导时 培养时 1 3 10 30对照 - - ×403 - 0.81.9 4.5 9.9- - ×403 + 6.516.031.953.2非膨润性褐藻酸 - + ×335 - 0.55.2 6.5 14.4- + ×335 + 13.5 24.150.476.0膨润性褐藻酸 - + ×378 - 0.10 2.1 10.6- + ×378 + 15.4 22.047.881.7硫酸化葡萄糖 - + ×343 - 2.80 0 3.6- + ×343 + 11.0 18.039.559.0硫酸化岩藻糖 - + ×448 - 0 1.3- + ×448 + 32.564.9硫酸软骨素A- + ×383 - 6.35.6 7.5 18.8- + ×383 + 8.018.736.667.6硫酸软骨素B- + ×383 - 3.94.4 8.3 11.8- + ×383 + 15.2 27.248.176.2结果表明，在扩大培养时添加了这些试样的组，其CTL即使在14天的扩大培养后还是具有特异性高的细胞杀伤活性。而在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程都没有添加试样的组，其活性明显降低。总之，即使不从诱导时就开始添加酸性糖，而是只在扩大培养时添加，也可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，但诱导时添加或不添加试样、试样不同，其细胞杀伤活性没有差别。
(2)CTL的扩大培养使用实施例2-7-(1)制得的CTL用与实施例2-1-(2)相同的方法进行CTL的扩大培养。此时，设计添加了与实施例2-7-(1)中CTL诱导时所添加的试样相同的试样的组以及未添加试样的对照组。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2和10μg/ml试样的5HRPMI 5ml。此时，对未添加试样的组，在更换培养基时不添加试样。扩大培养开始后，在第1 4天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表15所示。
表15添加试样 细胞杀伤活性(％)试样 扩大附着肽CTL 扩大 增殖率E/T比诱导时 培养时 1 3 10 30对照 -- ×393 - 1.51.03.15.9-- ×393 + 3.615.7 36.7 60.2源于伽高迈 ++ ×310 - 2.53.80 2.0海带的岩藻 ++ ×310 + 15.1 30.9 76.7 77.9依聚糖 +- ×166 - 5.62.45.912.2+- ×166 + 15.3 30.2 65.2 88.3F-岩藻依聚糖 ++ ×278 - 1.51.24.41.3++ ×310 + 9.221.2 41.9 65.4+- ×175 - 2.20.81.22.4+- ×175 + 6.716.3 47.3 74.4U-岩藻依聚糖 ++ ×214 - 3.4++ ×214 + 66.7+- ×173 - 7.18.98.811.5+- ×173 + 10.6 23.2 46.0 77.07-12SFd ++ ×258 - 0 0 0 1.6-F ++ ×258 + 9.423.4 44.2 82.1+- ×283 - 6.76.59.39.8+- ×283 + 14.0 34.6 50.4 83.5L.M.W. ++ ×243 - 5.62.51.10.9肝素 ++ ×243 + 16.3 22.7 43.9 72.8+- ×253 - 5.24.56.67.0+- ×253 + 12.5 26.9 57.8 83.7结果表明，在CTL诱导时和扩大培养时两过程中添加了这些试样的组、只在CTL诱导时添加这些试样的组，它们的CTL即使在14天的扩大培养后还是具有特异性高的细胞杀伤活性。而在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程都没有添加源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的组，其活性明显降低。总之，只要在诱导时添加酸性糖，无论扩大培养时是否添加酸性糖，都可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
根据以上结果可以明确，通过在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程或两过程中添加酸性糖，可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。实施例3 与REM法的比较以及与REM法的组合按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。(2)CTL的扩大培养用5HRPMI洗净实施例3-1-(1)制得的CTL后，得到5×104细胞/ml。另一方面，对用与实施例1-1-(1)同样的方法采取的HLA-A24和A2.1非保持异源PBMC进行X线照射(3300R)，用培养基洗净后，得到5×106细胞/ml。将这些CTL(2.5×104细胞)和异源PBMC(1.25×107细胞)悬浊在10ml的5HRPMI中，进一步添加最终浓度为50ng/ml的抗CD3抗体(ャンセン协和社制)，放入12.5cm2的烧瓶(ファルコン社制)中，在37℃湿式CO2孵育器中培养14天。此时，设计添加和未添加最终浓度为10μg/ml的制备例1中制得的来源于伽高迈的岩藻依聚糖试样的组。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2的5HRPMI 5ml。此时，向添加了试样的组的培养基中添加制备例1中制得的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖以使终浓度为10μg/ml。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表16所示。
另一方面，按REM法实施以下的扩大培养。对HLA-A24和A2.1非保持异源PBMC进行X线照射(3300R)，用培养基洗净后，得到5×106细胞/ml。用X线照射(8000R)照射Epstein-Barr Virs感染人B细胞株(EBV-B细胞)，用培养基洗净后，得到1×106细胞/ml。将实施例3-1-(1)中制得的CTL(2.5×104细胞)和异源PBMC(1.25×107细胞)、EBV-B细胞(2.5×106细胞)悬浊在10ml的5HRPMI中，进一步添加最终浓度为50ng/ml的抗CD3抗体(ャンセン协和社制)，放入12.5cm2的烧瓶(ファルコン社制)中，在37℃湿式CO2孵育器中培养14天。此时，设计添加和未添加最终浓度为10μg/ml的制备例1中制得的来源于伽高迈的岩藻依聚糖试样的组。除了EBV-B细胞以外，对其它与上述同样地调制的烧瓶也进行与上述相同的培养。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2的5HRPMI 5ml。此时，向添加了试样的组的培养基中添加最终浓度为10μg/ml的制备例1中制得的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表17所示。
表16试样 添加试样 添加 扩大 细胞杀伤活性(％)EBV-B增殖率 附着肽CTL 扩大 细胞 E/T比诱导时 培养时3 10 30对照 -- - ×494 - 1.22.0 8.4-- - ×494 + 14.7 38.870.3源于伽高迈 -+ - ×694 - 2.25.8 7.8海带的岩藻 -+ - ×694 + 26.4 62.383.8依聚糖 +- - ×488 - 3.27.218.5+- - ×488 + 44.7 84.2 102.6++ - ×513 - 3.25.4 7.6++ - ×513 + 47.4 87.0 108.3
表17试样 添加试样 添加扩大 细胞杀伤活性(％)EBV-B 增殖率 附着肽CTL 扩大 细胞 E/T比诱导时 培养时 3 10 30对照 - - - ×494 - 1.22.08.4- - - ×494 +14.7 38.8 70.3REM法 - - + ×713 - 0 04.8- - + ×713 +27.5 68.4 94.9REM法+ - + + ×656 - 0.80.8 0源于伽高迈 - + + ×656 +35.2 74.1 102.8海带的岩藻 + - + ×662 - 1.11.86.2依聚糖 + - + ×662 +72.7 95.3 92.8+ + + ×638 - 01.54.8+ + + ×638 +65.0 88.5 98.6结果表明，未添加源于伽高迈海带的岩藻依聚糖而进行诱导的CTL(未添加CTL诱导剂)，用REM法进行扩大培养时，可以维持高的细胞杀伤活性。但是用未使用EBV-B细胞的REM法进行扩大培养时，其细胞杀伤活性显著降低。
而在CTL诱导时和扩大培养时两过程添加了源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的组，或在其中一个过程添加了试样的组，即使不添加EBV-B细胞，经14天的大量培养后的CTL还是可以维持较高的细胞杀伤活性。此外，与REM法比较，按本发明扩大培养后的抗原特异细胞杀伤活性高。
还有，用REM法扩大培养的情况下，与用REM法对用以往技术诱导的CTL细胞进行扩大培养的方法相比，在扩大培养时，首先从CTL诱导时开始就添加本发明方法的具有维持CTL活性效果的化合物之一的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的方法，更能将细胞杀伤活性维持在很高的水平。
总之，根据本发明，对于添加具有维持CTL活性效果的化合物的扩大培养方法，不需要REM法中所必须的EBV-B细胞，可以回避使用EBV-B细胞的危险性。还可维持比REM法更高的CTL活性。由此，本发明的CTL细胞扩大方法与REM法相比，从安全方面考虑是很优异的方法。
此外，将本发明所用的化合物引入到REM法中，可以对保持更高活性的CTL进行扩大培养。也就是说，本发明所用的化合物可以适用于所有的CTL扩大培养方法，通过在各种CTL扩大培养方法使用本发明所用的化合物，可以长期维持特异且高的细胞杀伤活性。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。使用FluMPA2.1作为抗原肽。(2)CTL的扩大培养对实施例3-2-(1)制得的CTL进行与实施例3-1-(2)相同的扩大培养。此时，设计添加使最终浓度为10μg/ml的透明质酸和未添加的组。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/mlIL-2的5HRPMI 5ml。此时，向添加了试样的组的培养基中添加透明质酸使最终浓度为10μg/ml。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表18所示。
表18试样 添加试样 添加 扩大 细胞杀伤活性(％)EBV-B增殖率 附着肽CTL 扩大细胞E/T比诱导时 培养时10对照 - - - ×392 -6.2- - - ×392 + 10.6透明质酸 + + - ×335 -2.3+ + - ×335 + 60.0REM法 - - + ×427 - 11.5- - + ×427 + 52.8REM法++ + + ×587 -8.1透明质酸 + + + ×587 + 95.5结果表明，未添加透明质酸而进行诱导的CTL(未添加维持CTL活性的试剂)，用REM法进行扩大培养时，可以维持高的细胞杀伤活性。但是用未使用EBV-B细胞的REM法进行扩大培养时，其细胞杀伤活性显著降低。
另一方面，只要在CTL诱导时和扩大培养时两过程添加了透明质酸，即使不添加EBV-B细胞，经14天的大量培养后的CTL还是可以维持较高的细胞杀伤活性。此外，与REM法比较，按本发明扩大培养后的抗原特异细胞杀伤活性高。
还有，与用REM法扩大培养的情况下，用REM法对用以往技术诱导的CTL细胞进行扩大培养的方法相比，在扩大培养时，首先从CTL诱导时开始就添加本发明方法的具有维持CTL活性效果的化合物之一透明质酸的方法，更能将细胞杀伤活性维持在很高的水平。
总之，在本发明的CTL扩大培养方法中，不需要REM法中所必须的EBV-B细胞，可以回避使用EBV-B细胞的危险性。还可维持比REM法更高的CTL活性。由此，本发明的CTL细胞扩大方法与REM法相比，从安全方面考虑是很优异的方法。
此外，将透明质酸引入到REM法中，可以保持更高活性，透明质酸可以适用于所有的CTL扩大培养方法，通过在各种CTL扩大培养方法使用本发明所用的化合物，可以在长期维持特异性高的细胞杀伤活性的状态下，进行CTL扩大培养。实施例4 使用透明质酸所进行的保持特异细胞杀伤活性的CTL的扩大培养按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，但诱导时添加或不添加试样，其细胞杀伤活性几乎没有差别。
(2)CTL的扩大培养对实施例4-1-(1)制得的CTL进行与实施例2-1-(2)相同的CTL扩大培养。此时，设计添加了实施例4-1-(1)中CTL诱导时所添加的透明质酸使最终浓度为10μg/ml的组和从诱导时开始就完全未添加透明质酸的组。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2和10μg/ml透明质酸的5HRPMI 5ml。此时，未添加透明质酸的组，其更换培养基时不添加试样。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表19所示。
表19添加试样 细胞杀伤活性(％)试样扩大附着肽CTL 扩大 增殖率 E/T比诱导时 培养时 1 3 10 30对照 - - ×547 - 7.38.49.112.7- - ×547 + 8.1 11.2 21.545.9透明质酸 + + ×493 - 7.38.6 13.117.0+ + ×493 + 31.1 49.8 90.8 105.6结果表明，对于在CTL诱导时和扩大培养时添加了透明质酸的组，其CTL即使在14天的扩大培养后，也还具有特异性高的细胞杀伤活性。而在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程都没有添加试样的组，其活性明显降低。总之，在CTL诱导时和扩大培养时添加透明质酸，可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，但诱导时添加或不添加试样，其细胞杀伤活性没有差别。
(2)CTL的扩大培养对实施例4-2-(1)制得的CTL进行与实施例2-1-(2)相同的CTL扩大培养。此时，完全不添加实施例4-2-(1)中CTL诱导时所添加的透明质酸。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2的5HRPMI 5ml。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表20所示。
表20添加试样 细胞杀伤活性(％)试样 扩大附着肽CTL扩大 增殖率E/T比诱导时 培养时1 3 10 30对照 - - ×480 - 0 0 0.46.8- - ×480 + 4 11.2 29.3 59.7透明质 + + ×423 - 0 0 1.914.3+ + ×423 + 7.2 23.3 59.6 85.1+ - ×393 - 3.0 1.44.79.3+ - ×393 + 9.9 22.1 47.7 78.0结果表明，对于只在CTL诱导时添加了透明质酸的组，即使在扩大培养时不添加透明质酸，其CTL14天的扩大培养后，也还具有特异性高的细胞杀伤活性。而在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程都没有添加透明质酸的组，其活性明显降低。总之，通过只在CTL诱导时添加透明质酸，可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。实施例5保持肿瘤关联抗原特异细胞杀伤活性的CTL的扩大培养培养开始后第4天，除去一半培养上清液后，向各孔添加含有60U/ml的IL-2和10μg/ml的L.M.W肝素或透明质酸的5HRPMI 1ml(作为对照的是只含有IL-2)。
在第7天，与前述相同地调制抗原呈递细胞后，用X线照射(5500R)，调制成4×106细胞/ml。将培养了一周的应答细胞悬浊在5HRPMI中，使其达到2×106细胞/ml，与制得的抗原呈递细胞等量混合，以1ml/孔添加到24孔细胞培养板中，然后添加最终浓度为25ng/ml的IL-7进行再刺激。此时添加L.M.W肝素或透明质酸，使其最终浓度为10μg/ml(对照组为未添加的)。再刺激后的第一天，向各孔中添加含有60U/ml IL-2和10μg/ml的L.M.W肝素或透明质酸(对照组只含有IL-2)的5HRPMI 1ml，此外，在第3天，将培养上清液除去一半后，添加与除去前所含物质相同的培养基各1ml。在一周内再进行l次同样的再刺激，共实施4次，诱导CTL。
(2)CTL细胞杀伤活性的测定根据与实施例1-1-(3)同样的方法对实施例5-1-(1)中制得的诱导开始后第35天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。作为标记靶细胞，使用与抗原决定肽共培养一夜、或在无抗原决定肽存在下培养一夜的保持有HLA-A2.1的EBV转化B细胞(细胞名221A2.1)。
其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，诱导时添加或不添加L.M.W肝素和透明质酸，其细胞杀伤活性没有差别。(3)CTL的扩大培养使用实施例5-1-(1)中制得CTL、用与实施例2-1-(2)相同的方法进行CTL扩大培养。此时，设计添加了使最终浓度为10μg/ml的实施例5-1-(1)中CTL诱导时所添加的L.M.W肝素或透明质酸的组以及从诱导开始时就完全没有添加的组。这期间完全未附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2和L.M.W肝素或透明质酸10μg/ml的5HRPMI 5ml。未添加试样的组，更换培养基时不添加试样。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表21所示。
表21添加试样 细胞杀伤活性(％)试样 扩大 附着肽CTL 扩大增殖率E/T比诱导时 培养时 2 6对照 - - ×237 -0 0- - ×237 + 29.8 56E/T比3 9L.M.W.+ + ×433 - 2.6 3.7肝素 + + ×433 + 65.3 104.8E/T比2 6透明质酸 + + ×217 - 3.6 0+ + ×217 + 50.367.7结果表明，在CTL诱导时和扩大培养时添加了L.M.W肝素或透明质酸的组，其CTL即使在14天的扩大培养后还是具有特异且高的细胞杀伤活性。而在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程都没有添加这些试样的组，其活性明显降低。总之，在抗肿瘤关联抗原(MAGE3)CTL的扩大培养时，通过在CTL诱导时和扩大培养时添加L.M.W肝素或透明质酸，可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。
根据与实施例1-1-(3)同样的方法对如此制得的刚诱导完的CTL的细胞杀伤活性进行评价。使用以下细胞作为标记靶细胞，即，在无抗原决定肽存在下培养的保持有HLA-A2.1的EBV转化B细胞(细胞名221A2.1)，在100U/ml IFN-γ存在下培养两晚的保持有HLA-A2.1的癌细胞株(细胞名624mel；HLA-A2.1保持MART1表达细胞)或未保持有HLA-A2.1的癌细胞株(细胞名888mel；HLA-A2.1非保持MART1表达细胞)。
其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，诱导时添加或不添加试样，其细胞杀伤活性几乎没有差别。(2)CTL的扩大培养使用实施例5-2-(1)中制得CTL、用与实施例2-1-(2)相同的方法进行CTL扩大培养。此时，设计添加了以使最终浓度为10μg/ml的实施例5-2-(1)中所添加的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖或透明质酸的组以及从诱导开始时就完全没有添加的组。这期间完全未附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2和源于伽高迈海带的岩藻依聚糖或透明质酸10μg/ml的5HRPMI 5ml。未添加试样的组，更换培养基时不添加试样。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。测定结果如表22所示。
表22添加试样细胞杀伤活性(％)试样 扩大附着肽标记CTL扩大 增殖率靶细胞 E/T比诱导时 培养时27 20对照 - - ×287 - 221A2.1 03.8 4.1- - ×287 + 221A2.1 8.1 27.543.5- - ×287 - 888mel32.5 44.843.7- - ×287 - 624mel27.4 55.881.6E/T比26 17源于伽高迈+ + ×240 - 221A2.1 00 0海带的岩藻+ + ×240 + 221A2.1 28.8 63.284.0依聚糖+ + ×240 - 888mel8.2 22.419.2+ + ×240 - 624mel40.7 78.592.2E/T比26 17透明质酸 + + ×217 - 221A2.1 00 0+ + ×217 + 221A2.1 9.1 52.874.4+ + ×217 - 888mel00 0+ + ×217 - 624mel29.6 73.890.6结果表明，在CTL诱导时和扩大培养时添加了源于伽高迈海带的岩藻依聚糖或透明质酸的组，其CTL即使在14天的扩大培养后还是具有特异性高的细胞杀伤活性。而在CTL诱导时和扩大培养时的任一过程都没有添加这些试样的组，其活性明显降低。此外，对于对肿瘤细胞株的特异杀伤活性来说，在CTL诱导时和扩大培养时添加了源于伽高迈海带的岩藻依聚糖或透明质酸的组，其CTL即使在14天的扩大培养后还是具有特异性高的细胞杀伤活性。总之，在抗肿瘤关联抗原(MAGE3)CTL的扩大培养时，通过在CTL诱导时和扩大培养时添加源于伽高迈海带的岩藻依聚糖或透明质酸，可以在长期保持特异性高的细胞杀伤活性的状态下进行CTL的扩大培养。实施例6使用抗体结合磁珠的细胞选择按与实施例1-1-(3)相同的方法对如此制得的诱导开始后第14天的CTL的细胞杀伤活性进行评价。其结果为，刚刚诱导完成就诱导出特异细胞杀伤活性，诱导时添加或不添加试样，其细胞杀伤活性几乎没有差别。(2)CTL的扩大培养对实施例6-1-(1)制得的CTL用与实施例3-1-(2)相同的方法进行CTL扩大培养。此时，设计添加和未添加最终浓度为10μg/ml的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的组。此时，不附着由肽引起的刺激，在培养开始的第一天添加最终浓度为120U/ml的IL-2，再在培养开始后的第4天以后每隔2～3天除去培养上清液的一半，然后，向各烧瓶中添加含有60U/ml IL-2的5HRPMI 5ml。此时，向添加了试样的组的培养基中添加使最终浓度为10μg/ml的源于伽高迈海带的岩藻依聚糖。扩大培养开始后，在第14天用与实施例1-1-(3)同样的方法测定CTL特异细胞杀伤活性。(3)使用抗体结合磁珠的细胞选择将实施例6-1-(2)制得的扩大培养后的CTL用经冰冷却的2％FBS/PBS洗净，然后用同样的缓冲液调整为1×107细胞/ml。向这些细胞悬浊液中每1×107细胞细胞添加150μl的事先用经冰冷却的2％FBS/PBS洗净的Dynabeads M-450 CD4(抗CD4抗体结合磁珠ダィナル社制)。在4℃下边缓缓震荡含有珠的细胞悬浊液，边孵育30分钟。向装有孵育后的细胞悬浊液的管中加入经冰冷却的2％FBS/PBS使用Dynabeads用磁石台(ダィナル社制)除去珠和珠结合细胞。使用流式细胞计数器对如此所得的抗CD4抗体结合珠非结合细胞集团和选择前的细胞集团的CD8+细胞的含有率进行确认。其结果如表23所示。用与实施例1-1-(3)同样的方法比较CTL的特异细胞杀伤活性。其结果如表24所示。
表23试样添加试样添加 CD8+细胞含有率(％)EBV-BCTL扩大细胞选择前 选择后诱导时 培养时对照 - - - 18.188.0源于伽高迈海带 + + - 32.597.2的岩藻依聚糖REM法+ + + + 55.897.3源于伽高迈海带的岩藻依聚糖表24添加试样添加 细胞杀伤活性(％)试样EBV-B 附着肽 (E/T比＝30)CTL扩大细胞诱导时 培养时选择前选择后对照 - - - - 10.4 9.4- - - + 24.0 21.1源于伽高迈海带 + + - - 7.6 8.4的岩藻依聚糖 + + - + 41.8 75.3REM法+ + + + - 4.2 6.7源于伽高迈海带 + + + + 87.8 88.2的岩藻依聚糖结果表明，CTL诱导时和扩大培养时添加了源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的组，使用抗体结合珠进行细胞选择，其细胞杀伤活性可进一步提高。而使用REM法扩大培养的CTL，即使用抗体结合珠进行细胞选择，其细胞杀伤活性也没有变化。此外，将REM法与添加源于伽高迈海带的岩藻依聚糖的方法并用，在此条件下进行扩大培养，然后使用抗体结合珠进行细胞选择，其细胞杀伤活性可进一步提高。
委托保藏的生物材料(1)委托保藏机构的名称和地址独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6(邮政编码305-8566)(2)委托保藏微生物(i)交替单胞菌属(Alteromonas)sp.SN-1009原保藏日1996年2月13日提交国际保藏的申请日1996年11月15日保藏号FERM BP-5747(ii)黄杆菌属(Flavobacterium)sp.SA-0082原保藏日1995年3月29日提交国际保藏的申请日1996年2月15日保藏号FERM BP-5402序列表说明序列号1为基于源于流感病毒的核蛋白而设计的HLA A24结合性肽。
序列号2为基于源于流感病毒的基质蛋白而设计的HLA A2.1结合性肽。
序列号3为基于源于黑色素瘤抗原MAGE3的HLA A2.1结合性肽而设计的肽。
序列号4为基于源于黑色素瘤抗原MART1的HLA A2.1结合性肽而设计的肽。
产业上的可利用性本发明提供对保持有高水平的抗原特异细胞杀伤活性的CTL进行诱导、维持以及扩大培养的方法。该方法在必须使用大量CTL的继承免疫疗法等细胞治疗领域极为有用。此外，以安全的方法制备的角度考虑，按本方法制得的CTL是安全性极高的细胞药物。
序列表<110>宝生物有限公司<120>抗原特异细胞毒性T细胞的扩大培养方法<130>01-056-PCT<150>JP 2000-247072<151>2000-08-16<160>4<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>基于源于流感病毒的核蛋白而设计的肽<400>1Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu5 10<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>基于源于流感病毒的基质蛋白而设计的肽<400>2Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu5<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>基于源于黑色素瘤抗原MAGE3的HLA A2.1结合性肽而设计的肽<400>3Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val5<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>基于源于黑色素瘤抗原MART1的HLA A2.1结合性肽而设计的肽<400>4Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val权利要求
1.诱导具有抗原特异的细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，包含在选自酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖以及它们的盐中的至少1种化合物的存在下，将具有细胞毒性T细胞分化能力的前体细胞和抗原呈递细胞孵育的工序。
2.根据权利要求1的方法，其中化合物为选自岩藻依聚糖、肝素、褐藻酸、硫酸化软骨素A、硫酸化软骨素B、果胶酸、透明质酸、岩藻依聚糖分解物、硫酸化葡萄糖、硫酸化岩藻糖以及它们的盐中的至少一种化合物。
3.维持具有抗原特异的细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，包含在选自酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖以及它们的盐中的至少1种化合物的存在下，对细胞毒性T细胞进行继续培养的工序。
4.根据权利要求3的方法，其中化合物为选自岩藻依聚糖、肝素、褐藻酸、硫酸化软骨素A、硫酸化软骨素B、果胶酸、透明质酸、岩藻依聚糖分解物、硫酸化葡萄糖、硫酸岩藻糖以及它们的盐中的至少一种化合物。
5.扩大培养具有抗原特异的细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，包含在选自酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖以及它们的盐中的至少1中化合物的存在下，对细胞毒性T细胞进行孵育的工序。
6.根据权利要求5的方法，其中，所述工序中进一步在抗CD3抗体的存在下孵育细胞毒性T细胞。
7.根据权利要求5或6的方法，其中，所述工序中将细胞毒性T细胞与饲养细胞一起孵育。
8.根据权利要求7的方法，其中饲养细胞为非病毒感染细胞。
9.根据权利要求5～8任一的方法，其中化合物为选自岩藻依聚糖、肝素、褐藻酸、硫酸化软骨素A、硫酸化软骨素B、果胶酸、透明质酸、岩藻依聚糖分解物、硫酸化葡萄糖、硫酸化岩藻糖以及它们的盐中的至少一种化合物。
10.回收细胞毒性T细胞的方法，其包含从按权利要求1～9任一的方法得到的含细胞毒性T细胞的培养物中选择出具有抗原特异的细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞含量高的细胞团的工序。
11.用权利要求1～10中任一所述的方法调制的具有抗原特异的细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞。
12.治疗剂，其特征在于，含有权利要求11所述的细胞毒性T细胞作为有效成分。
全文摘要
本发明提供一种诱导、维持以及扩大培养将抗原特异的细胞毒性维持在高水平的CTL(细胞抑制性T细胞)的方法，其使用选自酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖以及它们的盐中的至少一种化合物作为有效成分，适用于继承性免疫疗法。前述化合物可举出，岩藻依聚糖、肝素、褐藻酸、硫酸化软骨素A、硫酸化软骨素B、果胶酸、透明质酸、岩藻依聚糖分解物、硫酸化葡萄糖、硫酸化岩藻糖以及它们的盐。
文档编号A61K35/14GK1469923SQ01817466
公开日2004年1月21日 申请日期2001年8月15日 优先权日2000年8月16日
发明者佐川裕章, 出野美津子, 津子, 之进, 加藤郁之进 申请人:宝生物工程株式会社