载脂蛋白类似物的制作方法

专利名称：载脂蛋白类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及载脂蛋白构建体，用作药物的载脂蛋白构建体，编码载脂蛋白构建体的核酸序列，含有该核酸序列的载体，产生载脂蛋白构建体的方法，含有载脂蛋白构建体的药物组合物，以及载脂蛋白构建体在制备药物组合物中的用途。
现有技术下文将使用术语Apo A或载脂蛋白A来称呼载脂蛋白A I，载脂蛋白A II或载脂蛋白A IV中的任何一种。
在全球工业化国家中，由血管粥样硬化导致的心血管病是最常见的死因。导致粥样硬化的其中一种致病因子是胆固醇沉积于血管壁，导致斑块形成并最终导致粥样硬化，增加梗塞的风险。
载脂蛋白A-1(apo-A-1)是血浆HDL(高密度脂蛋白)的主要成分，它与粥样硬化的存在负相关。有实验证据清楚表明这一效果是自外周组织至肝脏的所谓反向胆固醇转运所导致的。也有实验证据表明通过注射apo-A-1可刺激哺乳动物中的反向胆固醇转运。
载脂蛋白A-1从血浆中快速地被清除。据信大部分Apo-A-1无需先进行断裂，通过肾脏的过滤即可从血浆中除去(Braschi等，1999，J Lipid Res，40522-532；Braschi等，2000，Biochemistry，395441-5449；Glass等，1983，J BiolChem 2587161-7167)。载脂蛋白A在血浆中的短暂半寿期是使用该蛋白质治疗粥样硬化的限制因素。
US 5,876,968(SIRTORI等)涉及基本上纯的apo-A-1变体的二聚体，它被称为载脂蛋白A-1-Milano。含有该二聚体的药物可用于防止血栓形成，或者可用作单体的前药。apo-A-I的这一特殊变体的特征是它能与自身形成共价二聚体。作者推测Apo A-I-M的存在可能是血浆半寿期延长的原因，但未提供结论性数据。
US 5,643,757(SHA-IL等)公开了以高得率生产纯的、稳定的、成熟的并具有生物活性的人载脂蛋白A-I的方法。
US 5,990,081(AGELAND等)公开了通过施用治疗有效量的载脂蛋白A或载脂蛋白E以治疗粥样硬化或心血管病的方法。
WO 96/37608(RHONE-POULENC ROHRER等)描述了第151位含有半胱氨酸的载脂蛋白A-I变体的人同源二聚体。氨基酸序列中半胱氨酸残基的存在使得能通过单体之间的二硫键形成二聚体。该文献还公开了相应的核酸序列和含有该核酸序列的载体，以及含有所述变体的药物组合物及其在基因治疗中的用途。
WO 90/12879(Sirtori等)和WO 94/13819(Kabi Pharmacia)分别公开了在酵母和大肠杆菌中制备ApoA-I和ApoA-IM的方法。该文献还公开了ApoA-I和ApoA-IM用作治疗粥样硬化和心血管病之药物的用途。
最后，现有技术主要涉及天然ApoA-I或ApoA-IM单体或ApoA-IM-二聚体用作治疗血管病之药物的用途，而不管这些蛋白质的已知缺点(主要是快速清除)如何。现有技术未暗示修饰ApoA-I以获得进行反向胆固醇转运的能力增强和/或血浆半寿期延长的构建体。因此，本发明的一个目的是提供这种ApoA构建体，它可用于治疗和/或预防心血管病。
发明简述本发明的第一方面涉及可用作药物的载脂蛋白构建体，其具有通式-apo A-X，-其中apo A是选自载脂蛋白AI，载脂蛋白AII，载脂蛋白AIV，其类似物或变体的载脂蛋白A组分，-X是异源组成成分，其含有至少一种选自下列的化合物氨基酸，肽，蛋白质，糖类和核酸序列，-附带的条件是当构建体由确切的两个相同天然载脂蛋白组成时，它们被连续地连接。
本发明提供了可用作药物的新构建体。现有技术未教导本发明所定义的药用载脂蛋白构建体。可将本发明的载脂蛋白构建体宽泛地看成是HDL类似物，因为它们能与胆固醇和其它脂质形成复合物，并有助于将这些化合物转运至肝脏中。
在本发明的上下文中，将载脂蛋白组分或构建体的一部分称为apo A或载脂蛋白。在下文和权利要求书中，将异源组成成分称为构建体的组分X。载脂蛋白或其类似物或变体与异源组成成分共价连接。
可将构建体的组分X宽泛地看成是异源组成成分。在上下文中，异源组成成分是在天然条件下不与载脂蛋白或其类似物或变体或功能等同物连接的任何类型的组成成分。因此，异源组成成分可以是来源于相同或不同物种的肽或蛋白质或肽或蛋白质的一部分，或甚至是单个氨基酸。它可以是合成肽。它可以具有糖类的性质或其它聚合的和生物相容的性质，例如聚醇，核酸序列。
使用脂质结合试验可以方便地测定天然载脂蛋白A-I，A-II或A-IV的功能等同物。通过测定试验生物，如兔或啮齿类动物，如小鼠进行反向胆固醇转运的能力，可以方便地测定构建体在哺乳动物中引发基本上相同的生理反应的能力。
尽管存在加入异源组成成分所导致的修饰，含有载脂蛋白和异源组成成分的构建体仍能进行反向胆固醇转运，或者，其转运能力甚至优于天然载脂蛋白。与野生型载脂蛋白的血浆半寿期相比，优选构建体的血浆半寿期增加。半寿期增加的原因可能是载脂蛋白构建体的大小增加，从而降低了经肾脏过滤的速率，也可能是与HDL的结合增加，或者是与天然Apo A相比，构建体不易断裂。
优选血浆半寿期至少增加至两倍或三倍，或至少四倍，或至少10倍。类似地，与野生型载脂蛋白相比，优选构建体的结合亲和性，如脂质结合亲和性，和/或胆固醇结合亲和性也有所增加。优选脂质结合亲和性增加至少5％，如至少10％，例如至少15％，如至少20％，例如至少25％，如至少30％，例如至少40％，如至少50％，例如至少75％，如至少100％，如至少150％，例如至少200％，如至少300％。甚至在本发明构建体的脂质结合亲和性等于或低于天然载脂蛋白的脂质结合亲和性的情况下，由于本发明构建体的血浆半寿期增加，其临床疗效仍可能会增强。
增加的血浆半寿期和/或增加的脂质结合亲和性强烈暗示载脂蛋白构建体在治疗粥样硬化中的用途。因此，本发明的载脂蛋白构建体的临床疗效有望超过野生型载脂蛋白的疗效。
本发明还包括能在哺乳动物中引发基本上相同的生理反应的野生型载脂蛋白类似物或变体。
根据本发明的第二方面，提供了具有下列通式的载脂蛋白构建体-apo A-X，
-其中apo A是选自载脂蛋白AI，载脂蛋白AII，载脂蛋白AIV，其类似物或变体的载脂蛋白组分，-X是选自寡聚化组件和末端被连接的载脂蛋白的异源组成成分。
根据本发明的另一方面，提供了编码上述载脂蛋白构建体的核苷酸序列。优选该核苷酸序列与表达蛋白质构建体所需的调节序列可操作相连。
根据本发明的另一方面，提供了含有编码载脂蛋白构建体的核苷酸序列的载体，以及含有上述核苷酸序列的经转化的宿主细胞。
可通过不同方法产生本发明的载脂蛋白构建体。
根据第一种方法，在能促进由插入构建体的DNA所编码的本发明蛋白质构建体表达的条件下，培养经转化的宿主细胞，获得并回收蛋白质构建体，任选进一步加工所述蛋白质构建体。
当整个构建体具有多肽特性，因此可由一个相应的核酸序列来编码时，该方法是优选的方法。
根据第二种方法，可通过下述步骤制备载脂蛋白构建体化学合成异源组成成分，随后将其与载脂蛋白或其类似物连接以获得载脂蛋白构建体，分离并任选进一步加工所述构建体。当异源组成成分不具有肽的特性时，该方法是优选的方法。然而，当其具有多肽特性时，在某些条件下优选化学合成异源组成成分。所述条件可以是异源组成成分很短，例如不到20个氨基酸。
根据第三种方法，可通过下述步骤制备载脂蛋白构建体在能促进由核酸片段所编码的载脂蛋白或载脂蛋白类似物表达的条件下，培养经转化的宿主细胞，随后，将载脂蛋白或载脂蛋白类似物与异源组成成分共价连接以获得载脂蛋白构建体，分离所得的载脂蛋白构建体，并任选进一步加工所述构建体。
最后，可通过下述步骤生产载脂蛋白构建体在能促进编码寡聚化组件的核酸片段所编码的蛋白质表达的条件下，培养经转化的宿主细胞，随后，将所述组件与至少一种载脂蛋白连接以获得载脂蛋白构建体。
根据本发明的另一方面，提供了含有上述载脂蛋白构建体的药物组合物。优选能够非肠道施用所述药物组合物，例如通过注射给药。
本发明还包括上述载脂蛋白构建体用于制备药物组合物的用途。所述药物组合物还可包括药物可接受的赋形剂，佐剂，添加剂，如脂质，磷脂，胆固醇或甘油三酯。
可通过以下方式施用药物组合物静脉内、动脉内、肌内、经皮、经肺、皮下、皮内、鞘内、经颊-、肛门-、阴道-、结膜-、或鼻内组织、或通过接种进入组织，如肿瘤组织，或通过植入，或口服。
上述载脂蛋白构建体也可用于基因治疗，其中使用编码载脂蛋白构建体的DNA序列转染或感染至少一种细胞群体。


下文将参照附图详细描述本发明。
图1显示了人载脂蛋白A-I的氨基酸序列(以单字母密码表示)。
图2A显示了使用BLOSUM对载脂蛋白A-I进行的CLUSTAL W(1.74)多序列比对结果。图中比对了下列序列HUMAN sp|P02647|APA1_HUMAN载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Homo sapiens(人)Macaque sp|P15568|APA1_MACFA载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Macaca fascicularis(食蟹猴)Bovine sp|P15497|APA1_BOVIN载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Bostaurus(牛)Pig sp|P18648|APA1_PIG载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Sus scrofa(猪)Dog sp|P02648|APA1_CANFA载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Canisfamiliars(狗)Rabbit sp|P09809|APA1_RABIT载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Oryctolagus cuniculus(兔)Tree shreew sp|O18759|APA1_TUPGB载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Tupaia glis belangeri(普通树鼩)Mouse sp|Q00623|APA1_MOUSE载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Musmusculus(小鼠)Rat sp|P04639|APA1_RAT载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Rattusnorvegicus(大鼠)
Eur.Hedgehog tr|Q9TS49载脂蛋白A-I，APOA-I＝胆固醇转运蛋白-Erinaceus europaeus(刺猬)Chicken sp|P08250|APA1_CHICK载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Gallusgallus(原鸡)Jap.quail sp|P32918|APA1_COTJA载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Coturnix coturnix japonica(日本鹌鹑)Domestic duck sp|O42296|APA1_ANAPL载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-绿头鸭(Anas platyrhynchos)(家鸭)Rainbow trout sp|O57523|AP11_ONCMY载脂蛋白A-I-1前体(APOA-I-1)-Oncorhynchus mykiss(虹鳟)(Salmo gairdneri)Brown trout sp|Q91488|APA1_SALTR载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Salmo trutta(鳟)Atl.salmon sp|P27007|APA1_SALSA载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Salmo salar(鲑)Zebrafish sp|O42363|APA1_BRARE载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Brachydanio rerio(Zebrafish)(斑马担尼鱼(Zebra danio))Sea bream sp|042175|APA1_SPAAU载脂蛋白A-I前体(Apo-AI)-Sparusaurata(金头鲷)图2B显示了人、猕猴、小鼠、狒狒、猪和大鼠载脂蛋白A-IV的氨基酸序列(以单字母密码表示)比对结果。
图3四连接素氨基末端区域的氨基酸序列(SEQ ID NO 12)。四连接素的自EI至L51的氨基酸序列(以单字母密码表示)。外显子1含有残基E1至D16，外显子2含有残基V17至V49。α螺旋伸展超出L51到达α螺旋的C末端氨基酸残基K52。
图4显示了四连接素蛋白家族三聚体化结构元件的氨基酸序列比对结果。氨基酸序列(以单字母密码表示)对应于人四连接素、鼠四连接素(Sorensen等，Gene，152243-245，1995)、分离自礁鲨(reefshark)软骨的四连接素同源蛋白(Neame和Boynton，1992，1996)、和分离自牛软骨的四连接素同源蛋白(Neame和Boynton，数据库登录号PATCHXu22298)的含有外显子2的残基和外显子3的前三个残基的V17至K52。七联体重复中的a和d位残基以黑体表示。所列出的四连接素蛋白家族三聚体化结构元件的共有序列除了含有图中所示的七联体重复中的a和d位存在的残基外，还含有该区域的其它保守残基。“hy”表示脂肪族的疏水残基。
图5显示了pT7 H6UbiFx Apo A-I质粒及其对应的氨基酸序列。被表达和加工的多肽由人Apo A-I(SEQ ID NO 1)的氨基酸25-267及与其N末端连接的gly-gly组成。
图6显示了pT7 H6UbiFx Cys-Apo A-I质粒及其对应的氨基酸序列。被表达和加工的多肽由N末端半胱氨酸残基、人Apo A-I(SEQ ID NO 2)的氨基酸25-267及与其N末端连接的gly-gly组成。
图7显示了pT7H6 Trip-A-Apo A-I-AmpR质粒及其对应的氨基酸序列。被表达和加工的多肽(SEQ ID NO 3)由TTSE，连接序列和人Apo A-I的氨基酸25-267组成。
图8显示了pT7H6 Trip-A-Apo A-I-del 43-AmpR质粒及其对应的氨基酸序列。被表达和加工的多肽(SEQ ID NO 4)由TTSE，连接序列和人Apo A-I的氨基酸68-267组成。
图9显示了pT7H6FXCysApoAI质粒及其对应的氨基酸序列。被表达和加工的多肽由N-末端的半胱氨酸残基和人Apo A-I(SEQ ID NO 2)的氨基酸25-267及与其N末端连接的gly-gly组成。
图10A至G举例显示了本发明的载脂蛋白构建体的质粒和对应的氨基酸序列。
图10ApT7H6-Trip-A-Apo AI K9A K15A对应于pT7H6-Trip-A-Apo AI，但是三聚体化区域中的两个赖氨酸残基已被突变以除去肝素亲和性。将成熟的蛋白质产物称为Trip-A-AI K9A，K15A(SEQ ID NO 5)。
图10BpT7H6 Trip-A-FN-Apo AI对应于pT7H6-Trip-A-Apo AI，然而，在Trip A序列之后，apo AI序列之前插入了编码氨基酸序列SGH的碱基。将成熟的蛋白质产物称为Trip-A-FN-AI(SEQ ID NO 6)。
图10CpT7H6 Trip-A-FN-Apo AI-final对应于pT7H6 Trip-A-FN-ApoAI，然而，pT7H6 Trip-A-FN-Apo AI的BamHI位点已被除去，插入的三-氨基酸序列也已改变，使得源自四连接素的三聚体化序列和apo AI之间的氨基酸序列由GSSGH改变为GTSGQ。该五-氨基酸序列对应于纤连蛋白接头区域中的序列。将成熟的蛋白质产物称为Trip-A-FN-AI-final(SEQ ID NO 7)。
图10DpT7H6 Trip-A-FN-Apo AI-final K9AK15A对应于pT7H6-Trip-A-FN-Apo AI-final，但是三聚体化区域中的两个赖氨酸残基已被突变以除去肝素亲和性。将成熟的蛋白质产物称为Trip-A-FN-AI-final-K9A，K15A(SEQ ID NO 8)。
图10EpT7H6 Trip-A-TN-Apo AI对应于pT7H6-Trip-A-Apo AI，然而，在Trip A序列之后，apoAI序列之前插入了编码氨基酸序列KVHMK的碱基。将成熟的蛋白质产物称为Trip-A-TN-AI(SEQ ID NO 9)。
图10FpT7H6 Trip-A-TN-Apo AI-final对应于pT7H6 Trip-A-TN-ApoAI，然而，pT7H6 Trip-A-TN-Apo AI的BamHI位点已被除去，使得源自四连接素的三聚体化序列和apo AI之间的氨基酸序列由GSKVHMK改变为GTKVHMK。该七-氨基酸序列对应于三聚体结构域之后的四连接素序列。将成熟的蛋白质产物称为Trip-A-TN-AI-final(SEQ ID NO 10)。
图10GpT7H6 Trip-A-TN-Apo AI-final K9AK15A对应于pT7H6-Trip-A-TN-Apo AI-final，但是三聚体化区域中的两个赖氨酸残基已被突变以除去肝素亲和性。将成熟的蛋白质产物称为Trip-A-TN-AI-final-K9A，K15A(SEQ ID NO 11)。
图10HpT7H6Fx-Hp(α)-ApoAI。该质粒编码Hp(α)和ApoAI的融合蛋白。将成熟的蛋白质产物称为Hp(α)-ApoAI(SEQ ID NO 14)。
图11显示了实施例6所述试验中，ApoA-I、TripA-ApoA-I和TripA-FN-ApoA-I与DMPC结合的结果。
图12显示了如实施例7所述的ApoA-I和TripA-ApoA-I与固定化cubilin的结合。
图13显示了Apo A-1、Trip-A-AI、Trip-A-TN-AI、Trip-A-FN-AI的分析凝胶过滤。BSA被用作对照。实施例5中公开了详细过程。
图14显示了对小鼠体内载脂蛋白A-1、TripA Apo-AI和TripA-纤连蛋白-接头ApoA-I的血浆清除的评价结果。实施例8中描述了实验细节。
发明详述通过脂质结合试验，例如通过下文所述的DPMC试验可以测定本发明构建体和该构建体的apo-A组分的功能性。另外，按照Miyazaki等公开的方法(Arteriosclerosis，Thrombosis，.and Vascular Biology，1995；151882-1888)，通过给以富含胆固醇的饲料为食的、诸如兔的试验动物给药，可以测定反向胆固醇转运的体内作用，或者，在Apo E有缺陷的小鼠中也可进行这种测定(Sha PK等，Circulation 2001，1033047-3050)。
载脂蛋白或类似物在下文中，使用术语“apo-A”表示任何载脂蛋白A，包括载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-II或载脂蛋白A-IV及其具有相同脂质结合功能的任何变体或类似物。
优选载脂蛋白A-I类似物包括图2A中公开的那些。优选载脂蛋白A-IV类似物包括图2B中公开的那些。
图1中人Apo-AI序列的已知变体包括下列变体，其中显示出与图1序列有关的变异位置，变异，适当时还显示出已知变体的名称。
27 P-＞H(IN MUNSTER-3C)27 P-＞R28 P-＞R(IN MUNSTER-3B)34 R-＞L(IN BALTIMORE)50 G-＞R(IN IOWA)84 L-＞R(IN AUTOSOMAL DOMINANT AMYLOIDOSIS)113 D-＞E119 A-＞D (IN HITA)127 D-＞N(IN MUNSTER-3A)131 MISSING(IN MARBURG/MUNSTER-2)131 K-＞M132 W-＞R(IN TSUSHIMA)133 E-＞K(IN FUKUOKA)151 R-＞C(PARIS)160 E-＞K(IN NORWAY)163 E-＞G167 P-＞R(IN ESSEN)168 L-＞R(IN ZARAGOZA)171 E-＞V189 P-＞R197 R-＞C(IN MILANO)
222 E-＞K(IN MUNSTER-4)根据本发明，术语“载脂蛋白”欲包括图1，2a和2b中的至少一个序列的功能等同物，或图1，2a和2b中的至少一个序列的片段，所述片段含有预定的氨基酸序列。“片段”的定义是i)片段含有能被抗体识别的氨基酸序列，所述抗体也能识别图1，2a或2b中预定的氨基酸序列，和/或ii)片段含有能与脂质，如双肉豆蔻磷脂酰胆碱或胆固醇，和/或受体结合的氨基酸序列，所述脂质和受体也能与图1，2a或2b中的预定氨基酸序列结合。
根据本发明，通过添加、取代或缺失至少一个氨基酸即可获得载脂蛋白的功能等同物或其片段。当氨基酸序列含有一个氨基酸替代另一个氨基酸的取代时，所述取代可以是保守的氨基酸取代。图1，2a和2b序列的片段可含有一个以上的此类取代，例如两个保守的氨基酸取代，例如三或四个保守的氨基酸取代，例如五或六个保守的氨基酸取代，例如七或八个保守的氨基酸取代，例如10至15个保守的氨基酸取代，例如15至25个保守的氨基酸取代，例如25至75个保守的氨基酸取代，例如75至125个保守的氨基酸取代，例如125至175个保守的氨基酸取代。可在任意一组或多组预定的氨基酸内进行取代。
含有一个或多个保守的氨基酸取代的片段包括例如在相同组的预定氨基酸内的一个或多个保守的氨基酸取代，或者通过在不同组的预定氨基酸内进行取代而产生每个保守取代，进而构成多个保守的氨基酸取代。
因此，本发明的图1，2a或2b序列的变体或其片段可在图1，2a或2b序列的相同变体或其片段，或在图1，2a或2b序列的不同变体或其片段中含有至少一个取代，例如彼此独立导入的多个取代。因此，图1，2a或2b序列的变体或其片段可含有彼此独立的保守取代，其中，图1，2a或2b序列的所述变体或图1，2a或2b序列的所述片段中的至少一个甘氨酸(Gly)可被选自Ala，Val，Leu和Ile的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个丙氨酸(Ala)可被选自Gly，Val，Leu和Ile的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个缬氨酸(Val)可被选自Gly，Ala，Leu和Ile的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个亮氨酸(Leu)可被选自Gly，Ala，Val和Ile的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个异亮氨酸(Ile)可被选自Gly，Ala，Val和Leu的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个天冬氨酸(Asp)可被选自Glu，Asn和Gln的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个苯丙氨酸(Phe)可被选自Tyr，Trp，His，Pro，优选选自Tyr和Trp的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个酪氨酸(Tyr)可被选自Phe，Trp，His，Pro，优选选自Phe和Trp的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个精氨酸(Arg)可被选自Lys和His的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个赖氨酸(Lys)可被选自Arg和His的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个天冬酰胺(Asn)可被选自Asp，Glu和Gln的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个谷氨酰胺(Gln)可被选自Asp，Glu和Asn的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个脯氨酸(Pro)可被选自Phe，Tyr，Trp和His的氨基酸所取代，独立地，图1，2a或2b序列的变体或其片段中的至少一个半胱氨酸(Cys)可被选自Asp，Glu，Lys，Arg，His，Asn，Gln，Ser，Thr和Tyr的氨基酸所取代。
从上述概述中可以清楚地看出相同变体或其片段可含有来自多组上文所述保守的氨基酸取代中的多个保守的氨基酸取代。
添加或缺失氨基酸可以是添加或缺失2至10个氨基酸，如10至20个氨基酸，又如20至30个氨基酸，又如40至50个氨基酸。然而，本发明也包括添加或缺失50个以上的氨基酸，如添加10至200个氨基酸。更具体地，可从图1序列中除去43个N-末端氨基酸，而基本上不会改变蛋白质的脂质结合效应。将该缺失变体包含于SEQ ID NO 4中作为构建体的载脂蛋白部分。
因此，应理解本发明涉及载脂蛋白，其含有能结合诸如DPMC的脂质的、图1，2a或2b序列的至少一个片段，包括所述至少一个片段的任何变体和功能等同物。
在一个实施方案中，本发明的载脂蛋白，包括其任何功能等同物和片段可含有少于243个氨基酸残基，例如少于240个氨基酸残基，例如少于225个氨基酸残基，例如少于200个氨基酸残基，例如少于180个氨基酸残基，例如少于160个氨基酸残基，例如少于150个氨基酸残基，例如少于140个氨基酸残基，例如少于130个氨基酸残基，例如少于120个氨基酸残基，例如少于110氨基酸残基，例如少于100个氨基酸残基，例如少于90个氨基酸残基，例如少于85个氨基酸残基，例如少于80个氨基酸残基，例如少于75个氨基酸残基，例如少于70个氨基酸残基，例如少于65个氨基酸残基，例如少于60氨基酸残基，例如少于55个氨基酸残基，例如少于50个氨基酸残基。
片段特别优选含有图1，2a或2b天然序列的脂质结合区域的片段。然而，本发明不局限于含有脂质结合区域的片段。本发明还包括对所述片段进行缺失，以产生图1，2a或2b序列的功能等同片段，所述片段只含有部分脂质结合区域。本发明的图1，2a或2b肽序列的功能等同物或其片段可含有比脂质结合区域更少或更多的氨基酸残基。优选所述片段至少含有apo-A-I的氨基酸100-186或其变体或功能等同物。已测定该中心结构域和该结构域内的α-螺旋直接参与与磷脂的相互作用。因此，该区域对于apo-A-I的功能特性很可能起着重要作用。
根据一个优选的实施方案，本发明中所用的“功能等同”是通过参照图1，2a或2b序列的预定片段的相应功能性而建立的。
应理解由于插入、缺失和取代，包括保守取代的数目和范围的增加，图1，2a或2b序列的变体的功能等同物表现出逐渐不同于优选预定序列的氨基酸序列。该差异被测定为优选预定序列与片段或功能等同物之间同源性的降低。
本发明的范围内包括载脂蛋白的所有片段或功能等同物，而不论它们所显示的与载脂蛋白的优选预定序列之间的同源性程度如何。原因是图1，2a或2b序列的一些区域极可能易于突变，或能被完全缺失，而不会对所得片段的结合活性产生任何显著影响。
如果含有功能类似的氨基酸例链的残基被取代的话，通过取代获得的功能变体可较好地表现出某些形式或水平的图1，2a或2b序列天然活性，并且仍是同源性较低的。在此方面，功能类似指的是侧链的主要特征，例如疏水性、碱性、中性或酸性，或空间堆积的存在或缺乏。因此，在本发明的一个实施方案中，i)图1，2a或2b序列的能起作用的给定片段，与ii)优选的预定片段之间的同一性水平不是将片段确定为本发明的图1，2a或2b序列的优选预定片段的变体或功能等同物的主要测定标准。
可使用众所周知的算法计算氨基酸序列之间的同源性，所述算法如BLOSUM 30，BLOSUM 40，BLOSUM 45，BLOSUM 50，BLOSUM 55，BLOSUM 60，BLOSUM 62，BLOSUM 65，BLOSUM 70，BLOSUM 75，BLOSUM 80，BLOSUM 85或BLOSUM 90。优选使用算法BLOSUM 30。
与图1，2a或2b序列片段共享至少一些同源性的片段可落入本发明的范围之内，此时，它们与载脂蛋白或其片段至少约40％同源，例如与图1，2a或2b序列片段至少约50％同源，例如至少约60％同源，例如至少约70％同源，例如至少约75％同源，例如至少约80％同源，例如至少约85％同源，例如至少约90％同源，例如至少约92％同源，例如至少约94％同源，例如至少约95％同源，例如至少约96％同源，例如至少约97％同源，例如至少约98％同源，例如至少约99％同源。根据本发明的一个实施方案，同源性百分比指的是同一性百分比。
当根据本文所用的方式测定等同性时，其它可考虑的因素是i)针对图1，2a或2b中的一个序列的抗血清的检测本发明图1，2a或2b序列片段的能力，或ii)在脂质结合试验中，功能等同片段与图1，2a或2b序列竞争的能力。
可在优选的预定载脂蛋白或其片段的任何位置导入保守取代。然而，也可以导入非-保守取代，特别是，但不局限于在任何一个或多个位置导入非-保守取代。
导致形成图1，2a或2b序列的功能等同片段的非-保守取代可以是例如i)在极性上有实质性差别，例如用具有非-极性侧链的残基(Ala，Leu，Pro，Trp，Val，Ile，Leu，Phe或Met)取代具有极性侧链的残基，例如Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn或Gln，或带电的氨基酸，例如Asp，Glu，Arg或Lys，或用带电的或极性残基取代非-极性残基；和/或ii)对多肽骨架定向的作用有实质性差别，例如，用Pro或Gly取代另一个残基，或反过来用另一个残基来取代Pro或Gly；和/或iii)在电荷上有实质性差别，例如用带负电的残基，如Glu或Asp取代带正电的残基，如Lys，His或Arg(反之亦然)；和/或iv)在空间堆积上有实质性差别，例如，用体积大的残基，如His，Trp，Phe或Tyr取代具有较小侧链的残基，例如Ala，Gly或Ser(反之亦然)。
在一个实施方案中，可根据氨基酸的疏水性和亲水性数值以及氨基酸侧链取代基的有关相似性，包括电荷、大小等来进行氨基酸取代。考虑到上述多个特征的氨基酸取代的例子是本领域技术人员众所周知的，其包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。
除了本文所述的变体以外，还可制备空间类似的变体以模拟变体结构的主要部分，也可按照与本发明变体相同的方式使用这种化合物。通过本领域技术人员熟知的模型建立和化合物设计技术可以完成此目的。应理解所有这些空间类似的构建体都落入本发明的范围。
组分X优选地，本发明的蛋白质构建体的组分X实质上是非-免疫原性的。例如，组分X可以是氨基酸，糖类，核酸序列，惰性蛋白质或多肽，它对哺乳动物基本上没有生理作用，尤其是没有免疫学作用。
优选地，组分X是非-免疫原性的，并且不会负干扰配体结合，即载脂蛋白组分不应该因X-组分与配体的相互作用而被导入不合乎需要的位点。
根据一个实施方案，组分X仅由一个氨基酸组成，优选该氨基酸是半胱氨酸残基，可将它置于载脂蛋白组分的N-末端，C-末端或内部。该构建体可与其它相同或相似的构建体形成二聚体。优选在末端半胱氨酸残基和载脂蛋白组分之间导入接头，以便于构建体的正确折叠和脂质相互作用。
然而，更优选组分X含有肽，所述肽具有1个以上氨基酸，例如2个以上氨基酸，例如5个以上氨基酸，例如10个以上氨基酸，例如15个以上氨基酸，例如20个以上氨基酸，例如30个以上氨基酸，例如40个以上氨基酸，例如50个以上氨基酸，例如75个以上氨基酸，例如100个以上氨基酸，例如200个以上氨基酸，例如300个以上氨基酸，例如400个以上氨基酸，例如500个以上氨基酸，例如600个以上氨基酸，例如700个以上氨基酸，例如800个以上氨基酸，例如900个以上氨基酸，例如1000，1250，1500，2000或2500个以上氨基酸。
当X-组分是蛋白质时，优选该蛋白质是哺乳动物的蛋白质，更优选为人的蛋白质。适当蛋白质的例子包括血浆蛋白质，如白蛋白或血清白蛋白，或另一种非-免疫原性的肽或蛋白质，如纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶片段，或另一种经改造后，因催化三联体被破坏而失活的丝氨酸蛋白酶；以及免疫球蛋白重链的恒定区。更优选蛋白质含有血清白蛋白。甚至更优选蛋白质含有载脂蛋白，所述载脂蛋白含有含载脂蛋白的两亲性螺旋。
根据本发明特别优选的实施方案，组分X含有选自载脂蛋白A-I，A-II，A-IV，及其类似物，功能性变体或片段的载脂蛋白组分。两种载脂蛋白组分可以线性相连，或者也可以通过另一个非-天然的末端半胱氨酸桥相连。
可以制备含有至少一种非-天然半胱氨酸残基的载脂蛋白组分的高级寡聚体以及二聚体，并在适当条件下经由半胱氨酸桥进行连接。可以连续连接经二硫键连接的寡聚体(apo-A-S-S-apo-A，或apo-A-S-S-apo-A-S-S-apo-A或高级寡聚体)。
本发明的蛋白质构建体也可以含有彼此连续和共价相连的两个，三个或多个载脂蛋白或其类似物。通过将第一个载脂蛋白的C-末端与下一个载脂蛋白的N-末端相连(以此类推)即可完成此目的。可在转录和翻译之后对蛋白质进行上述连接，或者核苷酸序列可简单地含有两个，三个或多个编码所述载脂蛋白构建体以及载脂蛋白之间任选的接头肽的序列。
籍此，异源组成成分无需再进行连接。希望在具有两个，三个或多个apo-A单位的构建体中，实质上所有apo-A单位都参与脂质结合，从而为构建体的功能性作出贡献。因此，希望这些多-apo-A构建体与天然apo-A相比，脂质结合能力有所增加。与天然apo-A相比，这些构建体还有一个优点即它们具有比天然apo-A更长的血浆半寿期。
含有一个以上载脂蛋白组分的构建体可含有选自下列的组合二聚体A-I A-I；A-II All；A-IV A-IV；A-I A-il；A-A-IV；A-II A-IV。
三聚体A-I A-II A-IV；A-I A-A-ll；A-I A-I A-I；A-I A-I A-IV；A-II A-II A-l；A-IIA-il A-IV；A-II A-IIA-II；A-IV A-IV A-IV；A-IV A-IV A-II；A-IV A-IV A-I。
寡聚化组件根据本发明特别优选的实施方案，异源组成成分是寡聚化组件。在上下文中，寡聚化组件是能与其它类似或相同的寡聚化组件相互作用的肽或蛋白质或蛋白质部分。相互作用的类型是产生多聚化蛋白质或多肽。通过多聚物组分之间的共价键，以及通过氢键力、疏水力、范得华力、盐桥可以导致这种相互作用。本发明还包括非-肽性质的寡聚化组件，如DNA、RNA、LNA或PNA的核酸序列。本领域技术人员熟知将蛋白质和核酸序列与另一种蛋白质和核酸序列相互连接的技术。
寡聚化组件可以是二聚化组件，三聚化组件，四聚化组件或多聚化组件。
当构建体的载脂蛋白或类似物部分与寡聚化组件连接时，通过在适当条件下简单混合构建体(寡聚化组件与载脂蛋白部分连接)溶液即可制备构建体的多聚体。通过此方法，根据与构建体的载脂蛋白部分连接的寡聚化组件的类型，可以制备出二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或更高级的聚合体。
由于不同的载脂蛋白可连接至寡聚化组件并掺入多聚体，因此，本发明的多聚体可以是同聚体或异聚体。较为有利的是通过此方式混合不同类型的载脂蛋白，以获得构建体临床疗效的改善。优选的同聚体包括Apo-A-I的三聚体和Apo-A-IV的三聚体。
根据本发明特别优选的实施方案，寡聚化组件来自四连接素，更特别地，它含有四连接素三聚化结构元件(下文称之为TTSE，SEQ ID NO 12)，WO 98/56906中详细描述了该元件。TTSE的氨基酸序列示于SEQ ID NO 12。TTSE的三聚化作用是由卷曲螺旋结构导致的，所述结构与其它两个TTSE的卷曲螺旋结构相互作用以形成具有罕见的稳定性的三聚体。TTSE的另一个优点是它是一种弱抗原(WO 98/56906)。
优选在不抑制三聚化的情况下，通过除去或诱变N-末端的赖氨酸残基(SEQ ID NO 12的残基9和14)(Nielsen等，1997，FEBS Lett 412388-396)来消除位于外显子1(图4)N-末端区域的肝素结合位点。优选将赖氨酸残基突变为丙氨酸。因此，包括大部分或全部外显子1的TTSE赋予硫酸化多糖对任何经设计的蛋白质的亲和性，所述蛋白质包含所述TTSE作为其结构的一部分。然而，必要时，通过截短N-末端或诱变TTSE部分对应于四连接素N-末端氨基酸残基的赖氨酸残基，可以降低或消除所述亲和性(Lorentsen等2000，Biochem J 34783-87)。
本发明三聚化组件的相互作用结构域优选与TTSE类型相同，即为三股卷曲螺旋型α螺旋。
TTSE可以来自人四连接素，兔四连接素，鼠四连接素或鲨鱼软骨C-型凝集素。优选TTSE含有与SEQ ID NO 12的共有序列具有至少68％，如至少75％，如至少81％，如至少87％，如至少92％同一性的序列。因此，本发明包括具有基本上相同的三聚化作用的TTSE类似物。
为了避免形成不必要的、可导致不必要的多聚化的链间二硫键，优选将TTSE(SEQ ID NO 12)的半胱氨酸残基50突变为丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸或任何其它的氨基酸残基。
根据三聚体的特性，通过众所周知的技术，如凝胶过滤、SDS-PAGE或非变性SDS凝胶电泳可以确定三聚体的存在。确定寡聚体存在的一个优选方法是通过与DMSI(dimethylsubirimidate)连接，再进行SDS-PAGE。
根据本发明的优选实施方案，通过将两个或多个载脂蛋白与寡聚化组件连接即可获得蛋白质构建体。此实施方案的优点是各个载脂蛋白彼此之间的连接不是发生在载脂蛋白的内部，而是发生在寡聚化组件中。因此，野生型载脂蛋白的特性是保守的，载脂蛋白的二级和三级结构是保守的，这有利于其生理学功能。通过进一步在载脂蛋白和寡聚化组件之间导入肽间隔区，可以确保构建体的这两种组分可分别进行它们与脂质和其它寡聚化组件的相互作用，而不会受其它组分相互作用的影响。优选肽间隔区是非-免疫原性的，并具有基本上为线性的三维结构。
可使用寡聚化组件，如二聚化组件、三聚化组件、四聚化组件、五聚化组件、六聚化组件或多聚化组件使不同或相同的apo-A单位寡聚化。寡聚化组件可含有能进行链间识别和相互作用的卷曲螺旋结构。
产生蛋白质或肽的人工三聚体的一般方法包括从形成天然三聚体的蛋白质中鉴定三聚化组件。通过仔细分析，可鉴定、分离出负责蛋白质-蛋白质相互作用的结构域，并将其与待三聚化的蛋白质或肽连接。根据本发明，所述三聚化不必包括形成载脂蛋白或类似物的三聚体。也可以仅将一个载脂蛋白与三聚化组件连接，并使该肽与两个其它的三聚化组件三聚化。籍此，与天然载脂蛋白相比，载脂蛋白部分的分子量增加，血浆半寿期也有所增加。
WO 95/31540(HOPPE等)中公开了寡聚化组件的一个例子，其中描述了含有集合素(collectin)颈区的多肽。构成集合素颈区的氨基酸序列可与所选择的任何多肽结合。然后，在适当条件下，在三个含有集合素颈区氨基酸序列的多肽之间制备三聚体。
寡聚化组件的另一个例子是触珠蛋白的α1-链。该α1-链具有半胱氨酸残基，所述残基能与另一个α1-链连接以形成二聚体。天然变体是α2-链，其中参与二硫键桥连的α1-链部分成为双份。α2-链可与其它α2或α1-链中的半胱氨酸残基形成半胱氨酸桥，从而形成三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和高级聚体。在天然形式中，α-链与β-链相连。可以用载脂蛋白替代β-链以制备apo-A-α-链(触珠蛋白)构建体。
间隔肽蛋白质构建体也可以有利地含有间隔组成成分，该成分被共价连接于载脂蛋白或载脂蛋白类似物与异源组成成分之间。间隔肽的作用是在构建体的异源组成成分和载脂蛋白部分之间提供间隔区。籍此确保载脂蛋白部分的二级结构不受异源组成成分存在的影响，从而保持载脂蛋白部分的生理学作用。优选间隔区具有多肽性质。通过此方式，编码间隔区的核酸序列可与编码构建体的载脂蛋白部分的序列连接，并任选与编码异源组成成分的序列连接，整个构建体可以同时产生。
适当间隔组成成分的设计和制备是本领域已知的，通过制备融合多肽可以方便地实现此目的，所述多肽具有通式apo-A-间隔区-X，其中间隔组成成分是多肽片段(通常是相对惰性的片段)，从而避免构建体的间隔区与其周围发生不必要的反应。
也可以在两个TTSE之间插入间隔组成成分，使得它们与第三个独立的TTSE相互作用，以形成三聚体复合物，因此，其含有两个独立的肽TTSE和TTSE-间隔区-TTSE。该实施方案便于产生载脂蛋白构建体，因为三聚体的主要部分(严格说来，应看成是二聚体)被合成为融合配对物(apo-A表示形成构建体的载脂蛋白部分的任何多肽序列)apo-A-TTSE-间隔区-TTSE-apo-A中所含的一个单个多肽。
在相同单体内存在两个TTSE的实施方案中，优选间隔组成成分具有有利于复合物形成的长度和构象，所述复合物含有这两个通过间隔组成成分共价连接的TTSE。通过这种方式，就可以避免因通式为(2+1+1)、(2+2+2)和(2+2+1)(其中每个单体中仅有一个TTSE参与复合物形成)的三聚体的不合乎需要的形成所导致的问题。
间隔肽优选含有至少2个氨基酸，如至少3个氨基酸，如至少5个氨基酸，如至少10个氨基酸，如至少15个氨基酸，如至少20个氨基酸，如至少30个氨基酸，如至少40个氨基酸，如至少50个氨基酸，如至少60个氨基酸，如至少70个氨基酸，如至少80个氨基酸，如至少90个氨基酸，如至少100个氨基酸。
间隔区可通过共价键与apo-A组分和X连接，优选间隔区实质上是非-免疫原性的，和/或不易于被蛋白酶裂解，和/或不含任何半胱氨酸残基。
类似地，间隔区的三维结构优选为线性的或基本上为线性的。
以下为间隔序列的例子，据信它们是特别优选的，可用于连接载脂蛋白类似物与组分X。优选的间隔或接头肽的例子包括那些已被用于连接蛋白质，而基本上不会损害被连接的蛋白质的功能，或至少基本上不会损害其中一个被连接的蛋白质的功能的间隔或接头肽。更优选接头或间隔肽已被用于连接含有卷曲螺旋结构的蛋白质。
基于四连接素的接头接头可包括在四连接素中形成β-链的四连接素残基53-56，和在四连接素中形成转角的残基57-59(Nielsen BB，Kastrup JS，Rasmussen H，Holtet TL，Graversen JH，Etzerodt M，Thogersen HC，Larsen IK，FEBS-Letter412，388-396，1997)。区段的序列是GTKVHMK。该接头的优点是在天然四连接素中，它能桥连三聚化结构域与CRD-结构域，因此，可以想象它一般较适合于连接三聚化结构域与另一个结构域。另外，所得构建体的免疫原性有望比不含接头的构建体的更低。当组分X含有TTSE时，特别优选基于四连接素的接头。
基于纤连蛋白的接头该接头可以是人纤连蛋白连接链3的亚序列，它对应于氨基酸残基1992-2102(SWISS-PROT计数，登录号为P02751)。优选使用覆盖氨基酸残基编号2037-2049的亚序列PGTSGQQ-PSVGQQ，在该亚序列中，更优选对应于氨基酸残基2038-2042的区段GTSGQ。该构建体的优点是已知它非常不容易被蛋白酶裂解，而且也不象人们所想的因血浆中存在高浓度的纤连蛋白，因而其免疫原性也很高。
基于人IgG3上绞链区的接头得自鼠IgG3上绞链区的10个氨基酸残基的序列PKPSTPPGSS已被用于通过经卷曲螺旋而二聚化的抗体(Pack P和Pluckthun，A.Biochemistry 31，pp1579-1584(1992))，并可用作本发明的间隔肽。甚至更优选得自人IgG3上绞链区的相应序列。人IgG3的序列对人应无免疫原性。
易弯曲的接头易弯曲的接头/间隔序列的可能的例子包括SGGTSGSTSGTGST，AGSSTGSSTGPGSTT或GGSGGAP。这些序列已被用于连接设计好的卷曲螺旋与其它的蛋白质结构域(Mutter，K.M.，Amdt，K.M和Alber，T.，Meth.Enzymology，328，pp 261-281(2000)。
连接键构建体的两个组分可通过共价键连接在一起。组分X与apo-A组分的C或N末端氨基酸之间可形成该连接键。也可以经由一个以上的共价键连接这些组分。组分之间的共价键也可以含有S-S键，优选在半胱氨酸之间含有此键。这些半胱氨酸残基位于apo-A组分的C或N末端和组分X的末端或内部。
糖类不论构建体的其它组分如何，本发明的构建体可含有糖类组成成分。
四连接素三聚化结构元件本发明的一个特别优选的实施方案是载脂蛋白或其类似物与得自四连接素的三聚化组件的三聚化或部分三聚化。
该技术描述于WO 98/56906(THφGERSEN等)，该文献列入本文作为参考。三聚体多肽被构建为含有至少一个四连接素三聚化结构元件(TTSE)的单体多肽构建体，所述构建体与至少一个异源组成成分共价连接。四连接素三聚化结构元件能与两个其它的四连接素三聚化结构元件形成稳定的复合物。
本说明书和权利要求书中使用的术语“三聚化结构元件”(TTSE)欲指四连接素家族负责四连接素多肽单体(SEQ ID NO 12)之间的三聚化的多肽分子部分。该术语也欲包含天然四连接素家族成员的TTSE的变体，相对于天然四连接素家族成员分子而言，所述变体的氨基酸序列已被修饰，但所述修饰未在任何实质性水平上对三聚化特性有不利影响。
本文将详细描述所述变体的具体例子，但一般优选TTSE得自人四连接素、鼠四连接素、人或牛软骨的C-型凝集素或鲨鱼软骨的C-型凝集素。特别优选包含至少一个得自人四连接素的TTSE的单体多肽构建体。
由于尚未确立与其它已知多肽序列的显著的序列同源性，由四连接素的外显子1和2(图3，SEQ ID NO 12)编码的51个残基的多肽序列似乎是四连接素组蛋白质(图4)所特有的。在旨在实验性研究四连接素结构的制备四连接素的过程中，产生了重组蛋白质的收集物，该收集物中包含完整的四连接素、CRD结构域(大致对应于由外显子3编码的多肽)、对应于由外显子2+3编码的多肽的产物、对应于外显子1+2的产物(Holtet等，1996)。四连接素实际上是三聚体，但外显子2编码的多肽实际上能影响自身的三聚化，对应于外显子2+3的重组蛋白质在溶液中实际上为三聚体这一观察结果可以证实这一点。
全长重组四连接素晶体的3-D结构分析(Nielsen等，1996；Nielsen，1996；Larsen等，1996；Kastrup，1996)已证实外显子2编码的多肽加上外显子3编码的三个残基形成三股卷曲螺旋型α螺旋。
联合序列和结构数据可以看出显然，四连接素中的三聚化实际上是由结构元件产生的(图4)，所述元件含有由外显子2编码的氨基酸残基和由异常的七联体重复序列编码的外显子3的前三个残基，所述重复序列显然是四连接素和该组其它成员所特有的。该氨基酸序列(图4)的特征在于两拷贝在a和d位具有疏水残基的七联体重复(abcdefg)，这一点与其它卷曲螺旋型α螺旋相同。序列中存在这两个七联体重复，其后紧接着异常的第三拷贝七联体重复，其中谷氨酰胺44和谷氨酰胺47不仅取代了a和d位的疏水残基，还直接参与三股卷曲螺旋型α螺旋结构的形成。这些七联体重复的侧翼还有在d和a位分别具有疏水残基的两个半-重复序列。
已知α螺旋的卷曲螺旋中a或d位β-分支疏水残基的存在会影响寡聚化状态。在四连接素结构元件中，仅存在一个保守的缬氨酸(第37位)。优选四连接素序列的第29位没有特别的脂肪族残基。
总之，四连接素中三股链的卷曲螺旋结构在很大程度上明显受意外相互作用的控制，所述相互作用与已知卷曲螺旋蛋白质组的特征有关。
TTSE形成十分稳定的三聚体分子。实验观察结果(1)重组蛋白质的实质性部分以寡聚体状态存在，甚至在70℃仍可被交联为三聚体分子，和(2)仅在暴露于升高的温度之后才可检测到不同三聚体之间的单体交换是四连接素三聚化结构元件极高稳定性的证据。该特征必定反映在结构元件的氨基酸序列中。特别地，据认为七联体重复的连续排列中含谷氨酰胺之重复的存在和位置，以及共有序列(图4)中其它保守残基的存在和相对位置对于这些稳定的三聚体分子的形成是至关重要的。对于最具操作性的应用而言，应将半胱氨酸残基50突变为丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或任何其它氨基酸残基，以避免形成不必要的链-间二硫键，所述二硫键会导致含有该序列的多肽产物不受控制的多聚化，聚集和沉淀。
特别是，不论在其它蛋白质的任一端或两端经肽键结合与否，四连接素三聚化结构元件连同三聚体-稳定化外显子1编码的多肽都是真正自主的多肽组件，它们保留了自身结构的完整性和产生高稳定性同三聚体复合物的倾向。
得自异源蛋白质的多肽序列作为融合蛋白与四连接素三聚化结构元件连接时易于被三聚化这一事实可阐明该特性。不论异源多肽序列是位于三聚化元件的氨基-末端还是羧基-末端，它都能有效地形成一个分子集合，所述集合含有多达6拷贝某一特定的多肽序列或功能实体，或含有多达6个不同的多肽序列，其中的每个序列发挥其各自的功能特性。
由于天然人四连接素的三个TTSE形成三股卷曲螺旋型α螺旋，优选由本发明的TTSE形成的稳定复合物也形成三股卷曲螺旋型α螺旋。
“四连接素家族”是共享图4所示共有序列的多肽，或是在序列水平上与该共有序列同源的序列。
因此，本发明的单体多肽构建体是优选的，其含有与图4所示共有序列具有至少68％的序列同一性的多肽序列，但优选较高的序列同一性，如至少75％，至少81％，至少87％和至少92％。
Trip A-组件在本发明的表达质粒中，按指示通过用Ser取代Cys50并包括C-末端赖氨酸残基来修饰TTSE组件(SEQ ID NO 12)。在N-末端添加SPGT序列。这是三聚化组件的连接序列。已插入该序列，因为它为用BglII和KpnK切割DNA链提供了机会。在C-末端添加连接序列GS，从而为用BamHI切割提供机会。该经修饰的TTSE被称为Trip A，其公开于SEQ ID NO 13。因此，Apo A构建体的三聚化组件可以有利地含有该序列或与SEQ ID NO 13的序列具有至少68％的序列同一性的序列，但优选较高的序列同一性，如至少75％，至少81％，至少87％和至少92％。
实施例中公开了含有Trip A组件的构建体的具体例子。
本发明构建体的例子本发明包括所附实施例中被公开为SEQ ID NO 2至11和SEQ ID NO 14的特定序列。优选本发明包括SEQ ID NO 3至11和SEQ ID NO 14。本发明的范围还包括与这些序列共享至少60％序列同一性，如至少70％序列同一性的序列，优选与这些序列共享至少80％序列同一性，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％序列同一性的序列。
产生蛋白质构建体为了产生蛋白质构建体的肽组分，将编码该部分的cDNA插入表达载体并转化至宿主细胞。
可通过传统的基因工程技术来制备上述宿主细胞(它也是本发明的一部分)，所述技术包括将编码本发明的单体多肽构建体的多肽部分的核酸片段(一般为DNA片段)插入适当的表达载体，用载体转化适当的宿主细胞，并在允许表达单体多肽构建体的多肽部分的条件下培养宿主细胞。可将编码多肽的核酸片段置于适当启动子的控制之下，所述启动子可以是诱导型或组成型启动子。
根据表达系统，从宿主细胞的胞外相、外周质或胞质中回收多肽。
从本领域技术人员能够获得的大量文献和资料中可以得知适当的载体系统和宿主细胞是众所周知的。由于本发明还涉及本发明的核酸片段在载体构建和宿主细胞中的用途，下文将提供与此用途有关的一般性讨论和实施本发明的此方面的特殊考虑。
当然，一般说来，在最初克隆本发明的核酸序列和构建本发明所用的载体时，优选使用原核生物。例如，除了下文具体提到的特定菌株外，还可以提及其它的例子，例如菌株大肠杆菌K12菌株294(ATCC No.31446)，大肠杆菌B和大肠杆菌X 1776(ATCC No.31537)。当然，举这些例子的目的仅是为了阐明而不是限制本发明。
由于可以使用有效的纯化和蛋白质重折叠策略，因此优选使用原核生物进行表达。可以使用上述菌株以及大肠杆菌W3110(F-λ，原养型，ATCC No.273325)，如枯草芽孢杆菌的芽孢杆菌，或其它肠杆菌，如鼠伤寒沙门氏杆菌或粘质沙雷氏菌，以及多种假单胞杆菌。
一般说来，同时使用质粒载体和宿主细胞，所述质粒含有复制子和得自与所述宿主细胞相容的物种的控制序列。载体一般携有复制位点以及能对转化细胞进行表型选择的标记序列。例如，通常使用得自大肠杆菌种的质粒pBR322转化大肠杆菌(参见例如Bolivar等，1977)。pBR322质粒含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，因此可提供简单的方式用于鉴定转化细胞。
pBR质粒或其它微生物质粒或噬菌体还必须含有，或经修饰后含有被微生物用于表达的启动子。
重组DNA构建中最常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，1978；Itakura等，1977；Goeddel等，1979)和色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，1979；EPO Appl.Publ.No.0036776)。尽管这些启动子是最常用的，但其它微生物启动子也已被发现和利用，有关其核苷酸序列的细节已经公开，本领域技术人员可使它们与质粒载体进行功能性连接(Siebwenlist等，1980)。原核生物的某些基因可在其自身启动子序列的驱动下，在大肠杆菌中得以有效表达，而无需通过人工方法添加另一个启动子。
除了原核生物外，还可以使用真核微生物，如酵母培养物。在真核微生物中，最常用的是酿酒酵母或普通的面包酵母，但一般也可以使用多种其它菌株。例如，当在糖酵母中表达时，一般使用质粒YRp7(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。
该质粒已含有能为酵母突变菌株提供选择标记的trpl基因，所述菌株在色氨酸中不能生长，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977)。酵母宿主细胞基因组特征性的trpl损害的存在提供了一个有效的环境，可用于通过在缺乏色氨酸时生长来检测转化。
酵母载体中适当的启动子序列包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。在构建适当的表达质粒时，还将与这些基因有关的终止序列连接到表达载体内的需表达序列的3’末端，以提供mRNA聚腺苷酸化和终止。
具有另一个优点，即转录受生长条件控制的其它启动子是乙醇脱氢酶2、同种细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶和上述甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。任何含有酵母相容性启动子、复制起点和终止序列的质粒载体都是合适的。
除了微生物外，得自多细胞生物的细胞培养物也可用作宿主。理论上，可以使用任何这种细胞培养物，来自脊椎动物或无脊椎动物的培养物皆可。然而，最令人感兴趣的是脊椎动物的细胞，在培养中增殖脊椎动物细胞(组织培养)已成为常规方法(Tissue Culture，1973)。这种有用的宿主细胞系的例子是VERO和HeLa细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系和W138、BHK、COS-7、293和MDCK细胞系。
这种细胞的表达载体一般包括(必要时)复制起点、位于待表达基因前面的启动子以及任何必需的核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。
为了在哺乳动物细胞中使用，经常由病毒材料提供对表达载体的控制功能。例如，常用的启动子得自多瘤病毒、腺病毒2，最常用的得自猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子特别有用，因为它们作为片段都易于从病毒中被获得，所述片段也含有SV40病毒的复制起点(Fier等，1978)。也可以使用较小或较大的SV40片段，只要所述片段包括约250bp序列即可，所述序列从HindIII位点延伸至位于病毒复制起点的BglI位点。另外，也可以(经常是合乎需要的)使用一般与所需基因序列相关的启动子或控制序列，只要所述控制序列与宿主细胞系统相容即可。
通过构建载体，使其包括外源性复制起点即可提供复制起点，例如复制起点可得自SV40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)，或者，通过宿主细胞染色体复制机制也可提供复制起点。如果载体被整合至宿主细胞染色体，后者经常是有效的。
产生多肽单体构建体时，需要进一步加工多肽，例如在多肽中导入非-蛋白质功能，将材料置于适当的重折叠条件中(例如使用WO94/18227中暗示的一般可以使用的策略)，或者裂解除去单体中不合乎需要的肽组成成分(例如终产物中不需要的能增强表达的肽片段)。
从上述讨论中看，重组产生本发明的单体多肽构建体的方法也是本发明的一部分，携有和/或能在宿主细胞或细胞系中复制本发明的核酸的载体也是本发明的一部分。根据本发明，表达载体可以是例如质粒、粘粒、微型染色体或噬菌体。特别令人感兴趣的是导入宿主后可整合至宿主细胞/细胞系基因组的载体。
本发明的另一部分是携有并能复制本发明的核酸片段的转化细胞(在上述方法中有用)；宿主细胞可以是微生物，如细菌、酵母或原生动物，或得自多细胞生物，如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞的细胞。尤其令人感兴趣的是细菌细胞，如大肠杆菌、芽孢杆菌和沙门氏菌，优选细菌是大肠杆菌。
本发明的另一部分涉及产生本发明构建体的多肽部分的稳定细胞系，优选细胞系携有并表达本发明的核酸。
受体结合通过测定本发明的构建体结合受体或HDL蛋白的能力，即可分析构建体的表现，所述HDL蛋白可结合天然载脂蛋白A-I、A-II或A-IV。所述受体和蛋白质包括但不限于cubilin、megalin、B类1型清除受体(SR-B1)、ATP-结合盒1(ABC1)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、磷脂转移蛋白(PLTP)。Cubilin与天然载脂蛋白AI之间的复合物的解离常数Kd为20nM。已通过实验测定出本发明的载脂蛋白AI三聚体甚至能与cubilin较强地结合(图12)。
亲和标记物本发明的蛋白质构建体也可含有亲和标记物，以在纯化构建体时使用。所述标记物优选含有聚组氨酸序列。该序列可有利地用于在Ni2+柱上纯化产物，所述柱会与聚组氨酸序列结合，进而与整个蛋白质结合。从柱上洗脱之后，通过诸如凝血酶的蛋白酶裂解除去聚组氨酸序列，所述酶能识别插入构建体中的特定序列，所述序列位于蛋白质构建体和聚组氨酸序列之间。
亲和标记物的其它例子包括但不限于众所周知的标记物，例如抗原性标记物或GST标记物。可在标记物和构建体之间插入蛋白酶裂解位点以裂解除去标记物。
信号肽当在大肠杆菌或酵母中表达本发明的构建体时，优选在表达构建体中包括信号肽以确保所表达的蛋白质能分泌出来，并能从细胞四周的培养基中收集得到所述蛋白质，以此替代从细胞内分离所表达的蛋白质这一更费力的方法。可与本发明一同使用的、用于在酵母和大肠杆菌中表达的信号肽的具体例子包括WO 90/12879(Sirtori等)和WO 94/13819(Kabi Pharmacia)中公开的信号肽，前者公开了用于在酵母中表达Apo-AI和Apo-AIM的信号肽，后者公开了用于在大肠杆菌中表达Apo-AI和Apo-AIM的信号肽。
产生apo-A-TTSE为了产生含有载脂蛋白部分和TTSE的构建体，将编码载脂蛋白部分的cDNA的3’末端与编码TTSE的cDNA的5’末端相连接。还可进一步连接TTSE单位和载脂蛋白单位。再在编码TTSE的序列的3’末端连接编码酶裂解位点的序列，最终再连接编码聚组氨酸的序列。通过常规的PCR技术可以进行上述连接。将组合好的cDNA插入表达载体并转化至宿主细胞。
在大肠杆菌中表达之后，使用聚组氨酸序列在Ni2+柱上捕获异源蛋白质。洗脱后，通过诸如Fx的蛋白酶除去聚组氨酸尾，所述酶在插入TTSE和聚组氨酸序列之间的特定位点处裂解异源蛋白质。然后，可进一步加工所得的apo-A-TTSE肽，使所述肽与其它的或相同的apo-A-TTSE肽三聚化。为了改善在大肠杆菌中的表达，将构建体表达为与例如遍在蛋白(随后可以被裂解下来)的融合蛋白较为有利。
apo-A构建体制备药物组合物的用途可以使用apo-A构建体制备药物组合物。所述组合物可含有药物可接受的赋形剂、佐剂、添加剂，例如磷脂、胆固醇或甘油三酯。
可通过以下方式施用药物组合物静脉内、动脉内、肌内、经皮、经肺、皮下、皮内、鞘内、经颊-、肛门-、阴道-、结膜-、或鼻内组织、或通过接种进入组织，如肿瘤组织，或通过植入，或口服。
优选使用本领域技术人员众所周知的技术进行本发明药物组合物的配制。其包括添加药物可接受的赋形剂、佐剂或添加剂，例如磷脂、胆固醇或甘油三酯。
施用apo-A-构建体可施用本发明的apo-A-构建体以预防和/或治疗与胆固醇、磷脂和甘油三酯有关的疾病，诸如血胆固醇过多的LDL和HDL疾病，和诸如动脉硬化和心肌梗塞的动脉硬化性疾病。其它适应征包括心绞痛、斑点性心绞痛、不稳定性心绞痛、如颈动脉狭窄等动脉狭窄、跛行或脑动脉狭窄。另外，也可使用载脂蛋白构建体除去内毒素。
在一个实施方案中，给药包括每周施用至少50mg构建体以获得约0.5g/L的血浆浓度。优选非肠道施用构建体，例如通过注射、栓剂，植入等。优选每周所施用的组合物的量为含有至少50mg载脂蛋白构建体，例如至少100mg/周，例如至少250mg/周，例如至少500mg/周，例如至少750mg/周，例如至少1000mg/周，例如至少1250mg/周，例如至少1500mg/周，例如至少2000mg/周，例如至少2500mg/周，例如至少5000mg/周。可以每天、每两或三天、一周一次、每两周一次、或每三周一次、或每四周一次地进行给药。
根据另一个实施方案，一次、两次或三次以更大的量施用构建体，对于心绞痛、斑点性心绞痛、不稳定性心绞痛的紧急治疗而言尤其如此。给药可以在1，2，3，4，5，6，7，8或多达10天内进行。给药量可以为至少10mg/kg体重，例如至少20mg/kg体重，例如至少30mg/kg，例如至少40mg/kg，例如至少50mg/kg，例如至少60mg/kg，例如至少70mg/kg，例如至少75mg/kg，例如至少90mg/kg，例如至少100mg/kg，例如至少125mg/kg，例如至少150mg/kg，例如至少200mg/kg，例如至少250mg/kg，例如至少300mg/kg，例如至少400mg/kg，例如至少500mg/kg，例如至少600mg/kg，例如至少700mg/kg，例如至少800mg/kg，例如至少900mg/kg，例如至少1000mg/kg。
也可以口服构建体。对于此给药途径而言，可将WO 99/46283、US5,922,680、US 5,780,434或US 5,591,433、US 5,609,871或US 5,783,193中描述的技术应用于本发明的蛋白质构建体。这些参考文献都全文列入本文作为参考。
细胞群体本发明还包括本发明的核苷酸序列用于基因治疗的用途。
可将基因转移至巨噬细胞群体，随后转移至需要治疗的患者。由于巨噬细胞在血管中的生存期有限，因此只能获得基因的瞬时表达。
通过转化肝细胞可获得永久转染。
以下将参照本发明实施方案的具体实施例来描述本发明，应将实施例理解成阐述性的，而非限制性的实施例。本发明的其它构建体的设计也是本领域普通技术人员易于实现的。
实施例1克隆Apo A-I使用标准PCR技术，从人肝脏cDNA文库(Clontech)中扩增编码Apo A-I的cDNA。为了构建Ubi-A-I，使用的引物是5′-CAC GGA TCC ATC GAGGGT AGG GGT GGA GAT GAA CCC CCC CAG AGC-3′和5′-TCC AAG CTTATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3′。使用Bam HI和Hind III克隆位点将产物克隆于载体pT7H6Ubi(Eligaard L等，Eur.J.Biochem.1997；244(2)544-51)。为了构建Trip-A-A-I，使用的引物是5′-AAG GGA TCC GATGAA CCC CCC CAG AGC CCC-3′和5′-TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGTTGA GCT TCT TAG TG-3′。使用Bam HI和Hind III克隆位点将PCR产物克隆于WO 98/56906中描述的pT7H6tripa载体。为了构建Trip-A-I-de143，使用的引物是5′-AGG GGA TCC CTA AAG CTC CTT GAC AAC TGG G-3′和5′-TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3′。使用BamHI和Hind III克隆位点将PCR产物克隆于WO 98/56906中描述的pT7H6tripa载体。为了构建Ubi-Cys-A-I，使用的引物是5′-GGT GGA TCC ATC GAGGGT AGG GGT GGA TGT GAT GAA CCC CCC C-3′和5′-TCC AAG CTT ATTACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3′。使用Bam HI和Hind III克隆位点将产物克隆于载体pT7H6Ubi(Eligaard L等，Eur.J.Biochem.1997；244(2)544-51)。所产生的质粒示于图4，5，6和7。
实施例2在大肠杆菌中表达载脂蛋白A-I(apo A-I)在大肠杆菌AV-1细胞(Stratagene Inc)中可以方便地表达图中公开的Ubi-A-I和Trip-A-I以及其它构建体。也可以使用其它细胞系。按WO 98/56906中针对四连接素的描述进行细胞培养和表达的诱导。
实施例3分离和加工蛋白质按WO 98/56906中针对四连接素的描述，通过苯酚提取分离粗蛋白。离心6升表达培养物的重-溶解沉淀物以除去不溶的物质，然后分批吸附于50ml按WO 98/56906所述制备的Ni2+-NTA-琼脂糖上。将柱材料填充于柱上，然后依次用500ml 8M尿素，500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0，200ml 6M盐酸胍，50mM Tris-HCl pH 8.0和300ml 500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0洗涤柱。用500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0和10mM EDTA洗脱蛋白质。在蛋白质中添加0.5mg Xa因子，室温下消化过夜。使用凝血酶也可以达到此目的。在G-25 sephadex(Pharmacia)柱中使蛋白质经凝胶过滤流入500mMNaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液中。通过使蛋白质溶液流过经500mMNaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0预洗涤的Ni2+-NTA-琼脂糖柱以除去未经消化的蛋白质，然后用500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0洗涤。用500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0和10mM EDTA洗脱未经消化的蛋白质。使用Sp琼脂糖离子交换进行进一步纯化。
实施例4从蛋白质中除去脂质通过凝胶过滤使蛋白质流入10mM(NH4)2CO3pH 8.8溶液中并冻干。将冻干的蛋白质重新悬浮于25ml冰冷的1∶1甲醇/氯仿中，置于冰上保温30分钟，3000g离心20分钟。将沉淀物重新悬浮于25ml冰冷的1∶2甲醇/氯仿中，在冰上平衡30分钟，重新进行离心。除去上清液，将沉淀物简单风干，然后重新悬浮于6M盐酸胍，50mM Tris-HCl pH 8.0中过夜。
实施例5多聚化试验交联通过交联多聚体，接着进行分析性SDS-PAGE来测定多聚化。
在已平衡至所需温度达30分钟的150mM硼酸钠pH9.0中溶解蛋白质，使其浓度为0.2mg/ml，在60μl该蛋白质溶液中加入5μl 20mg/ml辛二酰亚胺酸二甲酯(dimethylsuberimidate)，在所需温度下保温30分钟。通过加入5μl 3MTris-HCl pH9.0淬灭交联。
辛二酰亚胺酸二甲酯导致彼此相距较近的赖氨酸残基形成共价键。结果导致已形成多聚体的蛋白质彼此共价相连。在随后的SDS-PAGE中可以估计出多聚体的分子量。
在8-16％聚丙烯酰胺凝胶上，通过SDS-PAGE分析交联产物。任选在交联混合物中加入佐剂，例如脂质，此时，需将蛋白质与佐剂预保温。
分析性凝胶过滤通过分析性凝胶过滤也可以测定多聚化。
将蛋白质溶解于500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液，室温下在Superdex 200 HR 10/30柱上进行凝胶过滤，使蛋白质流入合乎要求的缓冲液中，流速为0.25ml/分钟。在标准方法中，缓冲液是100mM NaCl，50mMTris-HCl pH 8.0。
从图13中可以看出Apo A-I作为混合峰被洗脱出来，主峰集中于约14.5ml和16.5ml。分子量为68kDa的BSA在约14.5ml时被洗脱出来，这表明16.5ml时的Apo A-I峰对应于单体Apo A-I，而其它主峰对应于apo A-I自身-结合的复合物。与三聚化结构域融合的构建体全部以约10.7ml的主峰和14ml的次峰被洗脱出来。14ml时的峰可能对应于构建体的三聚体形式，而10.7ml时的主峰对应于高分子量产物。可以推测产物是通过三聚体的结合而形成的。这表明apo A-I与三聚化结构域的融合不仅会导致三聚体，也会导致形成大的复合物，其中Apo A-I单位可与其它apo A-I单位相互作用，就象天然apo A-I可与其它Apo A-I分子相互作用一样。
实施例6蛋白质构建体与双肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)结合的动力学使用众所周知的试验，例如与双肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)结合的试验，可以方便地测定本发明的构建体结合脂质的能力。
按照Bergeron J等(1997)，Biochem.Biophys.Acta，1344，139-152所述进行试验。在高于其转换温度的温度下，以0.5mg/ml的浓度将干燥的DPMC悬浮于100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0和0.25mM EDTA中。将蛋白质样品、缓冲液和DMPC悬浮液皆置于24℃保温10分钟，然后混合，使得DMPC的终浓度为0.4mg/ml，蛋白质浓度为5.2μM(单体的浓度)。混合物浊度的降低反映出脂质-蛋白质结合的增加，接着测定混合物在325nm处的光吸收值。进行四次试验，分别针对apo AI，Trip-A-AI和Trip-A-FN-AI，还有一次为不加蛋白质。
从图11中可以看出所有Apo A-I构建体都结合DMPC。对受试的所有三种构建体而言，在24小时之后，浊度全部澄清，这表明融合蛋白中存在融合蛋白结合DMPC的能力。然而，在能使试验有效的唯一温度，即24℃时，Trip-A-Apo A-I和Trip-A-FN-Apo AI结合DMPC的速度显然都慢于天然ApoA-I。
实施例7衍生物与cubilin结合的表面胞质基因组共振分析按照Kozyraki R，Fyfe J，Kristiansen M，Gerdes C，Jacobsen C，Cui S等在The intrinsic factor-vitamin B12 receptor，cubilin，is a high-affinityapolipoprotein A-receptor facilitating endocytosis of high-density lipoprotein.Nat Med 1999；5(6)656-661中的描述进行试验。所用载脂蛋白构建体的浓度为0.5μM。仅显示出TripA-AI和apo A-I的结果(图12)。在TripA-FN-AI和TripA-TN-AI中也观察到与在TripA-AI中所观察到的相类似的结合。与单体相比，通过apo A-I的三聚化，反应有所增强，特别是，根据多聚体与固定化靶的相互作用所获得的“亲和力”，在速率上也有所降低(多价带来的好处)。这表明apo A-I能以三聚体状态结合cubilin，一种以上的apo A-I采取的是能与cubilin相互作用的构象，显示出三聚体构建体中apo A-I单位的正确折叠。
实施例8在小鼠体内评价载脂蛋白A-I，TripA Apo-A-I和TripA纤连蛋白-接头Apo-A-I的血浆清除给三组小鼠(每组五只)分别注射1mg apo A-l，Trip-A-AI或Trip-A-FN-AI。将蛋白质以0.33mg/ml的浓度溶解于下列缓冲液1×PBS pH7.4和8.9mg/ml二棕榈磷脂酰胆碱。在注射后10分钟、4小时、24小时和48小时取每只小鼠的血样。
按照下述方法，使用ELISA试验测定载脂蛋白A-I和衍生物的血浆浓度使用Nunc immune PolySorp培养板，每次加样时在每只小管中添加100μl。MB对应于下列缓冲液组合物2mM CaCl2，1mM MgCl2，10mMHEPES，140mM NaCl。
在冷室中用溶解于50mM NaHCO3pH 9.6的4μg/ml多克隆兔抗人apoA-I血清(DAKO A/S)包被培养板过夜。用MB+0.05％吐温-20 pH 7.8洗涤培养板，并用MB+0.05％吐温-20+1％BSA pH 7.8封闭1小时。上样样品，使其溶解于MB+0.05％吐温-20+1％BSA pH 7.8，保温1小时，用MB+0.05％吐温-20+1％BSA pH 7.8洗涤，并在MB+0.05％吐温-20+1％BSA pH 7.8中与浓度为1μg/ml的小鼠单克隆抗-apo A-I抗体(Perlmmuneinc.克隆10-A8)保温1小时。洗涤培养板，并与同辣根过氧化物酶连接的抗-小鼠IgG第二抗体保温。再次洗涤培养板，使用OPD-片剂和H2O2显色，使用1M H2SO4终止反应。将结果分别与根据已知浓度的apo A-I和衍生物的标准相比较。在标准中未观察到小鼠血浆中稀释Apo A-I的作用。
图14所示的结果阐明与天然Apo A-I的清除时间相比，构建体Trip AApo A-I的血浆清除时间至少增加3倍。初步的数据表明Trip A FN Apo A-I的清除时间至少与Trip A Apo A-I的相同。这些数据连同cubilin结合数据和DMPC结合数据证实本发明的构建体是治疗本申请中提及的疾病的重要候选药物。
实施例9质粒可以使用下文所述的质粒制备本发明的构建体。
在Trip-A-AI中插入接头序列按照不含接头的构建体的构建方法来构建具有上述突变并含基本接头的构建体，即通过PCR扩增Apo A-I(和接头序列)并插入pT7FxH6-Trip-A质粒。反向引物与构建pT7H6FxTrip-A-AI时所用的相同，而所用的正向引物是pT7H6FX-Trip-A-FN(-2)-AI5′-CGC GGATCC TCG GGT CAG GAT GAA CCC CCC CAG AGCCCC-3′不幸的是，在所有分离的克隆中，上述黑体G都突变成T，这说明引物序列有错误。
pT7H6FX-Trip-A-TN-AI-Bam-S5′-cgc gga tcc aag gtg cac atg aag gat gaa ccc ccc cag agc ccc-3′通过使用购自Stratagene的QuickChange试剂盒和下列引物套进行定点诱变来校正上述突变pT7H6FX-Trip-FN-AI5′-acg gtc tcc ctg aag gga acc tcg ggt cag gat g-3′5′-cat cct gac ccg agg ttccct tca ggg aga ccg t-3′pT7H6FX-Trip-A-TN-AI5′-acg gtc tcc ctg aag gga acc aag gtg cac atg aag g-3′5′-cct tca tgt gca ccttgg ttc cct tca ggg aga ccg t-3′除去Trip-A的肝素-结合位点通过使用购自Stratagene的QuickChange试剂盒和下列引物套进行定点诱变来突变Trip-A序列的肝素结合位点(Lorentsen RH，Graversen JH等，Biochemical Joumal(2000)，347 pp 83-87)，以产生构建体的衍生物突变Trip-A的赖氨酸9时所用引物如下5′-cca acc cag aag ccc aag gcg aat gta aat gcc-3′5′-gtg ttc aca aca tct gcc ttg gca ttt aca atc-3′突变Trip-A的赖氨酸15时所用引物如下5′-ggc att tac aat cgc ctt ggg ctt ctg ggt tgg-3′5′-cca acc cag aag ccc aag gcg att gta aat gcc-3′计划对所有相关的Trip-A-apo-AI衍生物进行所述突变，有可能对它们都进行所述突变。产生trip-A衍生物的双突变K9A、K15A，即TripA-FN-AI-K9AK15A，TripA-TN-AI-K9AK15A和TripA-AI-K9AK15A。
另外，截短N-末端也能除去肝素亲和性而不会除去三聚化。参见Holtet等，Protein Science(1997)，Lorentsen等，Biochem.Joumal(2000)，Nielsen等，FEBS(1997)和Nielsen等Acta Cryst D(2000)。然后优选N-末端残基位于Val16和Met22之间。
构建Hp-α-A-I的表达质粒首先按下述构建质粒pT7H6Fx-Hp(α)(图10H)使用下列引物套从cDNA文库(Clontech胎肝)中PCR扩增Hp-α序列非-有义引物5′-cac aag ctt tcc get aga tct ctg cac tgg gtt age egg att cttggg-3′有义引物5′-ggt gga tcc ate gag ggt agg ggt gtg gac tca ggc aat gat gtc acgg-3′3′PCR产物含有下列特征BamHI-位点-Hpα序列-BglII位点-HindIII位点在Hp-α序列中，将与Hpβ链以二硫键相连的半胱氨酸突变为丙氨酸。
用BamHI和HindIII消化产物，插入pT7H6FX质粒，进行测序。使用制备pT7H6-Ubi-Fx-ApoAI和pT7H6Fx-TripA-AI时使用的标准非-有义引物制备编码人Apo AI的PCR产物。而所用的有义引物是构建pT7H6FX-TripA-AI时用作有义引物的引物。所得PCR产物具有下列特征BamHI位点-Apo AI序列-HindIII位点，用BamHI和HindIII消化该产物，插入经BglII和HindIII消化的上述质粒。对所得质粒pT7H6FX-Hp(α)-Apo AI进行测序，并在大肠杆菌中检测表达。
pT7H6 TripA-apoAI(图7)该质粒含有WO 98/56906中的实施例1所述的质粒pT7H6FxtripA。
表达受T7启动子的控制。该质粒还含有六-组氨酸亲和标记物H6序列以用于纯化。在该序列的后面插入Xa因子识别序列(IQGR)。
-SPGT是与随后的三聚化组件之间的连接序列。由于该序列能提供用BglII和KpnI切割DNA链的机会，因此已插入该序列。
-TripA是得自四连接素的三聚化组件。
GS是另一个连接序列，它可提供用BamHI进行切割的机会。
最终，该质粒含有编码人载脂蛋白A-I的氨基酸25-267的人载脂蛋白A-IcDNA。经表达和纯化的蛋白质对应于SEQ ID NO 3。
pT7H6TripA-apoAI-del43(图8)该质粒含有如上所述的序列，但载脂蛋白部分已被编码人载脂蛋白A-I的氨基酸68-267的cDNA所取代。经表达和纯化的蛋白质对应于SEQ ID NO4。
pT7H6UbiFxApoAI(图5)基础质粒描述于Ellgaard等(1997)。
该质粒含有下列序列-表达受T7启动子的控制-H6用于纯化蛋白质构建体的六-组氨酸亲和标记物-Ubi经插入以在大肠杆菌中使蛋白质稳定化的、编码人遍在蛋白的cDNA-FXXa因子的识别序列-Xa因子的最佳裂解所必需的、编码两个甘氨酸残基的DNA-ApoAI编码人载脂蛋白A-I的氨基酸25-267的cDNA经表达和纯化的蛋白质对应于SEQ ID NO 1。
pT7H6UbiFXCysApoAI(图6)如上所述，但在编码两个甘氨酸残基的序列之后和编码载脂蛋白A-I的序列之前，插入了编码半胱氨酸残基的序列。经表达和纯化的蛋白质对应于SEQ ID NO 2。
pT7H6FXCysApoAI(图9)该质粒含有下列序列-表达受T7启动子的控制-H6用于纯化蛋白质构建体的六-组氨酸亲和标记物-FXXa因子的识别序列-Xa因子的最佳裂解所必需的、编码两个甘氨酸残基的DNA-编码半胱氨酸残基的DNA-ApoAI编码人载脂蛋白A-I的氨基酸25-267的cDNA经表达和纯化的蛋白质对应于SEQ ID NO 2。
图10A至G以及序列表中公开的经表达和纯化的蛋白质的相应氨基酸序列公开了用于表达本发明的载脂蛋白构建体的质粒的其它例子。
参考文献Bergeron等，1997，Biochem Biophys Acta，1344139-152.
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序列表<110> 普罗蒂奥制药公司(Proteopharma ApS)<120> 载脂蛋白类似物<130> P 459 PC00<150> DK PA 2000 01682<151> 2000-11-10<150> DK PA 2001 00057<151> 2001-01-15<150> US 60/264,022<151> 2001-01-26<160> 14<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 243<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 1Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thrl 5 10 15Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln20 25 30Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp35 40 45Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu50 55 60Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu65 70 75 80Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys85 90 95Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met100 105 110Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu115 120 125Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu130 135 140Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg145 150 155 160Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala165 170 175Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr180 185 190His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys195 200 205Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser210 215 220Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu225 230 235 240Asn Thr Gln<210> 2<211> 244<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<220><221> MISC_FEATURE<222> (1)..(1)<223> N末端Cys<220><221> MISC_FEATURE<222> (2)..(244)<223> 人Apo AI的氨基酸25-267<400> 2Cys Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala1 5 10 15Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser
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Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser20 25 30Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln35 40 45Ala Leu Gln Thr Val Ser Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Asp50 55 60Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val65 70 75 80Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe85 90 95Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn100 105 110Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly115 120 125Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly130 135 140Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val145 150 155 160Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu165 170 175Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly180 185 190Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly195 200 205Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr210 215 220His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg225 230 235 240Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His245 250 255Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro260 265 270Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe275 280 285Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn290 295 300Thr Gln305<210> 12<211> 51<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<300><302> 三聚化组件<309><310> WO 98/56906<311> 1998-06-11<312> 1998-12-17<313> (1)..(51)<400> 12Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp1 5 10 15Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr20 25 30Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr35 40 45Val Cys Leu50<210> 13<211> 58<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<220><221> MISC_FEATURE<222> (1)..(4)<223> 接头序列<220><221> MISC_FEATURE<222> (5)..(56)<223> 经修饰的TTSE<220><221> MISC_FEATURE<222> (57)..(58)<223> 接头<400> 13Ser Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn1 5 10 15Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser20 25 30Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln35 40 45Ala Leu Gln Thr Va l Ser Leu Lys Gly Ser50 55<210> 14<211> 329<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<220><221> MISC_FEATURE<222> (1)..(86)<223> Hp(α)残基<220><221> MISC_FEATURE<222> (87)..(329)<223> Apo A-I<400> 14Gly Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly Cys1 5 10 15Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg20 25 30Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val35 40 45Tyr Thr Leu Asn Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp50 55 60Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Val Ala Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala65 70 75 80Asn Pro Val Gln Arg Ser Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg85 90 95Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly100 105 110Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu115 120 125Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser130 135 140Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn145 150 155 160Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu165 170 175Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys180 185 190Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu195 200 205Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln210 215 220Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala225 230 235 240His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu245 250 255Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly260 265 270Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr275 280 285Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu290 295 300Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu305 310 315 320Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln32权利要求
1.用作药物的载脂蛋白构建体，其具有通式-apo A-X，-其中apo A是选自载脂蛋白AI，载脂蛋白AII，载脂蛋白AIV，其类似物或变体的载脂蛋白组分，-X是异源组成成分，其含有至少一种选自下列的化合物氨基酸，肽，蛋白质，糖类和核酸序列，-附带的条件是当构建体由确切的两个相同天然载脂蛋白组成时，它们被连续地连接。
2.权利要求1的构建体，其在apo-A组分和X之间进一步含有间隔区。
3.权利要求2的构建体，其中间隔区含有间隔肽。
4.权利要求3的构建体，其中间隔肽含有至少2个氨基酸，如至少3个氨基酸，如至少5个氨基酸，如至少10个氨基酸，如至少15个氨基酸，如至少20个氨基酸，如至少30个氨基酸，如至少40个氨基酸，如至少50个氨基酸，如至少60个氨基酸，如至少70个氨基酸，如至少80个氨基酸，如至少90个氨基酸，如约100个氨基酸。
5.根据权利要求2的构建体，其中间隔区可通过共价键与apo-A组分和X连接。
6.根据权利要求2的构建体，其中间隔区实质上是非-免疫原性的，和/或不易于被蛋白酶裂解，和/或不含任何半胱氨酸残基。
7.根据权利要求2的构建体，其中间隔区的三维结构是线性的或基本上为线性的。
8.根据权利要求2的构建体，其中间隔肽含有四连接素的氨基酸序列GTKVHMK；人纤连蛋白连接链3的氨基酸序列PGTSGQQPSVGQQ和GTSGQ；鼠IgG3的上绞链区的PKPSTPPGSS；SGGTSGSTSGTGST，AGSSTGSSTGPGSTT或GGSGGAP。
9.权利要求1的构建体，其中组分X通过共价键与apo-A的N-末端或C-末端氨基酸相连接。
10.权利要求1的构建体，其中apo-A组分和X通过两个共价键相连接。
11.权利要求1的构建体，其中apo-A组分和X通过C或N末端二硫键，优选半胱氨酸桥相连接。
12.权利要求1的构建体，其中蛋白质或肽含有至少一种哺乳动物蛋白质。
13.根据权利要求12的构建体，其中哺乳动物蛋白质是人蛋白质。
14.根据权利要求12的构建体，其中蛋白质是非-免疫原性的。
15.根据权利要求12的构建体，其中蛋白质含有至少一种选自下列的蛋白质白蛋白，更优选为血清白蛋白，纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶片段，或另一种经改造后、因催化三联体被破坏而失活的丝氨酸蛋白酶，以及免疫球蛋白重链的恒定区。
16.根据权利要求12的构建体，其中蛋白质含有至少一个含载脂蛋白的两亲性螺旋。
17.根据权利要求1的构建体，其中组分X含有至少一种载脂蛋白A-I，载脂蛋白A-II，载脂蛋白A-IV，载脂蛋白E，其类似物或变体。
18.权利要求1和/或权利要求16的构建体，其中类似物或变体能引发与载脂蛋白A-I，A-II，或A-IV基本上相同的生理学反应。
19.权利要求1的构建体，其中构成组分X的氨基酸是半胱氨酸残基。
20.权利要求19的构建体，其中半胱氨酸残基与apo-A组分的N-末端或C-末端相连接。
21.权利要求12的构建体，其中构成组分X的肽含有1个以上氨基酸，例如2个以上氨基酸，例如5个以上氨基酸，例如10个以上氨基酸，例如15个以上氨基酸，例如20个以上氨基酸，例如30个以上氨基酸，例如40个以上氨基酸，例如50个以上氨基酸，例如75个以上氨基酸，例如100个以上氨基酸，例如200个以上氨基酸，例如300个以上氨基酸，例如400个以上氨基酸，例如500个以上氨基酸，例如600个以上氨基酸，例如700个以上氨基酸，例如800个以上氨基酸，例如900个以上氨基酸，例如1000，1250，1500，2000或2500个以上氨基酸。
22.权利要求1的构建体，其中寡聚化组件是二聚化组件。
23.权利要求1的构建体，其中寡聚化组件是三聚化组件。
24.权利要求1的构建体，其中寡聚化组件是四聚化组件。
25.权利要求1的构建体，其中寡聚化组件是多聚化组件。
26.权利要求1的构建体，其中寡聚化组件具有非-肽性质。
27.权利要求23的构建体，其中三聚化组件含有能介导链间识别、三聚化和三个多肽链的排列的氨基酸序列。
28.权利要求23的构建体，其中三聚化组件得自四连接素。
29.权利要求23的构建体，其中三聚化组件含有得自四连接素的四连接素三聚化组件。
30.权利要求29的构建体，其中四连接素三聚化组件能与其它四连接素三聚化组件形成稳定的复合物。
31.权利要求30的构建体，其中稳定的复合物包括卷曲螺旋结构。
32.权利要求31的构建体，其中卷曲螺旋结构是三股卷曲螺旋型α螺旋。
33.权利要求27至32的构建体，其中三聚化组件含有两个通过间隔区组成成分相连接的四连接素三聚化组件，使这两个四连接素三聚化组件都能参与与不属于载脂蛋白构建体组成部分的第三个四连接素三聚化组件形成复合物。
34.权利要求28至33的构建体，其中至少一个四连接素三聚化组件选自人四连接素，鼠四连接素或人、牛或鲨鱼软骨的C-型凝集素。
35.权利要求28至34的构建体，其中四连接素三聚化组件含有与SEQID NO 12的共有序列具有至少68％同一性的序列。
36.权利要求35的构建体，其中与共有序列的序列同一性为至少75％，如至少81％，如至少87％，如至少92％。
37.权利要求35的构建体，其中第50位的半胱氨酸残基被丝氨酸残基、苏氨酸残基或甲硫氨酸残基取代。
38.权利要求35的构建体，其中第50位的半胱氨酸残基被任何其它氨基酸残基取代。
39.权利要求35的构建体，其中三聚化组件与Trip A组件(SEQ ID NO 13)具有至少68％的序列同一性，优选为至少75％，如至少81％，如至少87％，如至少92％。
40.权利要求23的构建体，含有得自集合素颈区的三聚化组件。
41.权利要求1的构建体，其中纯化载脂蛋白构建体之后存在寡聚化组件。
42.权利要求1的构建体，其进一步含有至少一种糖类组成成分。
43.权利要求1的构建体，其进一步含有亲和标记物。
44.权利要求43的构建体，其含有聚组氨酸亲和标记物。
45.权利要求43的构建体，其含有选自抗原性标记物，GST标记物的亲和标记物。
46.权利要求1的构建体，其半寿期至少是天然Apo A-I，A-II或A-IV的半寿期，优选至少高2倍，更优选至少高3倍，如4倍，更优选至少高5倍，如6倍，更优选至少高8倍，如至少高10倍。
47.权利要求1的构建体，与天然Apo A-I，A-II或A-IV相比，它具有更高的胆固醇结合亲和力。
48.权利要求1的构建体，它能结合选自下列的受体cubilin、B类1型清除受体(SR-B1)、ATP-结合盒1(ABC1)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、磷脂转移蛋白(PLTP)。
49.权利要求1的构建体，它在人体内基本上不导致免疫反应。
50.权利要求1的构建体，其中核酸序列含有DNA，RNA，PNA或LNA序列。
51.根据权利要求1的构建体，其具有与序列SEQ ID NO 2至SEQ ID NO11或SEQ ID NO 14之一享有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
52.根据权利要求1的构建体，其具有与序列SEQ ID NO 3至SEQ ID NO11或SEQ ID NO 14之一享有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
53.具有下列通式的载脂蛋白构建体-apo A-X，-其中apo A是选自载脂蛋白AI，载脂蛋白AII，载脂蛋白AIV，其类似物或变体的载脂蛋白组分，-X是选自寡聚化组件和末端被连接的载脂蛋白的异源组成成分。
54.权利要求53的构建体，其在apo-A组分和X之间进一步含有间隔肽。
55.权利要求54的构建体，其中间隔肽含有至少2个氨基酸，如至少3个氨基酸，如至少5个氨基酸，如至少10个氨基酸，如至少15个氨基酸，如至少20个氨基酸，如至少30个氨基酸，如至少40个氨基酸，如至少50个氨基酸，如至少60个氨基酸，如至少70个氨基酸，如至少80个氨基酸，如至少90个氨基酸，如约100个氨基酸。
56.根据权利要求54的构建体，其中间隔区可通过共价键与apo-A组分和X连接。
57.根据权利要求54的构建体，其中间隔区实质上是非-免疫原性的，和/或不易于被蛋白酶裂解，和/或不含任何半胱氨酸残基。
58.根据权利要求54的构建体，其中间隔区的三维结构是线性的或基本上为线性的。
59.根据权利要求54的构建体，其中间隔肽含有四连接素的氨基酸序列GTKVHMK；人纤连蛋白连接链3的氨基酸序列PGTSGQQPSVGQQ和GTSGQ；鼠IgG3的上绞链区的PKPSTPPGSS；SGGTSGSTSGTGST，AGSSTGSSTGPGSTT或GGSGGAP。
60.根据权利要求53的构建体，其中组分X含有至少一个含载脂蛋白的两亲性螺旋。
61.根据权利要求53的构建体，其中载脂蛋白含有至少一种载脂蛋白A-I，载脂蛋白A-II，载脂蛋白A-IV，载脂蛋白E，其类似物或变体。
62.权利要求53或权利要求61的构建体，其中类似物或变体能引发与载脂蛋白A-I，A-II，或A-IV基本上相同的生理学反应。
63.权利要求53的构建体，其中寡聚化组件是二聚化组件。
64.权利要求53的构建体，其中寡聚化组件是三聚化组件。
65.权利要求53的构建体，其中寡聚化组件是四聚化组件。
66.权利要求53的构建体，其中寡聚化组件是多聚化组件。
67.权利要求53的构建体，其中寡聚化组件具有非-肽性质，例如是含有DNA，RNA，PNA或LNA序列的核酸序列。
68.权利要求64的构建体，其中三聚化组件含有能介导链间识别、三聚化和三个多肽链的排列的氨基酸序列。
69.权利要求64的构建体，其中三聚化组件得自四连接素。
70.权利要求64的构建体，其中三聚化组件含有得自四连接素的四连接素三聚化组件。
71.权利要求70的构建体，其中四连接素三聚化组件能与其它四连接素三聚化组件形成稳定的复合物。
72.权利要求71的构建体，其中稳定的复合物包括卷曲螺旋结构。
73.权利要求72的构建体，其中卷曲螺旋结构是三股卷曲螺旋型α螺旋。
74.权利要求69至73的构建体，其中三聚化组件含有两个通过间隔区组成成分相连接的四连接素三聚化组件，使这两个四连接素三聚化组件都能参与与不属于载脂蛋白构建体组成部分的第三个四连接素三聚化组件形成复合物。
75.权利要求69至74的构建体，其中至少一个四连接素三聚化组件选自人四连接素，鼠四连接素或人、牛或鲨鱼软骨的C-型凝集素。
76.权利要求69至75的构建体，其中四连接素三聚化组件含有与SEQID NO 12序列至少68％同一性的序列。
77.权利要求76的构建体，其中序列同一性至少为75％，如至少81％，如至少87％，如至少92％。
78.权利要求76的构建体，其中第50位的半胱氨酸残基被丝氨酸残基、苏氨酸残基或甲硫氨酸残基取代。
79.权利要求76的构建体，其中第50位的半胱氨酸残基被任何其它氨基酸残基取代。
80.权利要求76的构建体，其中三聚化组件与Trip A组件(SEQ ID NO 13)具有至少68％的序列同一性，优选为至少75％，如至少81％，如至少87％，如至少92％。
81.权利要求64的构建体，含有得自集合素颈区的三聚化组件。
82.权利要求53的构建体，其进一步含有至少一种糖类组成成分。
83.权利要求53的构建体，其进一步含有选自聚组氨酸亲和标记物的亲和标记物，选自抗原性标记物，GST标记物的亲和标记物。
84.根据权利要求53的构建体，其具有与序列SEQ ID NO 3至SEQ IDNO 11或SEQ ID NO 14之一享有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
85.核酸序列，其含有编码权利要求1至84所限定的载脂蛋白构建体的核苷酸序列。
86.根据权利要求85的核酸，其编码与序列SEQ ID NO 2至SEQ ID NO11或SEQ ID NO 14之一、优选与序列SEQ ID NO 3至SEQ ID NO 11或SEQ IDNO 14之一享有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
87.权利要求85的核酸，其中编码序列与用于表达蛋白质构建体的调节序列可操作相连。
88.含有权利要求85或87之核酸的载体。
89.转化的宿主细胞，其含有权利要求85或87所限定的核酸序列。
90.生产权利要求1至84所限定的载脂蛋白构建体的方法，其包括步骤-在能促进根据权利要求1至84的蛋白质构建体表达的条件下培养经转化的宿主细胞，-获得并回收所述蛋白质构建体，-任选进一步加工所述蛋白质构建体。
91.生产权利要求1至84所限定的载脂蛋白构建体的方法，其包括步骤-化学合成至少一种寡聚化组件，随后，-将所述组件与至少一种载脂蛋白，载脂蛋白类似物或载脂蛋白变体相连接，-获得载脂蛋白构建体，-分离所得的载脂蛋白构建体，-任选进一步加工所述构建体。
92.生产权利要求1至84所限定的载脂蛋白构建体的方法，其包括步骤-在能促进由核酸片段编码的载脂蛋白或载脂蛋白类似物或载脂蛋白变体表达的条件下培养经转化的宿主细胞，随后，-将所述载脂蛋白或载脂蛋白类似物或载脂蛋白变体与异源组成成分共价连接，-获得载脂蛋白构建体，-分离所得的载脂蛋白构建体，-任选进一步加工所述构建体。
93.生产权利要求1至84所限定的载脂蛋白构建体的方法，其包括步骤-在能促进由核酸片段编码的寡聚化组件表达的条件下培养经转化的宿主细胞，随后，-将所述组件与至少一种载脂蛋白，载脂蛋白类似物或载脂蛋白变体共价连接，-获得载脂蛋白构建体，-分离所得的载脂蛋白构建体，-任选进一步加工所述构建体。
94.权利要求1至50所限定的载脂蛋白构建体在制备药物组合物中的用途。
95.权利要求94的用途，其中药物组合物还含有药物可接受的赋形剂，佐剂，添加剂，如磷脂，胆固醇或甘油三酯。
96.权利要求94或95的用途，其中可通过以下方式施用药物组合物静脉内、动脉内、肌内、经皮、经肺、皮下、皮内、鞘内、经颊-、肛门-、阴道-、结膜-、或鼻内组织、或通过接种进入组织，如肿瘤组织，或通过植入，或口服。
97.权利要求94的用途，包括给个体每周施用含有至少50mg载脂蛋白构建体的组合物，优选至少100mg/周，例如至少250mg/周，例如至少500mg/周，例如至少750mg/周，例如至少1000mg/周，例如至少1250mg/周，例如至少1500mg/周，例如至少2000mg/周，例如至少2500mg/周，例如至少5000mg/周。
98.权利要求94的用途，包括在1，2，3，4，5，6，7，8或多达10天内进行给药。
99.权利要求94的用途，包括给药至少10mg/kg体重，例如至少20mg/kg体重，例如至少30mg/kg，例如至少40mg/kg，例如至少50mg/kg，例如至少60mg/kg，例如至少70mg/kg，例如至少75mg/kg，例如至少90mg/kg，例如至少100mg/kg，例如至少125mg/kg，例如至少150mg/kg，例如至少200mg/kg，例如至少250mg/kg，例如至少300mg/kg，例如至少400mg/kg，例如至少500mg/kg，例如至少600mg/kg，例如至少700mg/kg，例如至少800mg/kg，例如至少900mg/kg，例如至少1000mg/kg。
100.权利要求94的用途，包括一周施用一剂药物组合物一次。
101.权利要求94的用途，包括两周，三周或四周施用一剂药物组合物一次。
102.权利要求94的用途，用于治疗和/或预防动脉硬化。
103.权利要求94的用途，用于除去内毒素。
104.权利要求94的用途，用于治疗括心绞痛。
105.权利要求94的用途，用于治疗心肌梗塞。
106.权利要求94的用途，用于治疗斑点性心绞痛。
107.权利要求94的用途，用于治疗不稳定性心绞痛。
108.权利要求94的用途，用于治疗如跛行、颈动脉狭窄或脑动脉狭窄等动脉狭窄。
109.权利要求85至87所限定的核酸序列用于基因治疗的用途，其中使用编码所述载脂蛋白构建体的DNA序列转染或感染至少一个细胞群体。
110.权利要求109的用途，其中至少一个细胞群体包括巨噬细胞。
111.权利要求109的用途，其中至少一个细胞群体包括肝细胞。
全文摘要
本发明涉及载脂蛋白构建体，用作药物的载脂蛋白构建体，编码载脂蛋白构建体的核酸序列，含有该核酸序列的载体，产生所述载脂蛋白构建体的方法，所述载脂蛋白构建体用于制备药物组合物的用途。所提供的数据证实了本发明的构建体能结合脂质，能结合Apo AI强受体cubilin，结合的强度大于天然的Apo A－I，构建体的血浆半寿期至少为天然ApoA－I的三倍。这些数据总体证实本发明的构建体是治疗心血管病的重要候选药物。
文档编号A61K48/00GK1486327SQ01821850
公开日2004年3月31日 申请日期2001年11月9日 优先权日2000年11月10日
发明者乔纳斯·格雷弗森, 乔纳斯 格雷弗森, 索伦·莫斯特鲁普, 莫斯特鲁普 申请人:普罗蒂奥制药公司